用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法及呕吐毒素浓度的检测方法

摘要

本发明公开一种用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法及呕吐毒素浓度的检测方法，包括以下制备步骤：将硝酸锌、普鲁士蓝和2‑甲基咪唑混合均匀，离心后过滤，获得第一沉淀物，将所述第一沉淀物和Tris‑HCl缓冲溶液混合，再加入盐酸多巴胺溶液，搅拌均匀，离心后过滤，获得第二沉淀，将所述第二沉淀分散在磷酸缓冲液中，获得PB@ZIF‑8/PDA溶液；将1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺加入IgG中，混合均匀，获得活化IgG；将所述活化IgG加入所述PB@ZIF‑8/PDA溶液中，孵育振摇离心后过滤，获得第三沉淀，洗涤所述第三沉淀，获得PB@ZIF‑8/PDA/IgG信号探针。本发明提供的制备方法制备的检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针能简易、快速、稳定的检测出呕吐毒素浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及呕吐毒素检测技术领域，具体涉及一种用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法及呕吐毒素浓度的检测方法。

背景技术

呕吐毒素(DON)是由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生的代谢产物，其化学性质稳定，具有耐热、耐压、耐酸、耐储存等稳定性能，在加工过程中很难被破坏，一直是粮食生产加工过程中的重要隐患，被国际癌症研究机构列为第3类致癌物。DON广泛存在于食品和环境中，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物，人和动物在误食被DON污染的食物后会产生广泛的毒性效应。DON可在粮食的生长、收获、储运、加工、流通等环节中发生污染，对食品安全及人体健康构成巨大威胁。为保障食品安全、维护消费者权益，准确检测粮食中DON含量对确定DON污染程度至关重要。因此，亟需开发一种低成本、高灵敏、准确快速的DON检测方法。

DON的传统检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法、免疫亲和柱净化-高效液相色谱法等。这些方法都存在样品前期处理复杂、设备昂贵、检测程序复杂、需要专业的检测人员等缺陷，不适合大批量样品的检测，难以满足基层监管过程中快速出检测结果的需求，不便推广应用。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法及呕吐毒素浓度的检测方法，旨在提供一种用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针，能够简易、快速、稳定的检测出呕吐毒素的浓度。

为实现上述目的，本发明提出一种用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法，包括以下制备步骤：

将硝酸锌、普鲁士蓝和2-甲基咪唑混合均匀，离心后过滤，获得第一沉淀物，将所述第一沉淀物和Tris-HCl缓冲溶液混合，再加入盐酸多巴胺溶液，搅拌均匀，离心后过滤，获得第二沉淀，将所述第二沉淀分散在磷酸缓冲液中，获得PB@ZIF-8/PDA溶液；

将1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入IgG中，混合均匀，获得活化IgG；

将所述活化IgG加入所述PB@ZIF-8/PDA溶液中，孵育振摇离心后过滤，获得第三沉淀，洗涤所述第三沉淀，获得PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针；

打磨清洗电极，再用保护气体干燥电极，获得洁净电极；

在所述洁净电极上依次滴加3,3’-二硫化物和呕吐毒素-牛血清白蛋白至所述洁净电极上，获得修饰电极，将所述修饰电极置于BSA溶液中，孵育后获得DON-BSA/DTSSP/Au电极；

将呕吐毒素抗体和含有不同浓度梯度的呕吐毒素抗原混合液修饰在DON-BSA/DTSSP/Au电极上，再滴加所述PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针，获得用于检测呕吐毒素的复合型电化学探针。

可选地，将硝酸锌、普鲁士蓝和2-甲基咪唑混合均匀，离心后过滤，获得第一沉淀物，将所述第一沉淀物和Tris-HCl缓冲溶液混合，再加入盐酸多巴胺溶液，搅拌均匀，离心后过滤，获得第二沉淀，将所述第二沉淀分散在磷酸缓冲液中，获得PB@ZIF-8/PDA溶液的步骤中，

所述硝酸锌、所述普鲁士蓝和所述2-甲基咪唑的体积比为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；和/或，

所述Tris-HCl缓冲溶液和所述盐酸多巴胺溶液的体积比为1:(0.8～1.2)；和/或，

所述硝酸锌的浓度为0.1～0.3mol/L；和/或，

所述普鲁士蓝的浓度为1.5～2.5mmol/L；和/或，

所述2-甲基咪唑的浓度为0.3～0.5mol/L；和/或，

所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20～25mmol/L；和/或，

所述盐酸多巴胺溶液的浓度为0.3～0.5mg/mL。

可选地，将1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入IgG中，混合均匀，获得活化IgG的步骤中，

所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺和所述IgG的体积比为1：(0.8～1.2)：(20～30)；和/或，

所述1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.1～0.3mmol/L；和/或，

所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.2～0.5mmol/L；和/或，

所述IgG的浓度为0.3～0.5mg/mL。

可选地，将所述活化IgG加入所述PB@ZIF-8/PDA溶液中，孵育振摇离心后过滤，获得第三沉淀，洗涤所述第三沉淀，获得PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针的步骤包括：

将所述活化IgG加入所述PB@ZIF-8/PDA溶液中，孵育30～40min，再在2～5℃的条件下，振摇8～12h，离心后获得第三沉淀，用磷酸缓冲液洗涤所述第三沉淀2～3次，再加入牛血清白蛋白，在35～37℃的条件下孵育0.8～1.2h，获得第四沉淀，再用磷酸缓冲液清洗所述第四沉淀2～3次后，将所述第四沉淀分散在磷酸缓冲液中。

可选地，所述牛血清白蛋白的浓度为1.0～1.2％；和/或，

所述磷酸缓冲液的浓度为8～10mmol/L；和/或，

所述磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.5。

可选地，清洗电极，再用保护气体干燥电极，获得洁净电极的步骤包括：

将电极在氧化铝粉末中打磨，依次用去离子水、无水乙醇、去离子水清洗5～10min，再用过氧化氢和浓硫酸的混合液清洗2～3次，获得中间产物电极，将所述中间产物电机置于硫酸溶液中，依次通过恒电位和CV处理，取出清洗后置于惰性环境下干燥处理，获得洁净电极。

可选地，所述氧化铝粉末的直径为0.3μm和/或0.5μm；和/或，

在所述混合液中，所述过氧化氢与所述浓硫酸的体积比为1：(2.5～3.5)；和/或，

所述硫酸溶液的浓度为0.3～0.5mol/L；和/或，

所述保护气体包括氮气。

可选地，在所述洁净电极上依次滴加3,3’-二硫化物和呕吐毒素-牛血清白蛋白至所述洁净电极上，获得修饰电极，将所述修饰电极置于BSA溶液中，孵育后获得DON-BSA/DTSSP/Au电极的步骤包括：

滴加3,3’-二硫化物至所述洁净电极的表面，25～30℃的条件下孵育0.5～1.5h，用PBST溶液清洗所述洁净电极表面，再滴加呕吐毒素-牛血清白蛋白至所述洁净电极的表面，在35～37℃的条件下孵育1.5～2.5h，用PBST溶液清洗所述洁净电极的表面，获得修饰电极，将所述修饰电极置于BSA溶液中，孵育0.5～1.5h，获得DON-BSA/DTSSP/Au电极。

可选地，所述3,3’-二硫化物和所述呕吐毒素-牛血清白蛋白的体积比为1：(0.8～1.2)；和/或，

所述3,3’-二硫化物的浓度为1～3mmol/L；和/或，

所述呕吐毒素-牛血清白蛋白的浓度为3～5μg/mL；和/或，

所述BSA溶液的浓度为1～2％；和/或，

所述DON抗体的浓度为4～5μg/mL。

此外，本发明还提出了一种呕吐毒素浓度的检测方法，包括以下检测步骤：

获得工作电极、参考电极和辅助电极，所述工作电极包括用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针；

将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得标准浓度-电流曲线；

将待检测样品修饰在所述工作电极上，再将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得待检测样品的电流曲线，将所述待检测样品的电流曲线与所述标准浓度-电流曲线对比，获得呕吐素浓度。

本发明的技术方案中，普鲁士蓝具有高效催化活性和良好的电化学活性，可以弥补检测效率低的不足且，普鲁士蓝合成简单，成本低；在PB@ZIF-8/PDA溶液中，利用ZIF-8材料的大比表面积及高孔隙率，分别引入普鲁士蓝和盐酸多巴胺，使得ZIF-8包埋普鲁士蓝，盐酸多巴胺在PB@ZIF-8表面进一步形成聚多巴胺(PDA)以积累更多的二抗免疫球蛋白G(IgG)增强电化学信号，通过将该电化学探针进一步功能化DON抗体，运用于竞争免疫策略，实现对DON的快速、灵敏、定性检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明提供的用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法的一实施例的流程图；

图2为本发明提供的用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的原理示意图；

图3为本发明提供的呕吐毒素浓度的检测方法中的标准浓度-电流曲线。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

DON的传统检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法、免疫亲和柱净化-高效液相色谱法等。这些方法都存在样品前期处理复杂、设备昂贵、检测程序复杂、需要专业的检测人员等缺陷，不适合大批量样品的检测，难以满足基层监管过程中快速出检测结果的需求，不便推广应用。

鉴于此，本发明提供一种用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法，通过该制备方法制备出来的用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针能够快速、灵敏且稳定的检测出呕吐毒素的浓度；结合图1所示的用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法的一实施例的流程示意图，所述用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤S10、将硝酸锌、普鲁士蓝和2-甲基咪唑混合均匀，离心后过滤，获得第一沉淀物，将所述第一沉淀物和Tris-HCl缓冲溶液混合，再加入盐酸多巴胺溶液，搅拌均匀，离心后过滤，获得第二沉淀，将所述第二沉淀分散在磷酸缓冲液中，获得PB@ZIF-8/PDA溶液；

金属有机框架材料(ZIF-8)是一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料，具有独特的物理及化学特性，如结构丰富、比表面积大、孔隙率高、金属位点多、催化能力强、生物相容性好、良好的化学和热稳定性等，因此，在本实施例中，采用ZIF-8材料构建电化学传感器，分别引入普鲁士蓝和盐酸多巴胺，利用ZIF-8材料包埋普鲁士蓝，同时盐酸多巴胺在其表面进一步地形成聚多巴胺，从而获得PB@ZIF-8/PDA溶液，由于PB@ZIF-8/PDA溶液中含有聚多巴胺，使得其在后续的制备过程中，能够累积更多的二抗免疫球蛋白G，从而能够增强化学信号，如此一来，即可提高最终制备的用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针的灵敏度。

此外，在本实施例中，采用普鲁士蓝的一个目的是其本身具有高效催化活性和良好的电化学活性，可以提高检测效率，同时普鲁士蓝本身合成简单，成本低。

进一步地，硝酸锌、普鲁士蓝、2-甲基咪唑、Tris-HCl缓冲溶液和盐酸多巴胺溶液的浓度也会对检测结果造成影响，在一些实施例中，硝酸锌的浓度为0.1～0.3mol/L；普鲁士蓝的浓度为1.5～2.5mmol/L；2-甲基咪唑的浓度为0.3～0.5mol/L；Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20～25mmol/L；盐酸多巴胺溶液的浓度为0.3～0.5mg/mL。

更进一步地，在一些实施例中，所述硝酸锌、所述普鲁士蓝和所述2-甲基咪唑的体积比为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；即每1mL的硝酸锌中需要对于添加0.8～1.2mL的普鲁士蓝和0.8～1.2mL的2-甲基咪唑；做为本实施例的一个优选实施例，硝酸锌、普鲁士蓝和2-甲基咪唑的体积比为1：1：1。

更进一步地，在一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲溶液和所述盐酸多巴胺溶液的体积比为1：(0.8～1.2)；即每1mL的Tris-HCl缓冲溶液需要对应的添加0.8～1.2mL的盐酸多巴胺溶液，作为本实施例的一个优选实施例，每每1mL的Tris-HCl缓冲溶液需要对应的添加1mL的盐酸多巴胺溶液。

在进行步骤S10时，具体可以通过以下步骤进行：将硝酸锌、普鲁士蓝和2-甲基咪唑在离心管中混合，混合液振荡后在室温下保持25～30min，获得悬浮液，将悬浮液置于2～4℃下，以离心速度8000～11000rpm离心处理5～15min，离心处理3～8次得到PB@ZIF-8沉淀物，将PB@ZIF-8沉淀物与Tris-HCl缓冲溶液混合均匀，再加入盐酸多巴胺溶液，剧烈搅拌20～30min后，在室温下轻微振摇1.5～2h，形成的悬浮液，再将悬浮液置于3～8℃下，以离心速度为8000～11000rpm离心处理5～15min，离心处理3～8次，再一次获得PB@ZIF-8沉淀物，将PB@ZIF-8沉淀物用去离子水清洗后分散在磷酸缓冲液中，得到PB@ZIF-8/PDA溶液。

需要说明的是，多次离心洗涤的目的是为了除去PB@ZIF-8沉淀物表面多余的溶剂和杂质，提高PB@ZIF-8沉淀物的纯度。

进一步地，普鲁士蓝可以通过以下步骤制备：用pH＝3的盐酸溶液配置出3～5mmol/L的FeCl

磷酸缓冲液可以通过以下步骤制备：将27.386g的K

步骤S20、将1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入IgG中，混合均匀，获得活化IgG。

在进行步骤S20时，可以通过以下步骤进行：将1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入IgG中，搅拌混匀，振荡3～4h，获得活化IgG。

步骤S20的主要目的是为了活化IgG中的羧基。

进一步地，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.1～0.3mmol/L；N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.2～0.5mmol/L；IgG的浓度为0.3～0.5mg/mL。

更进一步地，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和IgG的体积比为1：(0.8～1.2)：(20～30)；即每1mL的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中需要对应添加0.8～1.2mL的N-羟基琥珀酰亚胺和20～30mL的IgG，作为本实施例的一个优选实施例，每1mL的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中需要对应添加1mL的N-羟基琥珀酰亚胺和25mL的IgG。

步骤S30、将所述活化IgG加入所述PB@ZIF-8/PDA溶液中，孵育振摇离心后过滤，获得第三沉淀，洗涤所述第三沉淀，获得PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针。

需要说明的是，在本发明中，主要是通过间接竞争法检测呕吐毒素的浓度，即利用固相抗原与异相抗原去竞争结合一定量抗体，因此固相吸附的抗体与待测抗原的含量成反比，被广泛应用在荧光、光电和电化学传感等领域，相比其他分析技术，电化学传感具有灵敏度高、快速等优点，其与竞争型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景，电化学免疫传感器，利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、特异性强等优点，具有良好的应用前景，在本实施例中，主要是通过PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针及其间接竞争型电化学免疫传感器，并实现对呕吐毒素的高灵敏检测。

在进行步骤S30时，可以通过以下步骤进行：将所述活化IgG加入所述PB@ZIF-8/PDA溶液中，孵育30～40min，再在2～5℃的条件下，振摇8～12h，离心后获得第三沉淀，用磷酸缓冲液洗涤所述第三沉淀2～3次，再加入牛血清白蛋白，在35～37℃的条件下孵育0.8～1.2h，获得第四沉淀，再用磷酸缓冲液清洗所述第四沉淀2～3次后，将所述第四沉淀分散在磷酸缓冲液中。

进一步地，在一些实施例中，所述牛血清白蛋白的浓度为1.0～1.2％；所述磷酸缓冲液的浓度为8～10mmol/L；所述磷酸缓冲液的pH值为7.2～7.5。

步骤S40、打磨清洗电极，再用保护气体干燥电极，获得洁净电极；

在进行步骤S40时，具体可以通过以下步骤进行：将电极在砂纸、氧化铝粉末中打磨，依次用去离子水、无水乙醇、去离子水清洗5～10min，再用过氧化氢和浓硫酸的混合液清洗2～3次，获得中间产物电极，将所述中间产物电机置于硫酸溶液中，依次通过恒电位和CV处理，取出清洗后置于惰性环境下干燥处理，获得洁净电极。

在一些实施例中，所述氧化铝粉末的直径为0.3μm和/或0.5μm；在所述混合液中，所述过氧化氢与所述浓硫酸的体积比为1：(2.5～3.5)；所述硫酸溶液的浓度为0.3～0.5mol/L；所述保护气体包括氮气。

具体地，实际上，先将电极依次在砂纸、0.3μm和0.05μm直径的氧化铝粉末中打磨，再用去离子水、无水乙醇、去离子水超声交替清洗各5～10min，配置体积比为1:3的30％过氧化氢和浓硫酸混合液，滴加在电极表面，保持2～5min以去除有机残留物，再用去离子水清洗掉混合液残留物，再重复30％过氧化氢和浓硫酸混合液和去离子水清洗步骤2次；将电极置于0.5mol/LH2SO4溶液中依次通过恒电位(2V，5s；-0.3V，12s)和CV(-0.1～1.5V，6圈)处理除去未被溶解杂质；最后用大量去离子水清洗电极，并用氮气干燥表面以防止水等残留，以保持电极表面清洁。

步骤S50、在所述洁净电极上依次滴加3,3’-二硫化物和呕吐毒素-牛血清白蛋白至所述洁净电极上，获得修饰电极，将所述修饰电极置于BSA溶液中，孵育后获得DON-BSA/DTSSP/Au电极。

在进行步骤S50时，可以通过以下步骤进行：滴加3,3’-二硫化物至所述洁净电极的表面，25～30℃的条件下孵育0.5～1.5h，用PBST溶液清洗所述洁净电极表面，再滴加呕吐毒素-牛血清白蛋白至所述洁净电极的表面，在35～37℃的条件下孵育1.5～2.5h，用PBST溶液清洗所述洁净电极的表面，获得修饰电极，将所述修饰电极置于BSA溶液中，孵育0.5～1.5h，获得DON-BSA/DTSSP/Au电极。

进一步地，在一些实施例中，所述3,3’-二硫化物的浓度为1～3mmol/L；所述呕吐毒素-牛血清白蛋白的浓度为3～5μg/mL；所述BSA溶液的浓度为1～2％；所述DON抗体的浓度为4～5μg/mL。

更进一步地，述3,3’-二硫化物和所述呕吐毒素-牛血清白蛋白的体积比为1：(0.8～1.2)；即每1mL的述3,3’-二硫化物需要对应添加0.8～1.2mL的呕吐毒素-牛血清白蛋白。

需要说明年的是，加入牛血清蛋白的进行孵育的目的是为了提高最终制备的用于检测呕吐毒素的复合型电化学探针的稳定性。

PBST溶液可以通过以下步骤制备：取体积比为1:2000的Tween-20溶液与10mmol/L的pH值为7.0～7.5的PBS在室温下混合，获得PBST溶液。

步骤S60、将呕吐毒素抗体和含有不同浓度梯度的呕吐毒素抗原混合液修饰在DON-BSA/DTSSP/Au电极上，再滴加所述PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针，获得用于检测呕吐毒素的复合型电化学探针。

在进行步骤S60时，具体可以通过以下步骤进行：将呕吐毒素抗体和含有不同浓度梯度的呕吐毒素抗原混合液修饰在DON-BSA/DTSSP/Au电极上，置于35～37℃的条件下，孵育0.5～1.5h，，再用10mmol/L的PBST清洗，随后再滴加PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针到DON-BSA/DTSSP/Au电极上，并置于35～37℃的恒温箱内，孵育1.5～2.5h，获得用于检测呕吐毒素的复合型电化学探针。

在本实施例中，呕吐毒素抗体的浓度为5μg/mL；呕吐毒素标准品的浓度分别为0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL。

此外，本发明还提供了一种呕吐毒素浓度的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤S100、获得工作电极、参考电极和辅助电极，所述工作电极包括用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针；

步骤S200、将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得标准浓度-电流曲线；

步骤S300、将待检测样品修饰在所述工作电极上，再将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得待检测样品的电流曲线，将所述待检测样品的电流曲线与所述标准浓度-电流曲线对比，获得呕吐素浓度。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)制备用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针

将600μL的硝酸锌(浓度为0.1mol/L)、600μL的普鲁士蓝(浓度为1.5mol/L)和600μL的2-甲基咪唑(浓度为0.3mol/L)在离心管中混合，混合液振荡后在室温下保持30min，获得悬浮液，将悬浮液置于4℃下，以离心速度11000rpm离心处理15min，离心处理8次得到PB@ZIF-8沉淀物，将500μL的PB@ZIF-8沉淀物与1mL的Tris-HCl缓冲溶液(浓度为25mmol/L)混合均匀，再加入500μL盐酸多巴胺溶液(浓度为0.1mol/L)，剧烈搅拌20min后，在室温下轻微振摇2h，形成的悬浮液，再将悬浮液置于8℃下，以离心速度为11000rpm离心处理15min，离心处理8次，再一次获得PB@ZIF-8沉淀物，将PB@ZIF-8沉淀物用去离子水清洗后分散在1mL的磷酸缓冲液(浓度为10mmol/L,pH值为7.4)中，得到PB@ZIF-8/PDA溶液；

将1μL的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(浓度为0.2mmol/L)和1μL的N-羟基琥珀酰亚胺(浓度为0.4mmol/L)加入25μL的IgG(浓度为0.5mg/mL)中，搅拌混匀，振荡3～4h，获得活化IgG。

将所述活化IgG加入所述PB@ZIF-8/PDA溶液中，孵育30min，再在4℃的条件下，振摇10h，离心后获得第三沉淀，用磷酸缓冲液(浓度为10mmol/L，pH值为7.4)洗涤所述第三沉淀3次，再加入1.0％的牛血清白蛋白，在37℃的条件下孵育1h，获得第四沉淀，再用磷酸缓冲液(浓度为10mmol/L，pH值为7.4)清洗所述第四沉淀3次后，将所述第四沉淀分散在磷酸缓冲液(浓度为10mmol/L，pH值为7.4)中；

先将电极依次在砂纸、0.3μm和0.05μm直径的氧化铝粉末中打磨，再用去离子水、无水乙醇、去离子水超声交替清洗各5min，配置体积比为1:3的30％过氧化氢和浓硫酸混合液，滴加在电极表面，保持2min以去除有机残留物，再用去离子水清洗掉混合液残留物，再重复30％过氧化氢和浓硫酸混合液和去离子水清洗步骤2次；将电极置于0.5mol/L H

滴加5μL的3,3’-二硫化物(浓度为2mmol/L)至所述洁净电极的表面，25℃的条件下孵育1h，用PBST溶液(浓度为10mmol/L)清洗所述洁净电极表面，再滴加5μL的呕吐毒素-牛血清白蛋白(5μg/mL)至所述洁净电极的表面，在37℃的条件下孵育2h，用PBST溶液(浓度为10mmol/L)清洗所述洁净电极的表面，获得修饰电极，将所述修饰电极置于BSA溶液中，孵育0.1h，获得DON-BSA/DTSSP/Au电极；

将呕吐毒素抗体和含有不同浓度梯度的呕吐毒素抗原混合液修饰在DON-BSA/DTSSP/Au电极上，置于37℃的条件下，孵育01h，再用10mmol/L的PBST清洗，随后再滴加PB@ZIF-8/PDA/IgG信号探针到DON-BSA/DTSSP/Au电极上，并置于37℃的恒温箱内，孵育2h，获得用于检测呕吐毒素的复合型电化学探针。

获得工作电极、参考电极和辅助电极，所述工作电极包括用于检测呕吐毒素浓度的复合型电化学探针；

(2)将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得标准浓度-电流曲线；

(3)将市售加标米粉修饰在所述工作电极上，再将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得市售加标米粉的电流曲线，将所述待检测样品的电流曲线与所述标准浓度-电流曲线对比，获得呕吐素浓度。

检测结果如表1所示。

表1市售加标米粉检测结果

其中，mean

实施例2

(1)与步骤1的制备方法一致；

(2)将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得标准浓度-电流曲线；

(3)将市售加标面粉修饰在所述工作电极上，再将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得待检测样品的电流曲线，将所述待检测样品的电流曲线与所述标准浓度-电流曲线对比，获得呕吐素浓度。

检测结果如表2所示。

表2市售加标面粉检测结果

其中，mean

实施例3

(1)与步骤1的制备方法一致；

(2)将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得标准浓度-电流曲线；

(3)将市售玉米淀粉修饰在所述工作电极上，再将所述工作电极、所述参考电极和所述辅助电极置于PBS缓冲液中，通过差分脉冲伏安法获得市售玉米淀粉的电流曲线，将所述待检测样品的电流曲线与所述标准浓度-电流曲线对比，获得呕吐素浓度。

检测结果如表3所示。

表3市售玉米淀粉检测结果

其中，mean

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。