一种检测啤酒发酵过程中常见污染菌的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种crRNA组合、检测细菌的试剂盒及其应用，还公开了一种非诊断目的的检测方法。所述crRNA组合包括分别来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的crRNA，上述菌为三种啤酒常见污染菌。所述检测方法可检测三种啤酒常见污染菌；其包括以下步骤：(1)获得供检测的核酸；(2)利用所述的试剂盒，检测所述供检测的核酸，即将供检测的核酸、crRNA组合、ssDNA报告系统和Cas12蛋白于35～40℃反应15～30min。本发明系首次采用Cas12检测三种啤酒常见污染菌，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势，本发明基于Cas12的检测方法便于一线工厂对啤酒常见污染菌进行核酸的快速检测。

说明书

技术领域

本发明属于啤酒技术领域，涉及一种检测啤酒发酵过程中常见污染菌的方法及试剂盒，特别涉及一种基于Cas12核酸检测技术的检测啤酒发酵中三种常见污染菌的方法及试剂盒。

背景技术

啤酒是由纯啤酒酵母发酵而来的，在发酵生产过程中，微生物污染会导致发酵失败，影响食品安全，带来巨大的损失。因此，对污染微生物的控制和快速检测至关重要。引起啤酒发酵失败的微生物主要包括：细菌，霉菌，野生酵母[S.Esmaeili,et al.,The commonspoilage microorganisms of beer:Occurrence,defects,and determination-areview.2015.7:p.68-73]。值得注意的是，90％以上的啤酒发酵污染事件由细菌引起，其中，乳短杆菌(L.brevis)、林氏乳杆菌(L.lindneri)、有害片球菌(P.damnosus)是三种最主要的引起啤酒污染的细菌，所有细菌污染事件中，90％左右的细菌污染事件由这三种细菌的不同菌株引起[S.Esmaeili,et al.,The common spoilage microorganisms of beer:Occurrence，defects，and determination-a review.2015.7:p.68-73；P.Preissler,J.Behr,and R.Vogel,Detection of Beer-spoilage Lactobacillus brevis strains byReduction of Resazurin.Journal of the Institute of Brewing,2010.116；L.Jespersen and M.Jakobsen,Specific spoilage organisms in breweries andlaboratory media for their detection.Int J Food Microbiol,1996.33(1):p.139-55]。

传统上对于啤酒污染菌的检测主要是培养鉴定法，这种方法耗时比较长，只能定性不能定量，依靠这种方法，啤酒发酵技术人员很难从中汲取经验，为长期的预防和控制做出精准有效的策略。而且一些体外培养困难的细菌也大大限制了这种传统方法的应用。目前，许多基于核酸分析的细菌检测技术被开发并广泛应用。例如，基于特异核酸序列的荧光原位杂交，16S rDNA基因测序，芯片检测等[X.Wang,X.Shang,and X.Huang,Next-generation pathogen diagnosis with CRISPR/Cas-based detection methods.EmergMicrobes Infect,2020.9(1):p.1682-1691；X.X.Lu,et al.,16S rRNA gene sequencingfor pathogen identification from clinical specimens.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008.88(2):p.123-6；C.M.Knox,V.Cevellos,and D.Dean,16S ribosomal DNA typingfor identification of pathogens in patients with bacterial keratitis.J ClinMicrobiol,1998.36(12):p.3492-6]。基于核酸的检测方法在灵敏度、特异性和时效性方面具有明显的优势，但由于设备昂贵或操作技巧复杂，这些方法的应用还存在一定的局限性。因此，发展更加灵敏、特异、简便、快速的检测技术仍有重要的需求。

近年来，基于CRISPR/Cas的核酸检测技术因其灵敏度高、特异性高、简单、省时等特点而显示出巨大的优势而得到开发利用[M.Wang,R.Zhang，and J.Li,CRISPR/cassystems redefine nucleic acid detection:Principles and methods.BiosensBioelectron,2020.165:p.112430]。CRISPR-Cas(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats,CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域[J.S.Chen,et al.,CRISPR-Cas12a target bindingunleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.Science,2018.360(6387):p.436-439]。Cas12酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR/Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性[J.S.Chen,et al.,CRISPR-Cas12a targetbinding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.Science,2018.360(6387):p.436-439]。

在检测靶位点的选择方面，16S rDNA基因序列作为细菌鉴定和分类中最常用的标记分子由可变区和保守区组成，而且16S rDNA基因序列分析已成为鉴定菌株的常用标准。16S rDNA基因长度约为1500bp，提供了足够的遗传信息可供利用。16S rDNA基因序列在同一菌种的不同菌株中高度保守，在不同菌种之间又存在差异，因此需在16S rDNA基因序列中选取特异的靶向位点用于细菌检测技术的开发。

发明内容

为解决现有技术中缺乏快速准确检测啤酒发酵污染菌，尤其是三种最常见啤酒污染菌Lactobacillus brevis(缩写为L.brevis)、Lactobacillus lindneri(缩写为L.lindneri)和Pediococcus damnosus(缩写为P.damnosus)的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的检测啤酒发酵过程中常见污染菌的方法及试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种crRNA组合，其包括来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)和/或林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的crRNA；其中，

(i)检测短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的crRNA选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3；

(ii)检测有害片球菌(Pediococcus damnosus)的crRNA选自SEQ ID NO:6和SEQID NO:8；

(iii)检测林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的crRNA选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

上述crRNA组合中每一个单独的crRNA也可用于各自来源的细菌的检测，因此在本发明中术语“crRNA组合”可仅含一个crRNA。由此，本发明提供了(i)来自短乳杆菌(L.brevis)的crRNA，其核苷酸序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。本发明提供了(ii)来自有害片球菌(P.damnosus)的crRNA，其核苷酸序列选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。本发明提供了(iii)来自林氏乳杆菌(L.lindneri)的crRNA，其核苷酸序列选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。同时，本发明还提供了检测短乳杆菌(L.brevis)、有害片球菌(P.damnosus)、林氏乳杆菌(L.lindneri)其中两种菌例如短乳杆菌(.brevis)、有害片球菌(P.damnosus)，或短乳杆菌(L.brevis)、林氏乳杆菌(L.lindneri)，或有害片球菌(P.damnosus)、林氏乳杆菌(L.lindneri)的crRNA组合，以及检测所有三种菌的crRNA组合。

为了解决上述技术问题，本发明的第二方面提供了一种检测细菌的试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的crRNA组合。

优选地，所述试剂盒还包括ssDNA报告系统和/或Cas12蛋白，所述Cas12蛋白例如为Cas12a。

更优选地，所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于荧光检测的ssDNA FQreporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：6FAM-TTTATTT-BHQ1(5’→3’)，命名为ssDNA FQreporter：6FAM-TTTATTT-BHQ1(5’→3’)。

在一些较佳的实施例中，所述试剂盒还包括用于扩增短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)和/或林氏乳杆菌(Lactobacilluslindneri)的引物。

更佳地，所述引物包括：

(a)扩增短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的引物对L.brevis-RPA-F和L.brevis-RPA-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示；

(b)扩增有害片球菌(Pediococcus damnosus)的引物对P.damnosus-RPA-F和P.damnosus-RPA-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示；

(c)扩增林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的引物对L.lindneri-RPA-F和L.lindneri-RPA-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示；

进一步更佳地，所述扩增为等温扩增。

在一些较佳的实施例中，所述的试剂盒还包括RNase抑制剂和缓冲液；所述缓冲液可用于完成所述扩增，包括但不限于NEBuffer

为了解决上述技术问题，本发明的第三方面提供了一种非诊断目的的检测方法，其中所述检测方法可检测短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、有害片球菌(Pediococcusdamnosus)和/或林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)；其包括以下步骤：

(1)获得供检测的核酸；

(2)利用如本发明第二方面所述的试剂盒，检测所述供检测的核酸，即将供检测的核酸、crRNA组合、ssDNA报告系统和Cas12蛋白于35～40℃反应15min～2h，优选37℃反应15～30min。

本发明获得供检测的核酸可通过培养富集，提取啤酒污染菌的基因组DNA模版获得。

较佳地，步骤(2)中，所述反应具有以下体系：

其中X为0～14的非0正数、1～10的非0正数，或1～5的非0正数，例如1、2、3、4、5。X值由所述供检测的核酸的浓度决定，当所述核酸的浓度越高，则X值相对较低；当所述核酸的浓度越低，则X值相对较高；具体地，本领域技术人员可通过检测所述核酸的浓度，决定用于反应体系的核酸的量。

更佳地，所述检测方法还包括以下步骤：

(3)利用酶标仪分析，或在荧光灯下肉眼判读核酸检测结果。

本发明提供的基于Cas12的啤酒污染菌核酸快速检测技术既可利用酶标仪荧光检测也可以利用荧光肉眼检测。本发明中ssDNA FQ reporter，当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485nm-520nm；当使用肉眼直接检测时，选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。

在使用荧光检测时，当Cas12检测体系中存在特定的16S rDNA核酸序列，会由在16S rDNA特异性crRNA介导下特异性激活Cas12蛋白的核酸内切酶活性。激活后的Cas12蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数或经485nm激发光激发产生肉眼可见的绿色荧光。相对应的，待检测样品中不存在特定的16S rDNA核酸序列时，不会有荧光读数或激发的绿色荧光。

在一些优选的实施例中，步骤(1)中，所述供检测的核酸由以下步骤制备：

(A)使用DNA提取试剂盒提取待测样本的总DNA；

(B)使用如本发明第二方面所述试剂盒中的引物扩增获得供检测的核酸；所述扩增优选为等温扩增。

较佳地，步骤(B)中，将所述引物、总DNA加入等温扩增体系，在35～40℃反应15min以上，例如在37～39℃反应25min；

更佳地，所述等温扩增体系为50μL体系，其包括nμL DNA样品，(18.5-n)μL ddH

为了解决上述技术问题，本发明的第四方面提供了如本发明的第一方面所述crRNA组合或本发明的第二方面所述试剂盒在制备检测细菌的诊断剂中的应用，其中，所述细菌为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)和/或林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)。

优选地，所述细菌来自啤酒发酵过程。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过利用Cas12特异识别核酸荧光检测技术，实现对三种常见啤酒污染菌的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。相较于灵敏度不高、特异性不强、耗时耗力的传统培养检测方法，本发明可以特异的区分三种最常见的啤酒污染菌，而且获得细菌组的DNA后检测时间可缩短到45min。

(2)本发明利用Cas12特异识别核酸荧光检测技术，所需要的设备非常简单，不需要其他基于PCR检测技术的PCR仪。本发明使检测成本大大降低，操作简便，为基层实验和工业一线提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

(3)本发明公开了一系列用于啤酒最常见污染菌L.brevis、L.lindneri、P.damnosus核酸检测的crRNA组合与含其的试剂盒，crRNA的序列如表2所示。本发明系首次采用Cas12荧光法检测啤酒污染菌，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于Cas12的检测方法便于基层实验和工业一线对啤酒污染菌的快速检测和鉴定诊断。

附图说明

图1为基于Cas12快速检测啤酒发酵污染菌的方法示意图；

图2为L.brevis crRNA靶向序列在种内的保守性以及种间差异性分析；

图3为P.damnosus crRNA靶向序列在种内的保守性以及种间差异性分析；

图4为L.lindneri crRNA靶向序列在种内的保守性以及种间差异性分析；

图5为基于Cas12快速检测啤酒发酵污染菌的工作效率；

图6为基于Cas12快速检测啤酒发酵污染菌的特异性；

图7为基于Cas12快速检测啤酒发酵污染菌的灵敏性；

图8为基于Cas12可视荧光法高特异性检出啤酒污染菌；

图9为基于Cas12可视荧光法从多种细菌混合物中高特异性检出啤酒污染菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中：RPA扩增试剂盒

本发明的总体技术示意图如图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、Cas12检测成分设计制备和体系构建和荧光检测。

实施例1：啤酒污染菌16S rDNA基因片段快速灵敏检测

1.1核酸制备

本实施例中三种常见啤酒污染菌L.brevis、L.lindneri、P.damnosus的16S rDNA基因中被靶向选择的序列部分由南京金斯瑞公司合成，命名为P.damnosu-16S、L.brevis-16S、L.lindneri-16S，对应序列分别为SEQ ID NO:15～17。

合成的16S rDNA通过PCR扩增纯化后测量基因序列的质量和浓度，并保存在-80℃直至使用。扩增所需的引物对应序列分别为SEQ ID NO:18～23，如表1所示。

表1合成的16S rDNA扩增所用引物

1.2针对三种细菌特异性crRNA的设计制备

针对三种细菌特异性crRNA制备按照如下方案进行，针对三种啤酒污染菌的16SrDNA第一和第二可变区基因序列，寻找包含Cas12识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA。crRNA靶向位点的选择需要满足含有PAM识别序列，靶向识别信号较强，且还要满足此序列在种内不同菌株之间尽量保守以便更广泛的识别此种细菌的不同菌株，同时，此序列与其他两种细菌相比要有足够的差异以便更好的区分不同细菌种类。序列的设计和分析分别如图2、图3和图4所示。设计完成后，制备crRNA。crRNA的制备，交于南京金斯瑞公司合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA；或交由南京金斯瑞公司直接合成crRNA序列对应的RNA。

本发明提供的针对三种细菌的16S rDNA基因第一和第二可变区的crRNA包括SEQID NO:1～14，具体信息如表2所示：

表2针对三种常见啤酒污染菌16S rDNA核酸特异性crRNA

1.3等温扩增反应

本发明中，利用等温扩增(RPA)对三种细菌的16S rDNA核酸片段分别进行预扩增，以便进行Cas12检测反应。按照等温扩增反应要求，针对三种细菌分别设计并合成RPA扩增引物RPA-F(正向引物)和RPA-R(反向引物)，序列为SEQ ID NO:24～29。参考RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：等温扩增在50μL反应体系进行。将nμL DNA样品，(18.5-n)μL ddH

表3针对三种细菌的16S rDNA核酸片段特异性RPA引物序列

1.4本实施例中，啤酒污染菌检测采用20μL体系如表4所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表4啤酒污染菌Cas12检测体系

1.5全波长酶标仪荧光检测

酶标仪荧光检测中，Cas12对目的基因检测体系依次加入2μL Buffer、1μL RNase抑制剂、1μL Cas12、1μL ssDNA FQ reporter、5μL RPA产物(即上表4中供检测的核酸)、1μLcrRNA和9μL H

首先，依次检测针对三种啤酒污染菌16S rDNA核酸片段的crRNA工作效率。在Cas12检测体系中，各加入1μL crRNA，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行后续结果检测判定。

利用荧光检测判定Cas12检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测30min荧光数值为反应值。其反应检测结果如图5。结果显示：在L.brevis模拟检测中L.brevis-crRNA-1，2，3检测信号明显强于L.brevis-crRNA4，5；在P.damnosus模拟检测中P.damnosus-crRNA1，2，3检测信号明显强于P.damnosus-crRNA4，5；在L.lindneri模拟检测中L.lindneri-crRNA1，2，3检测信号明显强于L.lindneri-crRNA4，5；因此选择检测检测信号较强的crRNA用于以下的实验。

本发明检测体系中，选择可高效检测对应细菌的16S rDNA基因片段的crRNA。

其次，鉴定所设计的crRNA识别靶向细菌特异性。针对每种细菌的3条高效crRNA序列分析如图2～4所示，在检测L.brevis的体系中将检测，将高效识别L.brevis 16S rDNA的3条crRNA与P.damnosus和L.lindneri的16S rDNA等比例片段混合物一起反应(图6A)；将高效识别P.damnosus 16S rDNA的3条crRNA与L.brevis和L.lindneri的16S rDNA等比例片段混合物一起反应(图6B)；将高效识别L.lindneri 16S rDNA的3条crRNA与L.brevis和P.damnosus的16S rDNA等比例片段混合物一起反应(图6C)；同时取各组中60min荧光数值(图6D)。

结果如图6所示，鉴于本实施例中，针对L.brevis的crRNA2(图6的A)，针对P.damnosus crRNA2(图6的B)，针对L.lindneri的crRNA3(图6的C)除了能够识别自身细菌的16S rDNA片段外，对于其他两种细菌也有交叉反应，而另外两条crRNA具有相似的检测效果，并且与其他两种细菌没有交叉反应(图6的D)。

因此，将针对L.brevis 16S rDNA基因的L.brevis-crRNA1和L.brevis-crRNA3等比例混合获得L.brevis-crRNAmix；将针对P.damnosus 16S rDNA基因的P.damnosus-crRNA1和P.damnosus-crRNA2等比例混合获得P.damnosus-crRNAmix；针对L.lindneri 16SrDNA基因的L.lindneri-crRNA1到L.lindneri-crRNA3等比例混合获得L.lindneri-crRNAmix；图6的E中，实验结果显示混合在一起的crRNA比单一crRNA信号略强，后续检测中，L.brevis-crRNAmix检测L.brevis，P.damnosus-crRNAmix检测P.damnosus，L.lindneri-crRNAmix检测L.lindneri。

实施例2：基于酶标仪荧光检测，高灵敏度地检测细菌16S rDNA片段

本实施例中，为测定Cas12荧光法在细菌16S rDNA检测中的灵敏度，进行以下检测。

首先，根据L.brevis、P.damnosus、L.lindneri的16S rDNA基因片段对应DNA片段样品(依据其碱基数目和质量浓度)计算检测片段的拷贝数目，并进行10倍梯度稀释，获得每微升含有1E10、1E9、1E8、1E7、1E6、1E5、1E4、1E3、1E2、1E1和1E0拷贝数(copy/μL)的测试样品。对上述稀释样品进行Cas12特异性反应，参照实施例1中检测步骤进行检测。操作简述如下：1μL梯度稀释样品，加入到50μL RPA等温扩增反应体系进行扩增。取10μL等温扩增产物，加入到20μL Cas12荧光核酸检测体系，混合均匀，37℃反应30min，测量荧光数值。

本实施例中，检测结果如图7的A所示：未经RPA扩增前，本方法只可检测到1E9拷贝数目的DNA样本，联合RPA后检测结果如图7的B所示：采用酶标仪，应用Cas12荧光法配合RPA对目标序列进行预扩增可检测三种啤酒腐败菌，并可实现对10拷贝核酸片段的高灵敏度检出。

实施例3：基于Cas12荧光法高特异性检出啤酒污染菌

本实施例中，为检测Cas12荧光法能否对啤酒污染菌进行高特异检出，进行以下检测。

首先，选取本发明中需要检测的L.brevis、P.damnosus、L.lindneri三种细菌中的L.brevis(两株)和P.damnosus(一株)，以及一株L.casei，一株E.coli共5株细菌分别按照其培养条件培养富集后提取基因组DNA。

其次，参照实施例1，通过RPA反应，利用L.brevis，P.damnosus的RPA引物分别对5种细菌进行扩增制备所选株细菌的检测样品，并用L.brevis-crRNAmix和P.damnosus-crRNAmix对5个检测样品分别进行检测。

在荧光检测中，在Cas12检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μLRNase抑制剂、1μLCas12、1μL ssDNA FQ reporter、1μL crRNA和10μL检测样品。各组分混合均匀，在37℃反应15min。本检测体系中，RNase抑制剂浓度为40U/μL，Cas12浓度为200ng/μL，ssDNA FQreporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1μM。

本实施例中，在Cas12检测体系在37℃反应开始后，每隔5min可以在485nm激光灯下，用肉眼对检测产物荧光反应进行判读。检测结果如图8所示，图中显示了15min的荧光照片以及30min内荧光变化趋势。本实施例中L.brevis-crRNAmix和P.damnosus-crRNAmix在Cas12荧光法中可高特异地分别检出L.brevis(图8的A)和P.damnosus(图8的B)，而对其他种属的细菌没有交叉反应。

实施例4：Cas12荧光法从多种细菌混合物中快速特异地检出啤酒污染菌

本实施例的实验方案和结果如图9所示，首先如9C中的方案将实施例3中的细菌基因组核酸进行多种组合形式的混合。

首先，每个待检测的混合样品取5μL进行RPA预扩增，步骤与实施例1中相同，获得Cas12检测样品。

在Cas12检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL RNase抑制剂、1μL Cas12、1μLssDNA FQ reporter、10μL RPA产物、1μL crRNA。各组分混合均匀，在37℃反应30min，每5min拍照记录一次荧光照片。

本实施例中，荧光灯下肉眼可有特异检出混合样品中的L.brevis(图9的A)和P.damnosus(图9的B)。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海科技大学

<120> 一种检测啤酒发酵过程中常见污染菌的方法及试剂盒

<130> P21011994C

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-crRNA1

<400> 1

aacaatgaag cgagtggcga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-crRNA2

<400> 2

ttgttatacg gtattagcac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-crRNA3

<400> 3

tttgaaaggt ggcttcggct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-crRNA4

<400> 4

ccacgtgtta ctcaccagtt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-crRNA5

<400> 5

caagtgttat cccctgcttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-crRNA1

<400> 6

tagttgaaat catcttcgat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-crRNA2

<400> 7

ttatgcggta ttagcatctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-crRNA3

<400> 8

tttttaaaag atggcttcgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-crRNA4

<400> 9

gttgattgaa ttagagatgc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> P.damnosus-crRNA5

<400> 10

aggtgttatc ccccacttc 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-crRNA1

<400> 11

aaacgagaac catgtggttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-crRNA2

<400> 12

aaagatggct tttatgctat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-crRNA3

<400> 13

tgctatcgct tctggatgga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-crRNA4

<400> 14

caggtgttat ccccttcttc 20

<210> 15

<211> 578

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosu-16S

<400> 15

gtataatatg agagtttgat cttggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg 60

caagtcggac gcactttcgt tgattgaatt agagatgctt gcatcgaaga tgatttcaac 120

tataaagtga gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccaga agtgggggat 180

aacacctgga aacagatgct aataccgcat aataaaatga accgcatggt ttatttttaa 240

aagatggctt cggctatcac ttctggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgagat 300

aaaggctcac caaggctgtg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga 360

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg aaatcttcca caatggacga 420

aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggcttt agggtcgtaa aactctgttg 480

ttggagaaga acgtgtgtga gagtaactgc tcatgcagtg acggtatcca accagaaagc 540

cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgta 578

<210> 16

<211> 568

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-16S

<400> 16

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcatgc ctaatacatg caagtcgaac 60

gagcttccgt tgaatgacgt gcttgcactg atttcaacaa tgaagcgagt ggcgaactgg 120

tgagtaacac gtgggaaatc tgcccagaag caggggataa cacttggaaa caggtgctaa 180

taccgtataa caacaaaatc cgcatggatt ttgtttgaaa ggtggcttcg gctatcactt 240

ctggatgatc ccgcggcgta ttagttagtt ggtgaggtaa aggcccacca agacgatgat 300

acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 360

acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaatgccgc 420

gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac acctttgaga 480

gtaactgttc aagggttgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 540

gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgt 568

<210> 17

<211> 575

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-16S

<400> 17

taaaatgaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgttggc ggcgtgccta atacatgcaa 60

gtcgaacgag gtctcctaac tgatagctgg tgcttgcatc agcttgacga tagatctgac 120

cgagtggcga actggtgagt aacacgtggg taacctgccc agaagaaggg gataacacct 180

ggaaacagat gctaataccg tataacaacg agaaccacat ggttctcgtt tgaaagatgg 240

cttttatgct atcgcttctg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt gagataatag 300

ctcaccaagg caatgatacg tagcagacct gagagggtaa tctgccacaa tgggactgag 360

acacggccca tactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc 420

tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaga 480

gaagaacgac cgtgagagca actgctcacg gtgtgacggt atctaaccag aaagtcacgg 540

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagg 575

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-16S-F

<400> 18

gtataatatg agagtttgat c 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-16S-R

<400> 19

tacgtattac cgcggctgct g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-16S-F

<400> 20

agagtttgat cctggctcag g 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-16S-R

<400> 21

acgcttgcca cctacgtatt ac 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-16S-F

<400> 22

taaaatgaga gtttgatcct ggc 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-16S-R

<400> 23

cctacgtatt accgcggctg c 21

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-RPA-F

<400> 24

caagtcgaac gagcttccgt tgaatgacgt gcttgc 36

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.brevis-RPA-R

<400> 25

cgccgcggga tcatccagaa gtgatagccg aagcc 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-RPA-F

<400> 26

tgcctaatac atgcaagtcg gacgcacttt cgttg 35

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P.damnosus-RPA-R

<400> 27

gcgggtccat ccagaagtga tagccgaagc cat 33

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-RPA-F

<400> 28

cttgcatcag cttgacgata gatctgaccg agt 33

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> L.lindneri-RPA-R

<400> 29

tctcaggtct gctacgtatc attgccttgg tga 33