一种抑制稻瘟病菌的关键基因、dsRNA及其制备和应用

摘要

本发明公开了一种抑制稻瘟病菌关键基因、dsRNA及其制备和应用，所述关键基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、ID NO.7、ID NO.9任一所示，还公开了抑制稻瘟病菌关键基因dsRNA为含有T7启动子的MoCytb基因的dsRNA、MoRic8基因的dsRNA、MoTrx2基因的dsRNA、MoMBF1基因的dsRNA或MoEnd3基因的dsRNA中的任意一种，本发明合成的dsRNA稳定性强，能够抑制水稻稻瘟病菌孢子萌发、附着胞和芽管形成，进而有效防治水稻稻瘟病。本发明还公开dsRNA在用于制备生物杀菌剂抗菌中的应用，效果明显且绿色环保。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种抑制稻瘟病菌的关键基因、dsRNA及其制备和及应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的农作物之一，世界上超过一半的人口以水稻为主食。由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是全世界最具有毁灭性的水稻真菌病害之一。稻瘟病菌几乎在所有生长阶段都侵染植物，使水稻产量降低10％至35％，严重的时候甚至颗粒无收。而在我国，自上世纪90年代开始，每年因稻瘟病导致的水稻产量损失高达数亿公斤，而每年稻瘟病发生的面积均在38万hm

现有技术中，控制稻瘟病主要依赖转基因抗病品种选育和化学农药等传统防治手段，但由于稻瘟病菌变异快，其变异周期远远低于抗病品种的选育时间，导致抗病品种培育滞后；而化学农药乱用滥用的问题突出，稻瘟病抗药性不断增长，环境农药残留超标时有报道，严重威胁人类、环境、产业的健康发展。因此，发展绿色、便捷、安全、高效的新型防控技术迫在眉睫。

小RNA(sRNA)是一类长度为21-24个核苷酸的非编码RNA。sRNA可以特异性识别靶基因并抑制其表达，称为基因沉默。sRNA和基因沉默在宿主植物和病原体之间的相互作用中发挥着多种重要的作用，为植物保护和病害防控提供了多种适用机会。喷雾诱导基因沉默(SIGS)具有与HIGS类似的功能，但不需要借助转基因生物。

发明内容：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种抑制稻瘟病菌的关键基因，其抑制稻瘟病菌致病性的dsRNA稳定性强，能够抑制水稻稻瘟病菌孢子萌发、附着胞的形成和芽管生长，进而能够有效防治水稻稻瘟病。

本发明还提供所述的抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA及其制备方法和应用。

技术方案：为了实现是上述目的，本发明所述抑制稻瘟病菌关键基因为MoCytb或MoRic8或MoTrx2或MoMBF1或MoEnd3中的任一种，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示。

本发明所述抑制稻瘟病菌关键基因的特异性基因，所述特异性基因为抑制稻瘟病菌关键基因序列中具有较高的特异性同时避开了内含子的序列，其核苷酸序列分别如SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示。

本发明所述的抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA，所述抑制稻瘟病菌关键基因dsRNA为含有T7启动子的MoCytb基因的dsRNA、MoRic8基因的dsRNA、MoTrx2基因的dsRNA、MoMBF1基因的dsRNA或MoEnd3基因的dsRNA中的任意一种，其核苷酸序列分别在序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10前增加T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。

其中，所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA中的特异性21nt序列合成sRNA，进行了2'-O-甲基修饰或者硫代磷酸酯(PS)骨架修饰得到修饰的增强型ds-sRNA：ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme，所述21nt序列分别为序列SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示。

本发明提供了一种抑制稻瘟病菌基因的dsRNA的体外转录合成方法，具体步骤如下：

(1)dsRNA模板准备：利用所述特异性基因作为模板，用含有T7启动子的上下游引物序列进行PCR扩增，纯化后得到模板，再用试剂盒对纯化模板进行转录；

(2)DNase处理：转录后，加入转录酶混匀；

(3)转录RNA的精制：将混合液转入离心管内，加入苯酚、氯仿、异戊醇混合液，震荡离心取上清液；吸取上清液于新的离心管中再加入的氯仿、异戊醇混合液，震荡离心取上清液；取得上清液与醋酸钠和异丙醇混合，室温静置后离心弃上清液，加乙醇洗净沉淀，再加入DEPC水溶解沉淀后放入超低温冰箱保存。

作为优选，步骤(1)所述含有T7启动子的dsRNA的上下游引物分别为MoCytb-T7-F和MoCytb-T7-R，MoRic8-T7-F和MoRic8-T7-R，MoTrx2-T7-F和MoTrx2-T7-R，MoMBF1-T7-F和MoMBF1-T7-R，MoEnd3-T7-F和MoEnd3-T7-R，其对应的序列为SEQ ID NO.17-26。其中，步骤(3)所述苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25～28:25～28:1～5。

作为优选，步骤(3)所述苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25:24:1。本发明所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA在抑制稻瘟病中的应用。

本发明所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA在制备抑制稻瘟病菌的抑制制剂中的应用。

其中，所述抑制稻瘟病为体外喷雾侵染，将含dsRNA的溶液均匀喷洒于三叶期的水稻幼苗上，培养后观察表型。

本发明原理：SIGS通过喷洒、注射或淋涂等方式提供sRNA，这些sRNA随后进入病原体细胞并抑制病原体的生长、发育和致病能力。除了准确抑制目标基因的表达外，SIGS还具有其他常规农药所没有的巨大优势，例如更短的半衰期和每个施用期后的残留量更低。因此本发明利用RNAi和SIGS，成功研制出一种对稻瘟病菌致病性具有抑制效果的dsRNA药剂。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次克隆到全新的双链核糖核酸dsCytb、dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3，其中dsCytb效果最为显著，该dsRNA可以准确抑制关键基因的表达，从而抑制稻瘟病菌，稻瘟病菌MoCytb基因的dsRNA，有较高的抑制效果，显著抑制了稻瘟病菌孢子萌发、芽管和附着胞形成，且沉默效率高。

2、本发明稻瘟病菌Guy11和dsRNA

附图说明

图1本发明稻瘟病菌靶标基因的特异性基因扩增成功PCR验证。

图2本发明稻瘟病菌靶标基因体外转录合成dsRNA验证。

图3本发明dsRNA抑制稻瘟病菌孢子萌发、芽管和附着胞形成；A为将稻瘟病菌孢子萌发分为四类：类型1(对照组)：孢子、芽管和附着胞正常萌发；类型2：芽管正常、孢子萌发受抑制、无附着胞；类型3：孢子萌发受抑制、芽管畸形、附着胞正常；类型4：孢子萌发受抑制、芽管和附着胞都畸形；B为dsRNA处理6、10和24小时后，稻瘟病菌孢子生长的分类和统计；C为dsRNA处理6、10和24小时后，稻瘟病菌附着胞形成率(正常萌发孢子数/总孢子数)。

图4本发明sRNA结构修饰增强沉默效果；A为sRNA处理6至48小时后，稻瘟病菌孢子生长的分类和统计；B为用sRNA处理6至48小时后，稻瘟病菌附着胞形成率；C为显微镜观察结束后，用20μl DEPC清洗载玻片回收dsRNA。

图5本发明重组大肠杆菌中dsRNA的诱导表达；A为含有L4440-MoCytb和L4440-GFP的HT115诱导表达(+：添加IPTG；-：不添加IPTG)，B为优化后细菌诱导dsRNA的回收率。

图6本发明dsRNA处理可以降低稻瘟病菌的致病性。

图7本发明dsRNA处理显著降低真菌生物量。

图8本发明dsRNA处理显著降低MoCytb的表达量。

具体实施例

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中使用的全部引物序列如下表1所示。

表1

实施例1

稻瘟病菌关键基因的克隆

本发明中MoCytb、MoRic8、MoTrx2、MoMBF1、MoEnd3关键基因选自Gene Bank抑制稻瘟病菌等方面的基因，通过人工合成，其序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示。

稻瘟病菌关键基因中特异性基因的克隆

(1)待稻瘟病菌Guy11(由南京农业大学提供)菌丝完全长满整个培养基，用盖玻片刮菌丝于预冷好的研钵中，用研磨棒研磨成粉末。

(2)将研磨好的粉末转入1.5mLRNA专用离心管，加入TRIzol试剂(Invitrogen)提取稻瘟病菌总RNA，然后反转录成cDNA作为模板。如表1所示，以稻瘟病菌基因的dsRNA的上下游引物序列(MoCytb-F、MoCytb-R、MoRic8-F、MoRic8-R、MoTrx2-F、MoTrx2-R、MoMBF1-F、MoMBF1-R、MoEnd3-F、MoEnd3-R)进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸30-60s/kb，共32个循环，72℃条件下延伸5min，PCR扩增产物进行电泳后切胶回收产物，使用DNA凝胶回收试剂盒进行产物的纯化。如图1所示，成功扩增得到稻瘟病菌关键基因的特异性基因核苷酸片段，其序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示。

实施例2

体外转录合成dsCytb、dsRic8、dsTrx2、dsMBF1和dsEnd3

(1)用实施例1所得稻瘟病菌关键基因的特异性核苷酸片段作为模板，利用DNAMAN设计含有T7启动子，如表1所示，设计上下游引物序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26所示(MoCytb-T7-F、MoCytb-T7-R、MoRic8-T7-F、MoRic8-T7-R、MoTrx2-T7-F、MoTrx2-T7-R、MoMBF1-T7-F、MoMBF1-T7-R、MoEnd3-T7-F、MoEnd3-T7-R)进行PCR扩增模板，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸30-60s/kb，共32个循环，72℃条件下延伸5min，PCR扩增产物进行电泳后切胶回收产物，用PCR清洁试剂盒进行纯化处理得到含有T7序列的DNA模板。再使用In vitro Transcription T7 Kit试剂盒(购自TaKaRa公司)对所得含有T7序列的DNA纯化模板转录进行dsRNA的合成，根据表2所示反应液体系依次添加，其中T7 RNA Polymerase和上述所得DNA模板最后添加，防止混合液出现白色絮状沉淀：

表2试剂盒反应体系

用移液枪吸打混匀速离，放置于PCR(42℃，2h)仪中，42℃反应2h。

(2)DNase处理

转录结束后，加入5μL的RNase free DNaseⅠ，混匀。放入PCR仪(37℃，30min)，反应30min。

(3)转录RNA的精制

离心后，如果混合液体积小于100μL，用RNase free ddH

实施例3

稻秆培养基(SDC)配置方法

(1)用天平称量普通稻秆100g置于电磁炉中。

(2)加入1.5L的ddH

(3)双层纱布过滤，弃滤渣，用ddH

(4)放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，120℃，20分钟。

实施例4

dsRNA抑制稻瘟病菌生长

(1)将稻瘟病菌菌株Guy11接种于实施例3所配置的稻秆培养基(SDC)中，倒置在28℃恒温培养箱中培养。培养3d后将生长在平板上菌丝刮除，然后转至室内组织培养架上黑光灯光照培养3d，以诱导孢子形成并收集孢子。

(2)处理组(分别采用实施例2制备的dsCytb、dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3)滴加5μL Guy11孢子悬浮液(2×10

在倒置荧光显微镜(Zeiss Axio observe 3)下观察处理组和未处理的稻瘟病菌图片，发现可以根据孢子萌发、芽管形成和附着胞形态分成四种类型(类型1-4)，说明dsRNA对稻瘟病菌孢子生长发育是有影响的。并根据稻瘟病菌孢子生长发育情况拍照和分析以便更好地区分和准确量化dsRNA对稻瘟病菌生长的抑制效果。如图3中A所示，按照孢子萌发、芽管和附着胞发育情况，将稻瘟病菌孢子萌发分为四种类型：类型1(对照组)：孢子、芽管和附着胞正常萌发；类型2：芽管正常、孢子萌发受抑制、无附着胞；类型3：孢子萌发受抑制、芽管畸形、附着胞正常；类型4：孢子萌发受抑制、芽管和附着胞都畸形。

处理组(dsCytb、dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3)在与Guy11孢子悬浮液共孵育6小时、10小时和24小时后，如图3中B所示稻瘟病菌孢子生长的分类和统计。在共孵育6小时后，对照组大约87.9％的孢子正常萌发(类型1)，其余12.1％的孢子为发育畸形，相比之下dsCytb处理显著抑制了孢子萌发。在dsCytb处理的样品中类型1孢子占51.2％、类型2占13.4％、类型3孢子占12.2％、类型4孢子占23.2％，dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3也有不同程度的抑制效果；共孵育10小时后，对照组中大部分孢子发育正常(类型1>90％)，其余10％为类型2、3、4，dsCytb处理统计结果显示62.6％的类型1、2.5％的类型2、9.4％的类型3和25.5％的类型4；共孵育24小时后，dsCytb处理统计结果显示80.6％的类型1、4.6％的类型3和14.8％的类型4。dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3对稻瘟病菌孢子萌发、芽管和附着胞形成没有显示出显著的抑制作用，但是dsCytb处理显著抑制了孢子萌发、芽管和附着胞形成。

为了检测处理组(dsCytb、dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3)对附着胞形成是否有影响，本发明统计了对照组和处理组的附着胞形成率(附着胞正常形成孢子数/总孢子数)，如图3中C所示，在共孵育6小时后，对照组大约88.1％的附着胞正常形成，而dsCytb处理的样品大约51.4％的附着胞正常形成；共孵育10小时后，对照组大约95.4％的附着胞正常形成，而dsCytb处理的样品大约62.5％的附着胞正常形成；共孵育24小时后，对照组大约95.2％的附着胞正常形成，而dsCytb处理的样品大约80.6％的附着胞正常形成。结果表明，dsRic8、dsTrx2、dsMBF1、dsEnd3对附着胞形成没有显示出显著的抑制作用，但是dsCytb处理显著抑制了附着胞形成。说明dsCytb对稻瘟病菌(Guy11)附着胞形成率有抑制作用。

实施例5

末端胸腺嘧啶和结构修饰增强沉默效果

为了检测结构修饰是否能够增强dsRNA的稳定性同时增强抑制效果，选择其中不含内含子、特异性高的21nt序列合成sRNA，同时进行了2'-O-甲基修饰或者硫代磷酸酯(PS)骨架修饰。利用2'-O-甲基修饰使寡核苷酸对核酸酶具有相对抗性并显着增强沉默活性以及硫代磷酸酯(PS)主链修饰可以保护dsRNA免受细胞内核酸酶的快速降解的机理，本发明对抑制稻瘟病菌关键基因MoCytb的dsRNA进行了2'-O-甲基修饰和硫代磷酸酯(PS)骨架修饰。以实施例2制备的稻瘟病菌基因dsCytb为模板，选择了不含内含子，特异性强的长度为21nt的序列，设计上下游引物序列，引物序列如表1中SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.16所示(ds-sCytb-F、ds-sCytb-F、ds-sCytb-Ome-F、ds-sCytb-Ome-R、ds-sCytb-SOme-F、ds-sCytb-SOme-R，即特异性高的21nt序列)，扩增并修饰了2'-O-甲基或者硫代磷酸酯合成了ds-sCytb、ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme，上述均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

用上述合成的ds-sCytb、ds-sCytb-Ome、ds-sCytb-SOme作为处理组在与Guy11孢子悬浮液共孵育6小时、10小时和24小时后。如图4中(A)所示对稻瘟病菌(Guy11)孢子生长的分类和统计，在共孵育6h后，ds-sCytb处理的样品中约57.5％的孢子正常萌发(类型1)，剩余的孢子均萌发畸形(分别为类型2占10.2％、类型3占11.8％和类型4占20.5％)。共孵育10h后，ds-sCytb处理的样品中孢子萌发类型分别为：类型1占74.6％、类型2占6.5％、类型3占3.2％、类型4占15.7％。而ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme处理相比对照组显著抑制了孢子萌发。共孵育24h后，对照和dsCytb处理中大约90％的孢子正常萌发，而ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme处理中的孢子正常萌发大约60％。随着时间的推移，抑制作用逐渐下降。共孵育48h后，ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme处理中分别有大约85％的正常萌发(类型1)孢子，而在对照处理中几乎95％的孢子发育正常。结果表明，经过骨架修饰后的dsRNA显著增强了sRNA的稳定性和保护效果，其中ds-sCytb-SOme的稳定性更强且抑制效果更好。

同时本发明还观察了对照组和ds-sCytb、ds-sCytb-Ome、ds-sCytb-SOme处理之间的附着胞形成率，如图4中(B)所示，共孵育6h后，对照组附着胞形成率超过80％，ds-sCytb处理附着胞形成率为56.3％，ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme处理的附着胞形成率分别为25.0％和23.3％。然而，从共孵育10h开始，结构修饰的sRNA对附着胞形成的抑制作用更明显。共孵育10h后，ds-sCytb、ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme处理附着胞形成率分别为74.5％、70.7％、32.7％。共孵育24、36和48h后，ds-sCytb和ds-sCytb-Ome对附着胞形成不再有抑制作用。然而，ds-sCytb-SOme处理对附着胞形成仍然有显著抑制作用。结果表明结构修饰通过增强sRNA的稳定性，显著增强了sRNA的抑制作用。

显微镜观察拍照结束后，用20μLDEPC清洗载玻片回收sRNA。并在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。如图4中(C)所示，与ds-sCytb相比，ds-sCytb-OMe和ds-sCytb-SOMe持续到60hpi没有明显的降解，且ds-sCytb-SOme处理抑制效果更佳，表明结构修饰保护了sRNA免受RNA酶的影响。

实施例6

稻瘟病菌基因dsRNA的诱导表达

用实施例1的方法提取稻瘟病菌Guy11 RNA，然后反转录成cDNA作为模板，如表1所示，以稻瘟病菌MoCytb基因的dsRNA的上下游引物序列(MoCytb-F-SacⅠ、MoCytb-R-XhoⅠ)进行PCR扩增模板，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸30-60s/kb，共32个循环，72℃条件下延伸5min，PCR扩增产物进行电泳后切胶回收产物，用SacⅠ和XhoⅠ(TaKara)对纯化产物(GFP、MoCytb)与L4440载体分别进行双酶切。使用PCR纯化试剂盒(Axygen)对酶切产物进行纯化，使用T4 DNA Ligase将靶标基因片段与L4440载体过夜连接，最后将连接产物转化到大肠杆菌HT115(DE3)中。经克隆筛选，单菌株测序正确后，保存甘油菌。

将上述含有目标重组载体的甘油菌以体积比为1：100的比例加入含有氨苄和四环素抗性(12.5μg/mL Tet

其中，本实施例制备的dsRNA

实施例7

dsRNA处理降低稻瘟病菌的致病性

将水稻(日本晴)种子用70％酒精浸泡1min杀菌，将灭菌后的种子用无菌水冲洗4-6次，将水稻种子放入铺满滤纸的玻璃皿中，然后加入刚好没过种子的ddH

体外sRNA喷雾侵染：配制2×10

用本实施例dsRNA

本发明可以使用试剂盒合成dsRNA、也可以使用体外诱导合成dsRNA。试剂盒提取的dsRNA更纯，体外诱导合成dsRNA适用于大规模使用。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种抑制稻瘟病菌的关键基因、dsRNA及其制备和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagaatat taaaaagtca ttcattatta aaattagtga attcttacct tatcgatgcg 60

tcacaaccaa gtaacattag ttacttgtga aattttggtt cattattagc tgtttgttta 120

atagtacaaa ttattaccgg tattacatta gctatgcatt atagtcctag tgtaatggaa 180

gcttttaact caatagagca tataatgaga gatgttaata acgggtgatt agttcgttat 240

ctacatagta atacagcttc tgctttcttt ttcttagtgt atttacacat aggaagaggt 300

atatattacg gatcatatag agctcctcgt actttagttt gagctattgg tactgttata 360

ttaatattaa tgatggctat cggtttccta ggttatgttt taccttatgg acagatgtca 420

ttatgaggtg ctacagttat tactaatctt attagtgcta taccttgaat agggcaagat 480

attgttgaat tcatttgagg tggtttttct gttaataatg ccactttaaa cagatttttt 540

gcattacatt ttgtattgcc ttttgtatta gctgctttag ttttaatgca cttaattgca 600

cttcatgata ctgctggttc aagcaatcct cttggtgttt caggtaatta cgatagaatt 660

acatttgctc catatttttt atttaaagat ttaattacta tttttatatt tatttttgta 720

ttaagtgctt ttgtattctt tatgcctaat gttttagggg atagtgataa ttatattatg 780

gctaatccta tgcaaactcc tgctgctatt gtacctgaat gatacttatt acctttctat 840

gctattttaa gatctatacc taataaatta ttaggtgtta tagcgatgtt tagtgctatt 900

ttagctatta tgttattacc tgttacagat ttaggtagat ctagaggttt acaatttaga 960

ccatttagta aaatagcttt ctgagttttt gttgctaatt tcttagtttt aatgcaatta 1020

ggtgctaaac acgttgaaga tccatttata ttattaggtc aattaagtac tgtattatac 1080

tttagttatt ttgttgctat attaccttta gctagttact tagataatag tttaactgat 1140

ttatctaata aatctgaatt atttttaaat aaaactaact aa 1182

<210> 2

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagaatat taaaaagtca ttcattatta aaattagtga attcttacct tatcgatgcg 60

tcacaaccaa gtaacattag ttacttgtga aattttggtt cattattagc tgtttgttta 120

atagtacaaa ttattaccgg tattacatta gctatgcatt atagtcctag tgtaatggaa 180

gcttttaact caatagagca tataatgaga gatgttaata acgggtgatt agttcgttat 240

ctacatagta atacagcttc tgctttcttt ttcttagtgt atttacacat aggaagaggt 300

atatattacg gatcatatag 320

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttgaata ccaatacact gaagggcaca gcgaagctat ctgctgtaaa gggcttgcta 60

gataaactca ctctcgactt gaaggaacac aatctctcct cgcaagagcg tgacgcggcg 120

ctcgagcagt tgaaagttta tgggagagac cctcgtgatg cagagcccat ctttacaaag 180

gaggggatat cgacgctggc cgcgcactcc ttcgatggat cgtcggacac aacatccaga 240

aatgcgctcc gctgcctggc gaatgcaatg cttcttcaac ccagctcccg ccaagagctc 300

gttgatcttg gatatcacat caaggcatgt gctaagcttg caagtgatag ctgggacgac 360

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gaagacgatg aagatggtga cgagaataac aagaaagtgg agcaaaagta g 1431

<210> 4

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgctcgagc agttgaaagt ttatgggaga gaccctcgtg atgcagagcc catctttaca 60

aaggagggga tatcgacgct ggccgcgcac tccttcgatg gatcgtcgga cacaacatcc 120

agaaatgcgc tccgctgcct ggcgaatgca atgcttcttc aacccagctc ccgccaagag 180

ctcgttgatc ttggatatca catcaaggca tgtgctaagc ttgcaagtga tagctgggac 240

gacgagttcc tggtttcacg ggtgctgatg ctggcagcaa atgccagaaa catcaatcac 300

gagatattga ttacacaaca tggccttgca gagcttattg ctgcaaggtt agagagtcat 360

atgcgctttt taccagatga ggactcaagc ccgaacacca 400

<210> 5

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcttgca tcagcagaag ccgcgcttta tttcaaatcc ggtcgcttgc atcatcgtcg 60

cacttgcccc tcccaaagct gcgcccctca cccgccatct acaaaagcgc aaacaagacc 120

gcgttcaacg catcgccgtc cacgtcgcaa tcagcaacaa ccaccagagg attcagatcg 180

accgccgcaa aaatgactgt ccacaacctt accaacgccc aggatttcaa ggacgccctc 240

aagtcccaca agttcgtcct cgtcgacttt ttcgccacat ggtgtggacc ttgcagggcc 300

atcgccccca agatcgccga gtggtccgat gcgttcccca acatccacta cgtcaaggtc 360

gacgtcgacg aggtccctga tgtcgcccag gagtacaacg tccgcgccat gccgacattc 420

ctgctcttca aggatggaga gaaggtggac gaggttgttg gcgccaaccc acccaagctg 480

caggccctca tcagcgcaaa ccacccgtcg tcatag 516

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctcacccgc catctacaaa agcgcaaaca agaccgcgtt caacgcatcg ccgtccacgt 60

cgcaatcagc aacaaccacc agaggattca gatcgaccgc cgcaaaaatg actgtccaca 120

accttaccaa cgcccaggat ttcaaggacg ccctcaagtc ccacaagttc gtcctcgtcg 180

actttttcgc cacatggtgt ggaccttgca gggccatcgc ccccaagatc gccgagtggt 240

ccgatgcgtt ccccaacatc cactacgtca aggtcgacgt cgacgaggtc cctgatgtcg 300

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggccgacg actgggacac cgttaccaag atcggaagca gggtcggcgg cggtggtggc 60

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aaatag 486

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<212> DNA

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gccctcgagg acctttatga atcactcgat gtcccagata cagacattag atcggcctgg 300

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