纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合作为制备治疗性肿瘤疫苗的应用

摘要

本发明涉及一种纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合作为制备治疗性肿瘤疫苗的应用，属于生物技术领域。所述的纳米肿瘤特异抗原为E7

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合作为制备治疗性肿瘤疫苗的应用。

背景技术

全球恶性肿瘤的发病率和死亡率日益激增，严重威胁着人类健康。免疫疗法现在已经成为癌症研究的前沿，并被公认为抗肿瘤军备中的重要工具。肿瘤免疫治疗的目标是通过增强免疫系统对肿瘤抗原的反应能力来帮助免疫系统识别和破坏肿瘤细胞。以细胞因子疗法、溶瘤病毒疗法、过继细胞疗法、免疫检查点抑制剂以及癌症疫苗为代表的免疫疗法，已经逐渐发展并在临床实践中显示出喜人的前景。

白细胞介素(IL)-2和干扰素-α(IFN-α)作为经典的治疗性细胞因子，高剂量使用在转移性黑色素瘤、肾癌以及慢性髓细胞白血病的临床治疗中显现出了较好的疗效，但较差的耐受性和严重的毒性阻碍了这些细胞因子作为单一疗法的进一步应用。溶瘤病毒是一种专门在癌细胞中感染和/或复制的病毒，利用转基因病毒感染肿瘤细胞，从而刺激促炎环境，导致细胞因子、危险信号以及病毒和肿瘤相关抗原的释放，增强全身抗肿瘤免疫。其中，利用基因修饰的单纯疱疹病毒Talimogene laherparepvec(T-Vec)，目前并已被批准用于不可切除的转移性黑色素瘤的治疗，但此策略也存在病毒安全性的问题。过继性细胞疗法(Adoptive cell therapy,ACT)利用自体免疫细胞，特别是T细胞，经过分离或基因工程，在体外扩增，再注入患者体内以消除癌细胞。目前，嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor,CAR)-T细胞(CAR-T细胞)、T细胞受体(T cell receptor,TCR)工程T细胞(TCR-T细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)已被发明用于过继移植，其中在血液系统恶性肿瘤中，靶向CD 19的CAR-T细胞已经取得了最显著的临床结果，但其针对实体瘤的效果有限。免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)旨在通过打断共抑制信号通路来重新激活抗肿瘤免疫应答，并促进免疫介导的恶性细胞消除。使用最广泛的靶点是细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4(Cytotoxic Tlymphocyte-associated molecule 4,CTLA-4)、程序性细胞死亡受体1(Programmed cell deathreceptor1,PD-1)和程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)。研究显示，用抗体阻断CTLA-4、PD-1和PD-L1可恢复T细胞的细胞毒能力并诱导肿瘤消退，目前靶向三者的抗体均已被批准用于多种恶性肿瘤的治疗，包括黑色素瘤、尿路上皮性膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和经典霍奇金淋巴瘤等，但是临床上也不是大部分的癌症患者都能从中获益。

肿瘤疫苗致力于帮助免疫系统重塑对肿瘤细胞的监视及清除功能，是极有前景的肿瘤免疫治疗策略，比如多肽疫苗、基因工程疫苗、抗体疫苗、以及以抗原呈递细胞(Antigen-presenting cell,APC)为载体的全细胞疫苗，尤其是树突状细胞(Dendriticcell,DC)疫苗等都取得了突破性的进展。目前已有三种获FDA批准的疫苗在主动免疫疗法方面取得了成功，其中两种是对与癌症形成有关的病毒的预防性治疗，乙肝病毒疫苗可预防慢性感染，从而降低肝细胞癌的风险；针对人类乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)的多价疫苗已被证明可防止感染最具致癌性的病毒，从而减少宫颈癌的发生率；用于治疗前列腺癌的Sipuleucel-T，是唯一被批准用于治疗的疫苗。综上所述，免疫治疗的潜力不仅是能激发抗肿瘤反应，而且能完全和长期缓解，因此开发新型有效的肿瘤疫苗具有可预见性的极好临床应用前景。

免疫系统的免疫监视功能可识别并清除肿瘤，CD8

肿瘤细胞发生ICD的过程中会释放和暴露肿瘤抗原、免疫原性损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)以及炎性介质，刺激机体免疫系统产生免疫应答。DAMPs主要包括三磷酸腺苷(ATP)、钙网蛋白(CALR)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、热休克蛋白(HSP)、Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)和膜联蛋白1(ANXA1)等。

CRT通常隐藏在内质网(ER)腔内，在ICD的早期过程中会在细胞膜表面发生凋亡前的暴露。细胞膜表面暴露的钙网蛋白(ecto-CALR)作为一个强有力的“吃掉我”信号，能增强抗原提呈细胞(APCs)对死亡癌细胞的识别和吞噬。Ecto-CRT与DC上的受体结合后可以促进DC的招募、抗原呈递、促炎细胞因子(如TNF-α和IL-6)的释放以及17型辅助T细胞(Th17型)的激活。肿瘤细胞释放的胞外ATP作为一个“发现我”的信号，具有招募、激活APCs和激活炎性体通路的双重作用。ATP与APCs(尤其是DCs)上的P2X7和P2Y2嘌呤能受体结合，刺激它们的表型成熟和介导强大的趋化性。胞外的ATP还会激活caspase-1依赖性NLRP3复合物炎症小体，引发IL-1β的分泌，产生的IL-1β可促使γδT细胞产生IL-17作用于CTLs，从而产生IFN-γ介导的抗肿瘤免疫反应。此外，胞外ATP也会刺激DCs和巨噬细胞释放促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-18，产生杀伤肿瘤细胞的活动。HMGB1在质膜严重受损时引发，它可作为促炎信号引发强效的免疫反应。HMGB1有促进DC成熟、迁移、向T细胞呈递TAA以及产生促炎细胞因子的功能。肿瘤细胞在死亡后期分泌的HMGB1与DC表面上的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合，加快了抗原被DC摄取、运输和加工的过程，有助于DC将抗原呈递给T细胞。此外，可激活MyD88(髓样分化主要反应基因)依赖性的信号转导通路，抑制吞噬体和溶酶体之间的融合，从而促进肿瘤抗原的加工递呈。HMGB1还可以抑制免疫抑制细胞Treg细胞的活性。产生的Ⅰ型IFN通过与肿瘤细胞上的IFN-α和IFN-β受体结合，触发肿瘤细胞的自分泌和旁分泌回路，导致CXC-趋化因子配体10(CXCL10)的释放，发挥免疫刺激作用。胞内释放的HSP70和HSP90一方面为免疫系统活化(特别是DC活化)提供免疫原性信号，另一方面充当肽抗原暴露的载体。虽然发生ICD的细胞能针对肿瘤的异质性提供更全面的抗原，但目前临床效果却不尽如人意。

肿瘤特异(新)抗原产生于健康组织中不存在的体细胞突变，是真正的外来蛋白。从理论上讲，它们是免疫治疗的理想靶点，因为不存在脱靶反应和T细胞的中枢耐受，它可以被特异(新)抗原特异性TCRs在MHCs分子的背景下特异性识别。此外，最近的研究表明，新抗原在免疫逃逸、免疫编辑和免疫检查点抑制剂的敏感性中发挥重要作用。理论上，一些传统的治疗方法可能导致肿瘤相关抗原和新抗原的释放，提示与新抗原为基础的疫苗治疗协同作用的可能性。此外，一些化疗药物已被证明可以通过改变新抗原库、增加抗原生成、改善抗原呈递和增强T细胞转运和应答来增强肿瘤细胞的抗原敏感性和免疫原性。目前已有两种针对肿瘤特异(新)抗原的治疗方法，包括以新抗原为基础的治疗性个体化疫苗和ACT疗法，都显示出良好的抗肿瘤效果且具有较高的特异性和安全性。除此之外，也有研究采用基于新抗原的方法和免疫检查点封锁(Immune checkpoint blockade,ICB)的联合治疗以克服ICB诱导的免疫抵抗并最大限度地提高抗肿瘤免疫活性。随着对新抗原的生物学特性和在抗肿瘤免疫中的作用的深入了解，可以确定的是以新抗原为基础的治疗策略在肿瘤免疫治疗中有着光明的前景。

纳米医学作为靶向癌症的治疗手段之一，一直与癌症免疫学同步发展。纳米材料因其高效递送抗原和具有免疫佐剂活性等特点成为肿瘤疫苗研究的热点。VLP是一种缺少病毒基因组、无复制能力的多蛋白结构，能够模仿天然病毒的构像，在机体中诱导免疫应答，目前已作为新一代抗原/疫苗递送载体。乙肝病毒核心抗原(HBV core antigen,HBcAg)可在大肠杆菌中高效表达并自发组装为直径约为37nm的VLP。通过化学偶联或基因重组，目的蛋白分子或肽段可高度重复及有序地呈现于HBcAg的表面，利于APC对抗原的高效摄取和加工呈递，从而激起机体更持久的免疫应答。自组装肽Q11制备的纳米纤维也是高效的表位疫苗载体。

肿瘤发展的异质性、免疫抑制以及免疫逃逸机制是肿瘤疫苗目前普遍缺乏显著临床疗效的关键因素。肿瘤疫苗的主要着力点之一就是如何激发针对肿瘤特异抗原的主动特异细胞免疫应答。肿瘤细胞受到刺激会发生ICD，在此过程中肿瘤细胞会释放、表达和暴露大量肿瘤抗原、DAMPs以及免疫刺激分子，引发一系列的免疫事件，最终呈现出有效的抗肿瘤作用。临床上的放疗和化疗都可以引发肿瘤细胞发生ICD，但是体内诱导肿瘤细胞发生ICD需要较高剂量的化疗药物，因药物严重的毒副作用难以实现，而且诱导的效果也不尽如人意。

因此如何克服现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合作为制备治疗性肿瘤疫苗的应用。将纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合制备治疗性肿瘤疫苗进行肿瘤治疗，可以激发荷瘤小鼠产生显著的抗肿瘤免疫效应，此策略在HPV相关肿瘤中进行的成功探索，为实体瘤的疫苗设计、临床个性化肿瘤疫苗的研究与开发提供新的策略。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合作为制备治疗性肿瘤疫苗的应用，所述的纳米肿瘤特异抗原为E7

进一步，优选的是，所述的肿瘤特异抗原为HPV 16型CTL抗原表位E7

进一步，优选的是，所述的治疗性肿瘤疫苗为治疗性TC-1宫颈癌疫苗。

进一步，优选的是，E7

进一步，优选的是，E7

进一步，优选的是，室温自组装6h。

本发明同时提供一种治疗性肿瘤疫苗，活性成分包括发生ICD的相应肿瘤细胞和纳米肿瘤特异抗原；所述的纳米肿瘤特异抗原为E7

进一步，优选的是，发生ICD的相应肿瘤细胞的数量和E7

发生ICD的相应肿瘤细胞的数量和E7

经本发明研究，在体外诱导肿瘤细胞发生ICD，将此细胞作为疫苗来治疗肿瘤是可行的策略。肿瘤特异(新)抗原作为肿瘤疫苗设计中较理想的靶点，在肿瘤治疗中占据举足轻重的地位，同时抗原的承载与给予形式对其稳定性、持久性和免疫原性是至关重要的。在本发明设计中，一方面考虑到肿瘤细胞发生ICD的过程中释放的肿瘤特异(新)抗原会有所不足，无法驱动足够的肿瘤特异(新)抗原特异性的T细胞应答，导致抑瘤效果一般；另一方面考虑到ICD释放的DAMPs会促进机体对肿瘤特异(新)抗原的识别与应答，而当机体对肿瘤特异(新)抗原产生强烈应答的同时或许会带动对ICD释放的广谱肿瘤抗原的应答，从而实现二者相互协同的抗肿瘤免疫。本发明研究在HPV宫颈癌相关肿瘤中开展。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

肿瘤疫苗最终的落脚点是激发肿瘤特异抗原特异性T细胞免疫应答从而精确高效的杀伤和清除肿瘤。然而，肿瘤免疫抑制和免疫逃逸机制严重阻碍了肿瘤疫苗抗肿瘤效应的发挥。克服以上不利因素的主要策略就是调控或者抑制肿瘤TME或者通过改进肿瘤疫苗的形式、递送效率、添加佐剂等以促进杀伤细胞的肿瘤浸润、存活以及杀瘤活性的保持。除此之外，不同策略之间的互补组合也是目前肿瘤疫苗设计的考虑范围。

本发明利用两种不同的纳米载体形式成功制备了呈递肿瘤特异(新)抗原的E7

脾脏淋巴细胞和肿瘤组织浸润的关键效应细胞CTL/NK对肿瘤的清除至关重要，而免疫抑制细胞MDSC及其产生的免疫抑制分子会阻碍效应细胞的功能发挥，促进肿瘤的生长及免疫逃逸。在本发明研究中，发生ICD的肿瘤细胞与纳米肿瘤特异抗原的联合，均在显著增加了脾脏组织和肿瘤组织CD8

通过本发明的研究，揭示了基于肿瘤细胞发生ICD的同时辅以肿瘤特异(新)抗原作为治疗性肿瘤疫苗的潜力，为所有实体瘤提供治疗性肿瘤疫苗设计的新思路与新策略，也为肿瘤特异(新)抗原与发生ICD的细胞联合应用于肿瘤疫苗相关研究和临床试验提供了基础。

附图说明

图1为SDS-PAGE鉴定重组蛋白的诱导表达及可溶性；其中，M为蛋白Marker；1为未诱导；2为诱导4h后；3为超声上清；4为超声沉淀；

图2为目的蛋白经硫酸铵沉淀纯化后的SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白Marker；1-13：PBS重悬溶解的每层样品；

图3为目的蛋白经硫酸铵沉淀纯化后进行碘克沙醇密度梯度离心后的SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白Marker；1-14：碘克沙醇密度梯度离心后的每层样品；

图4为TEM观察E7

图5为TEM观察E7

图6为E7

图7为流式细胞术检测经不同肽刺激后小鼠脾脏和肿瘤组织中的免疫细胞水平；其中，A、C：脾脏组织中经E7

图8为ELISPOT检测E7

图9为流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤组织中的MDSC和NK细胞水平；其中，A、C：脾脏、肿瘤组织中MDSC的代表性流式图；B、D：脾脏、肿瘤组织中MDSC的数量统计图；E：脾脏组织中NK细胞的代表性流式图；F：脾脏组织中NK细胞的数量统计图；注：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；

图10为E7

图11为流式细胞术检测经不同肽刺激后小鼠脾脏和肿瘤组织中的免疫细胞水平；其中，A、C：脾脏组织中经E7

图12为ELISPOT检测E7

图13为流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤组织中的MDSC水平；其中，A、C：脾脏和肿瘤组织中MDSC的代表性流式图；B、D：脾脏和肿瘤组织中MDSC的数量统计图；注：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

主要溶液的配制

(1)LB培养基

配方如表1所示。

表1

蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0，经高压蒸汽121℃20min进行灭菌后，加入Amp抗生素使终浓度为0.1mg/ml；配制固体氨苄平板在上述基础上加入15g的琼脂粉，而后定容至1L，高压灭菌，待温度冷却到不烫手时，加入Amp抗生素，充分混匀后倾倒在细菌培养皿中，待其完全凝固后倒置于4℃中保存。

(2)30％丙烯酰胺溶液

配方如表2所示。

表2

蒸馏水定容至100ml，用0.45μm滤器过滤，放置于4℃避光保存。

(3)考马斯亮蓝染色液

配方如表3所示。

表3

室温放置30min，加500ml蒸馏水，室温保存。

(4)脱色液

配方如表4所示。

表4

(5)SDS-PAGE

浓缩胶(2ml)

配方如表5所示。

表5

分离胶(5ml，12％)

配方如表6所示。

表6

(6)免疫荧光封闭液

配方如表7所示。

表7

(7)PB溶液

配方如表8所示。

表8

分别溶解至1L的蒸馏水中并用0.45μm的滤器过滤，放置于4℃保存。

(8)0.2MPB溶液(pH＝7.4)

配方如表9所示。

表9

(9)PBS溶液(pH＝7.4)

配方如表10所示。

表10

溶解在800ml的蒸馏水中，用HCl调pH至7.4，然后将体积补足1L，高盐灭菌后置于4℃保存。(10)WB电泳缓冲液(5×)

配方如表11所示。

表11

用蒸馏水定容至1L，于4℃保存。

(11)1640完全培养基

配方如表12所示。

表12

充分混匀后用封口膜封住瓶口，放置于4℃储存。

1纳米肿瘤特异抗原与发生ICD的肿瘤细胞联合作为制备治疗性肿瘤疫苗的应用

本发明中除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。

1.1 E7

(1)取10μl保存的E7

(2)第二天挑取单克隆菌落至氨苄抗性的5ml LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。

(3)然后将菌液按5％转接至5瓶新的200ml LB液体培养基中，37℃，280rpm培养至菌液的OD值为0.3～0.5，用一次性注射器加入浓度为1mM的IPTG，诱导4h。分别收集1ml未诱导和诱导4h后的菌液，4℃，12000rpm，离心2min，弃去培养基上清收集菌体。

(4)分别挑取未诱导和诱导菌体沉淀用100μl的0.02M的PB溶液重悬，加入100μl的2×loading buffer，置于100℃金属浴中10min使蛋白变性。

(5)剩余的诱导4h后的菌液收集于500ml的离心桶中，4℃，12000rpm，离心15min，弃去培养基上清后收集菌体。

(6)菌体沉淀用10ml 0.02M的PB溶液重悬，将其置于冰浴中使用超声破碎仪进行超声破碎。超声条件设置为功率为15％，总时长15min，超声5s，间隔5s。

(7)4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，置于冰浴中。

(8)将超声沉淀再次用10ml 0.02M的PB溶液重悬，而后进行第二次超声，收集第二次超声上清。

(9)将两次超声上清混合后加入4.86g硫酸铵进行40％的硫酸铵沉淀，搅拌混匀后在室温静置1h。

(10)20℃，12000rpm，离心10min，弃去上清，收集沉淀。

(11)沉淀采用20ml的20％的硫酸铵洗涤，20℃，12000rpm，离心10min，弃去上清。重复此步骤三次。

(12)最后得到的沉淀用600μl的0.02M PB溶液重悬，12000rpm，20℃，离心5min，收集重组蛋白上清至干净的离心管中。重复此步骤15次。每收集一次的重组蛋白上清，依次编号，第一次收集的重组蛋白上清为第一层，第二次收集的重组蛋白上清为第二层，依次类推。

(13)分别取20μl上述(12)中收集的15层重组蛋白上清，加入等体积的2×loadingbuffer，混匀后置于100℃金属浴中10min，而后进行SDS-PAGE凝胶电泳。

(14)电泳完成后对其进行考马斯亮蓝染色，染色过夜。

(15)第二天对其用脱色液进行脱色处理，待蛋白条带基本清晰后，将其浸泡在自来水中2h，而后进行凝胶成像确定E7

E7

1.2 E7

1.1中的收集的每一层重组蛋白上清通过SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色确定E7

(1)配置浓度梯度为27％、33％和39％的碘克沙醇溶液。

(2)把碘克沙醇预先在12ml的超速离心管中铺设好，形成明显的液面梯度界限，从上至下分别为27％、33％和39％的碘克沙醇溶液，在室温静置30min待其各层液面之间相对稳定。

(3)取目的蛋白主要所在的上清层，用200μl的枪轻轻地将其加在液面之上，40000rpm，4℃，离心4h，从上至下按500μl一层来进行取样，依次编号。

(4)分别取20μl(3)中收集的每一层重组蛋白上清，加入等体积的2×loadingbuffer，混匀后置于100℃金属浴中10min，而后进行SDS-PAGE凝胶电泳。

(5)电泳完成后对其进行考马斯亮蓝染色，染色过夜。

(6)第二天对其用脱色液进行脱色处理，待蛋白条带基本清晰后，将其浸泡在自来水中2h，而后进行凝胶成像确定E7

硫酸铵沉淀法初步纯化结果：对1.1中的(9)两次超声后收集的上清重组蛋白进行40％硫酸铵沉淀，沉淀下来的蛋白再以20％的硫酸铵溶液进行3次洗涤，最后沉淀每次用500μl的PBS重悬多次溶解沉淀，离心后收集上清，对上清进行SDS-PAGE分析，结果显示目的蛋白主要集中溶解在洗涤的第9-12层，见图2。

碘克沙醇密度梯度离心法进一步纯化结果：对硫酸铵沉淀初步纯化的蛋白采用碘克沙醇密度梯度离心进一步纯化，离心后的样品从上至下取多层溶液进行SDS-PAGE分析，结果显示，蛋白主要集中存在于第11-12层，见图3。

1.3 E7

将1.2中获得的样品采用HPLC检测(本发明对于HPLC的具体条件不做限制，只要能实现浓度检测即可)，将HPLC检测出纯度较高的样品滴加5μl在透射电镜专用的铜网膜上，使其在室温静置5min，而后用滤纸吸取多余的液体。将2％的磷钨酸染色液滴加至铜网膜上，同样静置5min并用滤纸吸取多余的染色液，待其自然晾干后再通过透射电镜进行E7

结果：E7

1.4 E7

合成的E7

1.5 E7

将1.4中制备好的E7

合成肽E7

1.6 C57BL/6小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型的建立

基质胶(美国BD Bioscience公司)，提前一晚置于冰浴中，而后将它们一起转移至置于4℃中慢慢融化，用剃须刀将小鼠右侧背部皮下的毛发剔除。在计划建立肿瘤模型的前三天从液氮中复苏TC-1细胞，待细胞生长至80％～90％的密度时，倾倒掉培养基上清，用移液器吸除剩余培养基，而后加入3ml PBS缓冲液润洗细胞，重复洗涤三次，吸出剩余的PBS。加入3ml的胰蛋白溶液，左右晃动使胰酶的分布均匀，将细胞培养瓶平躺室温静置1～3min。当观察到细胞有微微脱落时，立即加入3ml的完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶壁上的细胞并混匀细胞悬液，600rpm，室温离心5min，弃去上清。细胞沉淀用5mlPBS重悬细胞沉淀润洗细胞，600rpm，室温离心5min，收集细胞沉淀，重复洗涤1次。用2ml PBS重悬细胞，进行细胞计数，而后将细胞悬液和基质胶按体积比为1：1制备成浓度为1×10

1.7疫苗体内效果评价

所有疫苗的免疫方式均采取皮下免疫。

1.7.1发生ICD的TC-1肿瘤细胞联合纳米肿瘤特异抗原对小鼠肿瘤模型的治疗性免疫干预研究

1.7.1.1 ICD细胞联合E7

肿瘤接种和纳米颗粒的制备操作同前，期间使用游标卡尺每隔3天就测量肿瘤体积以密切监测记录小鼠肿瘤的生长情况。待肿瘤直径生长至3～5mm时，将小鼠随机分为PBS组、ICD组、E7

免疫研究结果：统计数据显示，与PBS组、ICD组和E7

对不同抗原肽刺激的CTL水平的影响：CTL细胞作为适应性免疫效应细胞，可以通过分泌IFN-γ和颗粒酶B等物质表现出理想的杀伤和清除肿瘤细胞的作用，特别是肿瘤组织中浸润的CTL细胞。因此对从肿瘤组织和脾脏组织中分离出的淋巴细胞进行计数铺板后分别用E7

对不同抗原肽刺激后分泌IFN-γ的T细胞水平的影响：抗原特异性能分泌IFN-γ的T细胞是肿瘤疫苗诱导CTL应答从而发挥其抗肿瘤免疫的重要效应细胞。因此，在实验终点牺牲小鼠后，分离出小鼠脾脏的淋巴细胞，采用ELISPOT检测脾脏淋巴细胞中经过不同抗原肽[E7

对MDSC和NK水平的影响：MDSC作为经典的免疫抑制细胞，可以抑制CTL的杀伤作用，进而帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸。NK细胞作为固有免疫效应细胞，对于肿瘤也起到一定程度的杀伤作用。对分离出的脾脏和肿瘤组织中的淋巴细胞进行了流式细胞术检测，结果表明，与PBS组、ICD组和E7

1.7.1.2 ICD细胞联合E7

肿瘤接种和纳米纤维的制备操作同前，期间使用游标卡尺每隔3天就测量肿瘤体积以密切监测记录小鼠肿瘤的生长情况。待肿瘤直径生长至3～5mm时，将小鼠随机分为PBS组、ICD组、E7

免疫研究结果显示：与各对照组相比，ICD+E7

对不同抗原肽刺激的CTL水平的影响：从肿瘤组织和脾脏组织中分离出的淋巴细胞后分别用E7

对不同抗原肽刺激后分泌IFN-γ的T细胞水平的影响：对分离出小鼠脾脏的淋巴细胞采用ELISPOT检测脾脏淋巴细胞中经过不同抗原肽(E7

对MDSC水平的影响：对小鼠分离出的脾脏和肿瘤组织中的淋巴细胞进行流式细胞术检测，结果表明，与PBS组、ICD组和E7

上文中，C57BL/6小鼠脾脏淋巴细胞的体外分离具体方法为：

(1)小鼠脱颈牺牲后，取出脾脏组织轻柔地放入2ml的离心管中，置于冰浴中。

(2)将脾脏移至生物安全柜中操作，放入孔径为70μm的细胞筛网中，将筛网放入50ml离心管口，每个脾脏逐次加入小鼠淋巴细胞分离液(达科为公司)，共计加入6ml，用5ml注射器的活塞轻轻研磨脾脏至细胞完全透过细胞筛网。

(3)将脾脏细胞悬液转移至15ml离心管中，用1ml移液器在液面之上沿着管壁缓慢地加入700μlRPMI-1640培养基，使两者液面之间的分界线清晰可见。

(4)800g，室温离心35min，将升降速都调整至3档。

(5)离心结束轻柔地取出离心管，此时可见明显的分层，用巴氏管吸取中间白色的细胞层(如果有红细胞也会呈现出的是红色细胞层)至15ml离心管中。

(6)加入5～10ml的红细胞裂解液混匀裂解红细胞，室温静置10min，300g，室温离心10min，弃上清。

(7)细胞沉淀用10ml PBS重悬，300g，室温离心10min，弃上清。

(8)用200～1000μl的RPMI-1640完全培养基重悬细胞至1.5ml的离心管中，进行细胞计数。

小鼠肿瘤淋巴细胞的体外分离具体方法为：

(1)肿瘤组织剥离出来后，用剪刀剪取部分肿瘤组织放入5ml的离心管中，再次用剪刀将其剪至碎泥状。

(2)加入1ml浓度为1mg/ml的胶原酶(Collagenase)A溶液(Roche公司)，用涡旋振荡器充分混匀。

(3)置于37℃，150rpm的摇床中消化1h。

(4)在生物安全柜中，将消化好的肿瘤组织放入70μm的筛网中，加入淋巴细胞分离液进行研磨，后续操作同脾脏淋巴细胞的分离。

小鼠脾脏和肿瘤淋巴细胞的流式细胞术(FCM)检测具体方法为：

①FCM检测CTL细胞：

(1)每个样品分离出的淋巴细胞按2×10

(2)2h后每孔加入1μl 100×BrefeldinA，轻柔地混匀。

(3)5h后室温600g离心5min，轻轻将板反扣在吸水纸上，弃去上清。

(4)用多通道移液器加入200μl预冷(冰浴中至恒温)的Cell Staining Buffer(Biolegend公司)重悬洗涤细胞，室温600g离心5min，重复2次，弃去上清。

(5)用100μl Cell Staining Buffer重悬细胞，加入1.25μl CD8α-APC抗体(Biolegend公司)，放置于4℃避光孵育30min，CD8α-APC单染管加抗体，空白管和IFN-γ-PE单染管加100ul Cell Staining Buffer。

(6)200μl Cell Staining Buffer洗涤3次，600g室温离心5min，弃上清。

(7)200μl Fixation Buffer(Biolegend公司)，重悬细胞，室温避光进行固定30min。

(8)200μl Cell Staining Buffer洗涤3次，室温600g离心5min，弃上清。

(9)用ddH

(10)100μl 1×Permeabilization Wash Buffer重悬细胞，加入1.25μl IFN-γ-PE抗体(Biolegend公司)，室温避光孵育30min，IFN-γ-PE单染管加抗体，空白管和CD8α-APC单染管加100ul Cell Staining Buffer。

(11)200μl 1×Permeabilization Wash Buffer重悬洗涤2次，室温600g离心5min，弃上清。

(12)200μl Cell Staining Buffer重悬细胞转移至带筛网的流式管中，将细胞过滤后上流式细胞仪检测。

②FCM检测MDSC：

(1)淋巴细胞按1×10

(2)200μl Cell Staining Buffer重悬洗涤2次，600g室温离心5min，弃上清。

(3)加入100μl Cell Staining Buffer重悬细胞，每孔分别加入1.25μl CD11b-APC(Biolegend公司)，和1.25μl Gr-1-PE抗体(Biolegend公司)，置于4℃避光孵育30min。

(4)200μl Cell Staining Buffer重悬洗涤3次，600g室温离心5min，弃上清。

(5)200μl Cell Staining Buffer重悬细胞，过流式筛网，上机检测。

③FCM检测NK细胞：

淋巴细胞铺板和洗涤操作同MDSC的检测。加入1.25μl NK1.1-APC抗体(Biolegend公司)，和1.25μlCD49b抗体(Biolegend公司)，4℃避光孵育30min，后续洗涤以及上机流程同1。

酶联免疫斑点(ELISPOT)检测抗原特异性分泌IFN-γ的脾脏T淋巴细胞水平具体方法为：

(1)第一天需无菌操作，在预包被板中每孔加入200μl RPMI-1640培养基，室温静置10min后将其反扣倒出，使板子活化。

(2)淋巴细胞按3×10

(3)加入刺激物，具体如下：

①正对照孔：加入PMA刺激剂工作液(达科为公司)。

②负对照孔(含背景负对照孔)：加入RPMI-1640完全培养基。

③实验孔：E7

(4)轻轻混匀后放置于37℃，5％CO

(5)第二天不再需要无菌操作，倾倒孔内细胞及培养基。每孔加入200μl冰冷的去离子水(冰浴中预冷至恒温)，4℃冰箱放置10min，低渗裂解细胞。

(6)甩出孔内液体，每孔加入260μl 1×Washing buffer(达科为公司)，停留2min后弃去孔内液体，重复洗涤6次，每一次都在吸水纸上扣干液体残余。

(7)加入稀释好的生物素标记的抗体(Biotinylated antibody)工作液(达科为公司)，100μl/well，置于37℃孵育2h。

(8)重复步骤(2)。

(9)加入稀释好的酶标亲和素(Streptavidin-HRP)工作液(达科为公司)，100μl/well，置于37℃孵育1h。

(10)重复步骤(2)。每一次在吸水纸上扣干后揭开板底座，用自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干残留的水迹后合上底座，加入1×Washing buffer，260μl/well，停留2min后弃去并彻底扣干孔内液体。

(11)每孔加入100μl现配的AEC显色液(达科为公司)，室温避光静置5-30min，根据斑点生成情况选择终止显色时间。

(12)倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水冲洗正反面及底座3～10min，终止显色，将板子过夜浸泡在自来水中。

(13)将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。

(14)上机对ELISPOT板斑点进行计数，并记录斑点的各种参数做统计分析。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。