基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的分类模型及其建立方法、检测装置

摘要

本发明为基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的分类模型及其建立方法、检测装置。基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的分类模型的建立方法，包括：(1)采集健康羊和患病羊的血液，提取血清，得血清样本；(2)对血清样本采用激光拉曼光谱仪进行检测，得拉曼光谱数据；(3)对拉曼光谱数据进行降噪、基线校正和归一化等处理，得预处理后的光谱数据；(4)对处理后的光谱数据进行主成分分析(PCA)降维后，建立线性判别分析(LDA)或支持向量机(SVM)分类模型，得羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的分类模型。本发明基于机器学习算法、拉曼光谱，建立的分类模型和检测装置，在筛查感染细粒棘球蚴病羊、感染布氏杆菌病羊方面具有潜力。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病分类模型及其建立方法、检测装置。

背景技术

细粒棘球蚴病亦称包虫病，是由棘球绦虫的幼虫寄生于偶蹄类动物或人所引起人兽共患寄生虫病。羊是棘球绦虫主要的中间宿主，对羊细粒棘球蚴病提前进行有效的防控措施，对于阻断包虫病的传播和发展具有重大的意义。据《防治包虫病行动计划(2010—2015)》资料显示,我国每年患病家畜在5000万头以上,造成的直接经济损失逾30亿元。目前病原学法、免疫学法和超声技术是羊细粒棘球蚴病主要的诊断方法，其分别存在细粒棘球蚴病病原物分离培养困难、产品批次间难以标准化与交叉反应，以及在影像超声检测前，需要剔除检测部位的羊毛，两名工作人员固定住羊的身体，影像超声医师才能进行检查、检测设备昂贵等缺点。

布氏杆菌病(简称布病)是世界上流行最广、危害最严重的人畜共患传染病之一，严重影响家畜养殖的健康发展和国家公共卫生安全和食品安全。我国人畜间布氏杆菌病的高发区域主要有内蒙古、青海、新疆、西藏等农牧区。健康动物主要通过接触病畜的分泌物和流产胎儿等感染，家畜感染布鲁氏菌后对繁殖和生产性能造成严重危害，头胎流产率高达50-80％，导致奶量和肉产量减产15-20％。与受感染动物的接触以及食用污染动物的奶和肉是人感染布鲁氏杆菌的主要传播途径。目前羊布病主要的诊断方法有细菌学、血清学和分子生物学等。布鲁氏菌的分离与培养是布病诊断的金标准，但是存在费时、培养条件困难、检出率较低、实验室操作存在潜在感染等缺点，而分子生物学检测则需要昂贵的诊断相关专业设备、试剂和具有高等级生物安全实验室等问题。血清学作为羊布病筛查最常用的检测方法，仍有检测“窗口期”、产品批次间难以标准化以及交叉反应等诸多不足。

有鉴于此，本发明提出一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病分类模型及其建立方法、检测装置。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病分类模型的建立方法，基于机器学习算法，结合拉曼光谱数据，对一次性实现筛查感染细粒棘球蚴病的羊和感染布氏杆菌病的羊具有很大的应用潜力。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病分类模型的建立方法，包括以下步骤：

(1)采集健康羊和患病羊的新鲜血液，静置后离心，提取血清，获得血清样本；

(2)对所述的血清样本采用激光拉曼光谱仪进行检测，获得拉曼光谱数据；

(3)对所述的拉曼光谱数据进行降噪、基线校正和归一化等预处理，获得预处理后的光谱数据；

(4)对所述的预处理后的光谱数据选择有意义的光谱范围(400-1800cm

进一步的，所述的步骤(1)中，患病羊为细粒棘球蚴病羊和/或布氏杆菌病羊。

再进一步的，健康羊的血清样本至少采集244例；

所述的患病羊为细粒棘球蚴病羊，患病羊的血清样本至少采集231例；

所述的患病羊为布氏杆菌病羊，患病羊的血清样本至少采集106例。

进一步的，所述的步骤(2)中，检测积分时间为3秒，分辨率为6cm

进一步的，所述的步骤(4)中，采用主成分分析法在建模光谱范围内对于预处理后的数据进行降维。

再进一步的，所述的建模光谱范围为400-1800cm

进一步的，所述的步骤(4)中，建立SVM分类模型。

本发明的一个目的在于提供一种羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的分类模型，采用上述的建立方法得到，在用于筛查感染细粒棘球蚴病的羊和感染布氏杆菌病的羊具有应用潜力。

本发明还有一个目的在于提供基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的检测装置，可用于羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的筛查，可以一次性实现感染细粒棘球蚴病的羊和感染布氏杆菌病的羊的分类筛查。

一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病检测装置，包括：激光器、拉曼光谱仪、计算分析系统；

所述的激光拉曼光谱仪对每个样进行扫描，用于获取血清拉曼光谱数据，并把所得血清拉曼谱数据传送至所述计算分析系统；

所述计算分析系统接受激光拉曼光谱仪所采集的血清拉曼光谱数据，并对数据进行降噪、基线校正和归一化的预处理；

所述计算分析系统对已预处理后的血清拉曼光谱数据采用主成分分析法(PCA)进行降维后，取累计方差贡献率最大并且有统计学差异的主成分输入至支持向量机(SVM)和线性判别分析(LDA)算法中，建立分类模型，并将所有样本随机分成训练集和测试集，最终输出感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病的羊和健康羊的分类结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首次将血清拉曼光谱技术在检测感染细粒棘球蚴病的羊和感染布氏杆菌病的羊中进行应用。目前，羊细粒棘球蚴病的诊断，主要采用影像(超声和CT等)和血清免疫学等技术。影像技术需要配备昂贵的B超仪、CT扫描仪和专业的影像学技师，诊断流程也较为繁琐，其诊断结果是需要专业的影像学医师的判定。影像超声检测前，还需要剔除检测部位的羊毛，以及两名工作人员固定住羊的身体，影像超声医师才能检测。虽然采集羊血清较为容易，但羊细粒棘球蚴病血清免疫学检测试剂盒存在检测时间长、产品批次间难以标准化与交叉反应等缺点。而用于羊布氏杆菌病的主要诊断技术有：细菌学检测、血清学检测以及分子学检查。细菌分离培养是目前诊断布氏杆菌病的金标准方法，但缺点是细菌培养周期长，并且在鉴定生长细菌期间有潜在的实验室获得性布鲁氏菌病风险。虽然血清学检测虎红平板凝集试验(RBPT)具有使用速度快、价格低的优点，但是患病初期未产生抗体时，导致出现“窗口期”，同时容易受其他细菌交叉反应的影响，给出假阳性反应的结果。血清凝集试验(SAT)多用于疾病急性期几周或几个月的回顾性诊断，疾病早期SAT滴度无显著变化时会出现假阴性结果，故检测效能依赖于SAT滴度。ELISA具有灵敏度高、操作时间短的优点，但也有试剂尚未标准化、交叉反应易造成假阳性结果等缺点。此外，在牧区羊群中存在羊细粒棘球蚴病和布氏杆菌病同时患病的情况，但目前并没有能够一次区分羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的综合诊断技术，导致了牧区养殖业的经济损失和对人类健康带来危害。

本次发明技术具有快速、操作简便和准确等优点，能以满足目前羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的常规诊断技术上所存在的不足，并对一次性实现羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的区分具有较大的应用潜力。

附图说明

图1为诊断为细粒棘球蚴病羊的肝脏B超检查结果；

图2为需要检测布氏杆菌病羊群采集的血清通过羊布氏杆菌虎红平板凝集试验以及羊布氏杆菌病试管凝集试验进行诊断示意图；

图3为实验采用的基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病检测装置；

图4为对于所采集的羊血清拉曼光谱数据进行去噪、基线校正和归一化等预处理过程图；

图5为感染细粒棘球蚴病羊和健康羊血清平均化拉曼光谱图；

图6为感染细粒棘球蚴病羊和健康羊血清拉曼光谱数据中有意义的主成分得分矩阵散点图；

图7为感染布氏杆菌病羊和健康羊血清平均化拉曼光谱图；

图8为感染布氏杆菌病羊和健康羊血清拉曼光谱数据中有意义的主成分得分矩阵散点图；

图9为感染细粒棘球蚴病羊、感染布氏杆菌病羊和健康羊血清平均化拉曼光谱图；

图10为感染细粒棘球蚴病羊、感染布氏杆菌病羊和健康羊血清拉曼光谱数据中有意义的主成分得分的矩阵散点图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病分类模型及其建立方法、检测装置，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的分类模型及其建立方法、检测装置，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体的实施例，对本发明一种基于血清拉曼光谱的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病分类模型及其建立方法、检测装置做进一步的详细介绍：

本发明以血清为生物样本利用拉曼光谱技术诊断羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病，实验结果表明，本发明建立的分类模型对一次性实现筛查羊细粒棘球蚴病、羊布氏杆菌病有很大的应用潜力。

本发明的技术方案为：

(I)基于机器学习算法的羊细粒棘球蚴病血清拉曼光谱检测模型，我们首先进行感染细粒棘球蚴病的羊血清和健康羊血清检测，其详细步骤如下：

(1)采血取样：选择需要检测羊群，通过B超检查进行分类诊断，分成感染细粒棘球蚴病的羊和健康羊，然后使用10ml羊采血器(未加抗凝剂)从羊左侧颈静脉进行采集血液。

(2)血液样本处理：所采集的血液样本静置室温2-3小时，使血液完全凝固，置于离心机内以每分钟4000转速度进行离心处理，用移液管吸出已分离的血清(上层乳黄色的上清液)转置2.5ml EP管里，置于-80℃冰箱保存待用。

(3)血清拉曼光谱数据采集：实验采用感染细粒棘球蚴病的羊和健康羊血清拉曼光谱检测装置，设置检测积分时间为3秒，分辨率为6cm

(4)血清拉曼光谱数据预处理：在步骤(3)所得的光谱数据，采用MATLAB R2021a软件，对所有血清拉曼光谱数据进行降噪、基线校正和归一化等预处理，并转成xls格式提取。

(5)数据的降维处理：使用MATLAB R2021a软件，采用主成分分析法(PCA)在所选的建模光谱范围(400-1800cm

(6)诊断模型的建立并验证：按照在步骤(5)所述，分别把感染细粒棘球蚴病的羊和健康羊血清数据的主成分，随机分成训练集和验证集输入至LDA和SVM算法中，分别获取基于PCA-LDA和PCA-SVM模型的感染细粒棘球蚴病的羊和健康羊的二分类诊断结果。

(II)基于机器学习算法的羊布氏杆菌病血清拉曼光谱检测模型，我们进行感染布氏杆菌病羊和健康羊血清检测，其详细步骤如下：

(1)采血取样：选择需要检测羊群，使用10ml羊采血器(未加抗凝剂)从羊左侧颈静脉进行采集血液，然后通过进行羊布氏杆菌病虎红平板凝集试验以及羊布氏杆菌病试管凝集试验把羊群分成感染布氏杆菌病羊和健康羊。

(2)血液样本处理：所采集的血液样本静置室温2-3小时，使血液完全凝固，置于离心机内以每分钟4000转速度进行离心处理，用移液管吸出已分离的血清(上层乳黄色的上清液)转置2.5ml EP管里，置于-80℃冰箱保存待用。

(3)血清光谱数据采集：实验采用布氏杆菌病羊和健康羊血清拉曼光谱检测装置，设置检测积分时间为3秒，分辨率为6cm

(4)血清拉曼光谱数据预处理：在步骤(3)所得的光谱数据，采用MATLAB R2021a软件，对所有血清拉曼光谱数据进行降噪、基线校正和归一化等预处理，并转成xls格式提取。

(5)数据的降维处理：使用MATLAB R2021a软件，采用主成分分析法(PCA)在所选的建模光谱范围(400-1800cm

(6)诊断模型的建立并验证：按照在步骤(5)所述，把感染布氏杆菌羊和健康羊血清的数据主成分，随机分成训练集和验证集输入至LDA和SVM算法中，分别获取基于PCA-LDA和PCA-SVM模型的感染布氏杆菌羊和健康羊二分类诊断结果。

(III)基于机器学习算法的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病血清拉曼光谱的分类模型，我们进行感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病羊和健康羊血清检测，其详细步骤如下：

(1)采血取样：选择需要检测羊群，使用10ml羊采血器(未加抗凝剂)从羊左侧颈静脉进行采集血液，然后通过进行羊B超检查、羊布氏杆菌病虎红平板凝集试验以及羊布氏杆菌病试管凝集试验把羊群分成感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病羊和健康羊。

(2)血液样本处理：所采集的血液样本静置室温2-3小时，使血液完全凝固，置于离心机内以每分钟4000转速度进行离心处理，用移液管吸出已分离的血清(上层乳黄色的上清液)转置2.5ml EP管里，置于-80℃冰箱保存待用。

(3)血清光谱数据采集：实验采用感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病的羊和健康羊血清拉曼光谱检测装置，设置检测积分时间为3秒，分辨率为6cm

(4)血清拉曼光谱数据预处理：在步骤(3)所得的光谱数据，采用MATLAB R2021a软件，对所有血清拉曼光谱数据进行降噪、基线校正和归一化等预处理，并转成xls格式提取。

(5)数据的降维处理：使用MATLAB R2021a软件，采用主成分分析法(PCA)在所选的建模光谱范围(400-1800cm

(6)诊断模型的建立并验证：按照在步骤(5)所述，把感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌的羊和健康羊血清的数据主成分，随机分成训练集和验证集输入至LDA和SVM算法中，分别获取基于PCA-LDA和PCA-SVM模型的感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌羊和健康羊三分类诊断结果。

实施例1.

基于机器学习算法的羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病血清拉曼光谱的分类模型的建立，具体步骤如下：

(1)收集样本：首先通过B超检测采集诊断明确的(图1所示)细粒棘球蚴病羊血液样本231例，健康羊血液样本244例。同时采集需要检测布氏杆菌病的羊群中的羊血液样本300例。

(2)获得血清样本：所采集的血液样本静置室温2-3小时，使血液完全凝固，置于离心机内以每分钟4000转速度进行离心处理，用移液管吸出已分离的血清(上层乳黄色的上清液)转置2.5ml EP管里，从需要检测布氏杆菌病羊群采集的血清通过布氏菌病虎红平板凝集试验以及布氏菌病试管凝集试验(图2所示)，筛选出了感染布氏杆菌病羊106例和健康羊106例。

(3)血清拉曼光谱数据采集：实验采用感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病的羊和健康羊血清拉曼光谱检测装置(示意图3所示)，设置检测积分时间为3秒，分辨率为6cm

(4)血清拉曼光谱数据预处理：对拉曼光谱数据采用MATLAB R2021a软件，对所有血清拉曼光谱数据进行去噪、基线校正和归一化等处理(图4所示)。

(5)数据的降维处理：使用MATLAB R2021a软件，采用主成分分析法(PCA)在400-1800cm

(6)诊断模型的建立并验证：按照在步骤(5)所述，分别把感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病的羊和健康羊血清拉曼光谱数据的主成分，随机分成训练集和验证集输入至LDA和SVM算法中，分别获取基于PCA-LDA和PCA-SVM模型的血清拉曼光谱的感染细粒棘球蚴病的羊和健康羊、感染布氏杆菌病的羊和健康羊、感染细粒棘球蚴病的羊及感染布氏杆菌病的羊和健康羊共三个分类诊断模型及诊断结果。其具体结果如下：

感染细粒棘球蚴病的羊和健康羊的分类结果：把两组血清样本随机分成训练集和验证集，在400-1800cm

表1

感染布氏杆菌病的羊和健康羊的分类结果：把两组血清样本随机分成训练集和验证集，在400-1800cm

表2

感染细粒棘球蚴病的羊、感染布氏杆菌病的羊和健康羊的分类结果：把所有血清样本随机分成训练集和验证集，在400-1800cm

表3

本发明首次将血清拉曼光谱技术在检测羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病中进行应用。本发明基于机器学习算法，结合拉曼光谱，设计了一种基于机器学习算法结合血清拉曼光谱数据的用于羊细粒棘球蚴病和羊布氏杆菌病的PCA-LDA和PCA-SVM分类模型。使用验证集准确率作为评估依据，实验结果表明PCA-LDA和PCA-SVM模型在筛查诊断感染细粒棘球蚴病的羊和感染布氏杆菌病的羊方面具有很好的检测效果，其中SVM模型的检测效果更佳。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。