一种利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定天然水体中的砷含量的方法

摘要

本发明提供了一种利用顶空单滴微萃取‑分光移液管法测定天然水体中的砷含量的方法，属于检测技术领域。本发明检测方法中采用的设备成本低，便携性好，容易操作，可以适时调整采样策略以适应任何特定环境的需要，在现场得到5min

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定天然水体中的砷含量的方法。

背景技术

砷是一种类金属元素，主要存在于土壤、空气和水中。几乎所有的生物体内均含有微量砷，砷是生物体中必需微量元素之一，微量砷有抑制氧化、促进同化的作用，摄入过量会导致中毒引发致畸致癌效应。砷在土壤、水及陆生植物中主要以亚砷酸(As(Ⅲ))、砷酸(As(V))、甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA)等砷化物形态存在，在海产品中则主要以砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)及更为复杂的砷糖等形态存在。其元素的毒性和生物有效性依赖于其化学形态，各主要砷化物毒性顺序为:As(Ⅲ)＞As(V)＞MMA＞DMA，而AsB和AsC一般认为是无毒的。

水是生命之源，近年来随着大众健康与环境意识的提高，保障水质安全显得尤为重要。因此，准确检测水体中的砷形态和各形态下砷的含量具有重要意义。

原子荧光光谱法又名氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)，该方法是将含砷的样品用KBH

但是，HG-AFS法采用的设备复杂，成本较高，不方便随身携带，不利于在野外对自然水体中各形态下砷的含量进行现场分析。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种简单、小巧、便携、低成本的，利用顶空单滴微萃取-分光移液管法(HS-SDME-SP)测定天然水体中的砷含量的方法。

本发明提供了一种测定水体中的As(III)浓度的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在容器中加入待测水体、pH值为3.50～4.50的缓冲液、还原剂，密封容器，反应生成AsH

(2)利用萃取剂对步骤(1)的体系进行顶空萃取；所述萃取剂能够与AsH

(3)利用紫外线光谱仪对步骤(2)进行顶空萃取后的萃取剂进行吸光度测试，根据吸光度与As(III)浓度的标准曲线计算得到待测水体中As(III)的浓度。

进一步地，步骤(1)中，所述缓冲液的pH值为4.30～4.50；所述缓冲液为乙酸缓冲液，所述乙酸缓冲液的浓度为0.2M～0.8M；

步骤(1)中，所述还原剂为硼氢化盐；

步骤(1)中，所述待测水体与乙酸缓冲液的体积比为1：(0.10～0.40)，所述待测水体与还原剂的体积质量比为1:(0.8～1.5)mL/mg。

进一步地，步骤(1)中，所述乙酸缓冲液的pH值为4.46；所述乙酸缓冲液的浓度为0.5M；

步骤(1)中，所述硼氢化盐为KBH

步骤(1)中，所述待测水体与乙酸缓冲液的体积比为1：0.25，所述待测水体与还原剂的体积质量比为1:(1.0～1.1)mL/mg。

进一步地，步骤(2)中，所述顶空萃取为顶空单滴微萃取；

和/或，所述具有紫外特征吸收峰的物质为Fe(o-phen)

和/或，所述萃取剂由pH值为3.50～4.50的缓冲液，Ag(I)水溶液，Fe(III)水溶液，邻菲罗啉水溶液和十二烷基硫酸盐水溶液配制而成。

进一步地，步骤(2)的操作为：将装有萃取剂的分光移液管插入步骤(1)的容器并置于待测水体的顶空位置；然后将分光移液管中的萃取剂从分光移液管中排出，在分光移液管下方形成一颗悬挂的液滴；2～6分钟后将该悬挂的液滴吸进分光移液管的紫外分光光度比色池；所述分光移液管是设置有紫外分光光度比色池的移液器；

步骤(3)的操作为：利用紫外线光谱仪对步骤(2)紫外分光光度比色池中的液体进行吸光度测试，根据吸光度与As(III)浓度的标准曲线计算得到待测水体中As(III)的浓度。

进一步地，步骤(2)所述萃取剂中，缓冲液为乙酸缓冲液，十二烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠；乙酸缓冲液的pH值为4.30～4.40，乙酸缓冲液、Ag(I)水溶液、Fe(III)水溶液、邻菲罗啉水溶液、十二烷基硫酸钠水溶液的浓度之比为0.5M：5mM：25mM：0.3M：0.3M。

进一步地，步骤(2)所述萃取剂中，乙酸缓冲液的pH值为4.37，所述乙酸缓冲液的浓度为0.5M；所述Ag(I)水溶液的浓度为5mM；所述Fe(III)水溶液浓度为25mM；所述邻菲罗啉水溶液的浓度为0.3M；所述二烷基硫酸钠的浓度为0.3M。

进一步地，步骤(2)所述萃取剂中，所述乙酸缓冲液、Ag(I)水溶液、Fe(III)水溶液、邻菲罗啉水溶液、十二烷基硫酸钠水溶液的体积之比为1:1:1:1:1。

进一步地，步骤(2)中，在分光移液管下方形成一颗悬挂的液滴4分钟后将该悬挂的液滴吸进分光移液管的紫外分光光度比色池。

进一步地，步骤(3)中，所述吸光度测试的波长为500～520nm，优选为510nm；

和/或，所述吸光度与As(III)浓度的标准曲线为：吸光度＝(0.0207×10

本发明还提供了一种测定水体中的As(III)和As(V)总浓度的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在容器中加入待测水体、浓盐酸，控制容器中液体的pH值为0.52～0.54，加入还原剂，密封容器，反应生成AsH

(b)利用萃取剂对步骤(a)的体系进行顶空萃取，萃取剂和顶空萃取的操作如如上述步骤(2)中所述；

(c)利用紫外线光谱仪对步骤(b)进行顶空萃取后的萃取剂进行吸光度测试，根据吸光度与As(III)’浓度的标准曲线计算得到待测水体中As(III)’的浓度；此时的As(III)’浓度即As(III)和As(V)总浓度。

进一步地，步骤(1)中，所述还原剂为硼氢化盐；所述待测水体与浓盐酸的体积比为1：(0.010～0.040)，所述待测水体与还原剂的体积质量比为1:(0.50～1.00)mL/mg；

优选的，所述硼氢化盐为KBH

步骤(3)中，所述吸光度测试的波长为500～520nm，优选为510nm，所述吸光度与As(III)’浓度的标准曲线为：吸光度＝(0.0207×10

本发明还提供了一种测定水体中的As(V)浓度方法，所述方法包括以下步骤：

(1)利用上述的方法测定待测水体中的As(III)浓度；

(2)利用上述的方法测定待测水体中的As(III)和As(V)总浓度；

(3)用As(III)和As(V)总浓度减去As(III)浓度，即得待测水体中的As(V)浓度。

本发明中，As(III)指三价砷离子，即As

室温指25±2℃。

本发明顶空单滴微萃取-分光移液管法的检测原理：

水样中的As(III)和As(V)在不同的pH环境下，被KBH

As(OH)

As(O)(OH)

生成的AsH

AsH

6Ag+6Fe

6Fe

6[Fe(o-phen)

总反应：

AsH

最终生成的Fe(o-phen)

在本发明的实施例1的pH条件下，加入还原剂KBH

实验发现，当控制实施例1步骤(1)中乙酸缓冲液的pH值为4.46时，本发明的HS-SDME-SP法能够用来检测待测水样中的As(III)浓度。

在本发明的实施例2的pH条件下，加入还原剂KBH

实验发现，当控制实施例2步骤(1)中加入浓盐酸后样品的pH值为0.53时，本发明的HS-SDME-SP法能够用来检测待测水样中As(III)和As(V)的总浓度。

为了测得待测水样中As(V)的浓度，需要用As(III)和As(V)的总浓度减去As(III)的浓度。

本发明采用的分光移液管是一种强大的多功能工具，在HS-SDME和吸光度原位测量程序中可以用作萃取剂处理器、微液滴支架和微切液管；在本发明的方法中，气-液吸收、氧化还原反应和显色反应以及吸收度的测量都可以一步完成。

本发明检测方法中采用的设备简单，小巧便携(重1.1kg)，容易操作，可以适时调整采样策略以适应任何特定环境的需要，在现场得到5min

本发明的检测方法灵敏、稳健、可靠、简单、实用，可以在野外快速测量天然水体中砷的纳摩尔浓度，适用于天然水体的现场分析。本发明的检测方法对砷的线性检测范围是0.3-65nM(R

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.本发明利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定水样中砷浓度的流程示意图：(a)在分光移液管中预装5μL萃取剂；(b)用KBH

图2.本发明利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定水样中砷浓度的设备照片。

图3.利用本发明HS-SDME-SP法和HG-AFS法对不同淡水样品中的As(III)和As(V)浓度进行测量比较；其中，横坐标值表示HS-SDME-SP法测试结果，纵坐标值表示HG-AFS法测试结果，实线表示实际结果的拟合图，虚线表示1：1的拟合线。

图4.不同缓冲液种类及其pH对本发明方法萃取效果的影响。图中，Citratebuffer表示枸橼酸缓冲溶液，Acetate buffer表示乙酸缓冲溶液，Phosphate buffer表示磷酸缓冲溶液。

图5.萃取剂组成中，Ag(I)水溶液浓度对萃取效果的影响。

图6.萃取剂组成中，Fe(III)水溶液浓度对萃取效果的影响。

图7.萃取剂组成中，o-phen水溶液浓度对萃取效果的影响。

图8.萃取剂组成中，SDS水溶液浓度对萃取效果的影响。

图9.有/无SDS水溶液的情况下萃取时间的影响。

图10.生成AsH

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

一、试剂配制：

1.1.0mM As(III)和As(V)的原液是通过将0.049g As

2.采用四氢硼酸钾(KBH

3.通过向100mL水中加入7.19mL乙酸(≥99.5％,Macklin,Shanghai,China)来配置乙酸缓冲液(0.5M)，然后用2M NAOH和2M HCL将溶液调整至所需的pH值。之后将溶液转移至250mL容量瓶中，用水定容。按照该方法配制得到pH值为4.37的0.5M乙酸缓冲液。

将26.40g一水柠檬酸(≥99.5％,Chron Chemicals,成都，中国)溶解在100mL水中制得柠檬酸缓冲液(0.5M)，并用2M NAOH和2M HCL调节pH值。然后像配置乙酸缓冲液那样，用水将柠檬酸缓冲液定容至250mL。

将适量的磷酸二氢钠(0.5M)和磷酸氢二钠(0.5M)混合来配置不同pH值的磷酸缓冲液(0.5M)。

4.将8.51g AgNO

5.将10.01g邻菲罗啉一水合物(≥99％,Chron Chemicals,成都，中国)溶解于2.5mL乙醇中，再用水稀释至50mL来配置1M邻菲罗啉(o-phen)水溶液。按照该方法配制得到0.3M SDS水溶液。

6.十二烷基硫酸钠(SDS)工作液是通过当天将SDS(≥98％,Chron Chemicals,成都，中国)溶解于水中来配置的。按照该方法配制得到0.3M o-phen水溶液。

7.用于顶空单滴微萃取的萃取剂是通过混合如下试剂配置的：1μL pH值为4.37的0.5M乙酸缓冲液，1μL 5mM Ag(I)水溶液，1μL 25mM Fe(III)水溶液，1μL 0.3M o-phen水溶液和1μL 0.3M SDS水溶液。

上述所有试剂配制过程中使用的水是来自Millipore(MA,USA)的Milli-QIntegral3系统的超纯水。上述所有试剂均在5℃下避光保存。

二、设备：

一台用于测量吸光度的，配备了DH-mini卤钨灯光源(Ocean Optics,FL,USA)的USB 2000+紫外线光谱仪(Ocean Optics,FL,USA)。

一根用作分光光度采样设备的、对样品进行光谱分析的分光移液管(Ideaoptics，上海，中国)，该分光移液管具备移液枪和紫外分光光度比色池的功能，是一种下方尖端处设置有紫外分光光度比色池的移液器。如图1d所示，样品可以通过分光移液管中一个高度透明的石英活塞来泵送和排出，该石英活塞通过顺时针和逆时针旋转按钮来控制，分光移液管尖端的紫外分光光度比色池也作为样品光学单元。该分光移液管由不锈钢外壳来保护，并且在移液管内部安装了石英套筒作为活塞和外壳之间的一个导向。

实施例1、利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定天然水体中的As(III)浓度

1、检测水体

本实施例采用来自清水河(成都，中国)的淡水样本作为待检测样本。利用装配了0.22um聚醚砜(PP)过滤头的50mL聚丙烯(PP)注射器，在0.2m水深处采集水样，然后将水样收集在50mL聚丙乙烯(PE)瓶中。然后从采集水样中取出5.0mL待测水样转移到10mL玻璃试管中。

2、测定待测水样中的As(III)浓度

按照图1所示流程示意图检测水样中的As(III)浓度，操作在室温下进行，具体操作如下：

(1)在5.0mL待测水样中加入pH值为4.46的1.25mL 0.5M乙酸缓冲液，混合后加入5.2mg预称重并包裹好的KBH

(2)然后将预装有5μL萃取剂(萃取剂由1μL pH值为4.37的0.5M乙酸缓冲液，1μL5mM Ag(I)水溶液，1μL 25mM Fe(III)水溶液，1μL 0.3M o-phen水溶液和1μL 0.3M SDS水溶液配制而成)的分光移液管通过硅胶垫片插入试管中(使用倾斜底座刺穿垫片)，并放在待测水样的顶空位置(距离液面0.5cm)。然后通过转动分光移液管上的旋钮将萃取剂排出分光移液管尖端的紫外分光光度比色池，在尖端一侧形成一颗悬挂的微液滴。4分钟后，将悬挂的微液滴吸进紫外分光光度比色池中，并利用紫外线光谱仪在510nm处现场测量微液滴的吸光度(图1d)。

根据吸光度与As(III)浓度的标准曲线，测得待测水样中的As(III)浓度。标准曲线为：Absorbance(吸光度)＝(0.0207×10

R

实施例2、利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定天然水体中的As(III)+As(V)浓度

1、检测水体

从实施例1采集的水样中另取出5.0mL待测水样转移到10mL玻璃试管中。

2、测定待测水样中As(III)和As(V)的总浓度

按照图1所示流程示意图检测水样中As(III)和As(V)的总浓度，操作在室温下进行，具体操作如下：

(1)在5.0mL待测水样中加入0.125mL的浓盐酸使样品pH值为0.53，然后加入4.2mg预称重和包裹好的KBH

(2)然后将预装有5μL萃取剂(萃取剂由1μL pH值为4.37的0.5M乙酸缓冲液，1μL5mM Ag(I)水溶液，1μL 25mM Fe(III)水溶液，1μL 0.3M o-phen水溶液和1μL 0.3M SDS水溶液配制而成)的分光移液管通过硅胶垫片插入试管中(使用倾斜底座刺穿垫片)，并放在待测水样的顶空位置(距离液面0.5cm)。然后通过转动分光移液管上的旋钮将萃取剂排出分光移液管尖端的紫外分光光度比色池，在尖端一侧形成一颗悬挂的微液滴。4分钟后，将悬挂的微液滴吸进紫外分光光度比色池中，并利用紫外线光谱仪在510nm处现场测量微液滴的吸光度(图1d)。

根据吸光度与As(III)和As(V)的总浓度的标准曲线，测得待测水样中的As(III)和As(V)的总浓度。标准曲线为：Absorbance(吸光度)＝(0.0207×10

实施例3、利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定天然水体中的As(V)浓度

1、利用实施例1的方法测得待测水样中的As(III)浓度；

2、利用实施例1的方法测得待测水样中的As(III)和As(V)的总浓度；

3、用As(III)和As(V)的总浓度减去As(III)浓度，即得待测水样中的As(V)浓度。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、建立吸光度与As(III)浓度的标准曲线

利用本发明实施例1的方法测量掺杂不同浓度(浓度范围：0.5～25nM)As(III)的淡水样品的吸光度，得到吸光度与As(III)浓度的标准曲线。对0.5至25nM范围内的AS(III)进行线性校准得到了0.9988的R

Absorbance(吸光度)＝(0.0207×10

表1.HS-SDME-SP法测定天然水体中As(III)浓度的分析性能

表1中，

由信噪比三倍计算得到的检出限(LOD)为0.1nM，并且该方法的线性关系在0.3-65nM范围(R

实验例2、回收率测试

1、实验方法

通过分析掺杂不同浓度As的不同天然水体基质(河流、湖泊、水库和池塘；详情参见图3)来研究本发明测试方法的回收率。

湖泊样本采集自东湖(University of Electronic Science and Technology ofChina,Chengdu,China)、三岔湖(Chengdu,China)和龙泉湖(Chengdu,China)；池塘样本采集自郫都区某湿地(Chengdu,China)；河流样本采集自沿清水河以及毗河(Chengdu,China)的不同地点，水库样本采集自紫坪铺、团结和黑龙潭水库(Chengdu,China)。

采用配备有一个0.22μm膜过滤器的50mL塑料注射器进行采样，注射器在大约10cm深的水下进行填充，采集到的样本在大约4℃的一个发泡聚丙烯式冷却箱中避光存储直到将其进行分析。

以已知的氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)作为对照。HG-AFS方法利用流动注射-氢化物发生原子荧光光谱仪(AFS-9130北京吉天仪器公司)进行测定：

(1)As(III)浓度的测定步骤：样品采集后，用0.22μm滤头过滤，然后直接放入流动注射-氢化物发生原子荧光光谱仪进行分析，流动注射-氢化物发生原子荧光光谱仪工作参数如表2所示。

(2)As(V)浓度的测定：样品采集后，用0.22μm滤头过滤，然后取25mL样品至40mL试管，加入1.5mL的浓盐酸和1mL的10％(m/v)的硫脲溶液，充分混合后室温下放置20min，然后放入流动注射-氢化物发生原子荧光光谱仪进行分析，工作参数如表2所示。此时测试结果为As(III)和As(V)的总浓度，该结果减去前文测得的As(III)浓度，即为As(V)的浓度值。

表2.HG-AFS测As(III)浓度的工作参数

2、实验结果

试验结果见表3和图3。

表3.采用HS-SDME-SP法对不同天然水体中的As含量进行测量(n＝3)

表3中，

从表3可以看出，利用本发明的方法进行检测，AS(III)的回收率为93.2-97.4％，As(V)的回收率为91.7-97.0％，表明本发明方法在天然水体中进行As含量检测具有良好的准确性。

从图3可以看出，在测试各水体中的As(III)浓度和As(V)浓度时，采用本发明的HS-SDME-SP法的检测结果和HG-AFS法相当，说明本发明的测试方法结果可靠。

实验例3、检测准确性验证

本实验例使用了两种经过认证的参考材料来验证本发明实施例2的HS-SDME-SP法的检测准确性。其中，GSB 07-3171-2014(地表淡水)来自中国环境保护部标准样品研究所，GBW(E)080230(海水)来自中国计量科学研究院。

表4.标准参考物质中As的分析(n＝3)

表4中，

验证结果见表4，实验值与验证值(即推荐值)显示出良好的一致性。25nM As(III)溶液的浓缩因子，即萃取相与水样品相中分析物浓度之比为166。

上述结果表明，本发明提供的HS-SDME-SP法对GSB 07-3171-2014(地表淡水)和GBW(E)080230(海水)中As(III)和As(V)总浓度的检测结果的准确性高。

实验例4、萃取剂和萃取时间的筛选实验

1、萃取剂中缓冲液种类及其pH的筛选实验

参照实施例1的测定方法，区别仅在于改变步骤(2)萃取剂组成中的缓冲液种类和pH值。以吸光度为指标，评价各缓冲液种类和pH值下的测量效果。

结果如图4所示。结果表明，当采用pH＝4.37的乙酸缓冲溶液时，萃取效果最佳。

2、萃取剂组成中Ag(I)、Fe(III)和o-phen用量的筛选实验

参照实施例1的测定方法，区别仅在于改变步骤(2)萃取剂组成中的Ag(I)水溶液、Fe(III)水溶液、o-phen水溶液的浓度。以吸光度为指标，评价各浓度下的测量效果。

结果如图5-图7所示。结果表明，萃取剂组成中，Ag(I)水溶液、Fe(III)水溶液、o-phen水溶液的浓度分别为5mM、25mM和0.3M时，萃取效果最佳。

3、萃取剂组成中SDS用量的筛选实验

参照实施例1的测定方法，区别仅在于改变步骤(2)萃取剂组成中的SDS水溶液浓度。以吸光度为指标，评价各浓度下的测量效果。

结果如图8所示。结果表明，萃取剂组成中，SDS水溶液浓度为0.3M时即可取得很好的萃取效果，继续增加SDS水溶液的浓度也不会提高萃取效率。

4、萃取时间的筛选实验

参照实施例1的测定方法，区别仅在于控制萃取剂组成中有无SDS水溶液(当有SDS水溶液时，其用量同实施例1)，以及改变步骤(2)在尖端一侧形成一颗悬挂的微液滴与将悬挂的微液滴吸进紫外分光光度比色池中的间隔时间(即萃取时间)。以吸光度为指标，评价在有/无SDS水溶液时，各萃取时间下的测量效果。

结果如图9所示。结果表明，萃取剂中有无SDS水溶液对萃取效果影响较大，在没有SDS水溶液的情况下，萃取很难达到平衡；萃取剂SDS水溶液的浓度为0.3M时，萃取平衡时间大幅缩短，在萃取时间为4min时即可达到萃取平衡。

实验例5、生成AsH

为了达到分步骤分离样品中As(III)和[As(III)+As(V)]总浓度的目的，本发明对生成AsH

因此，本发明在测量待测水样中的As(III)浓度时，通过在5.0mL待测水样中加入pH值为4.46的1.25mL 0.5M乙酸缓冲液来控制氢化物发生体系的pH值为4.46；在测量[As(III)+As(V)]总浓度时，通过在5.0mL待测水样中加入0.125mL的浓盐酸来控制氢化物发生体系的pH值为0.53。

综上，本发明提供了一种利用顶空单滴微萃取-分光移液管法测定天然水体中的砷含量的方法，本发明检测方法中采用的设备成本低，便携性好(1.1kg)，容易操作，可以适时调整采样策略以适应任何特定环境的需要，在现场得到5min