一种基于核心基因组SNP矩阵快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法

摘要

本发明公开了一种基于核心基因组SNP矩阵快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法。该方法具体为：检测待测鼠疫耶尔森菌基于50个SNP位点的基因型，如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中某种群基于50个SNP位点的基因型完全一致，则待测鼠疫耶尔森菌属于该种群；如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中的任一个基于50个SNP位点的基因型均不一致，则待测鼠疫耶尔森菌不属于23个种群。本发明实现对鼠疫菌的精准溯源，有效加强鼠疫菌的监控力度，在第一时间准确确定来源，防止传染病的进一步传播。本发明具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种基于核心基因组SNP矩阵快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法。

背景技术

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病，是以发病急、传播快、病死率高、传染性强为特征的烈性传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病。鼠疫菌的主要宿主是啮齿类动物，通过蚤叮咬等途径传播给人，可引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫。其中肺鼠疫发病迅猛，可通过空气在人间直接传播，如不采取治疗措施病死率高达100％。因此，鼠疫菌也是最危险的细菌性生物战剂之一，是国际恐怖分子可能获得的廉价而方便的资源，对国家安全、社会和谐和稳定发展构成了巨大威胁。

我国共有12块鼠疫自然疫源地，占国土总面积15％，对鼠疫菌而言，我国可谓“地大菌博”，其鼠疫菌分离株与世界范围内其他地区相比，具有丰富的遗传多样性。一系列传统的分子生物学方法被开发出来用于获取鼠疫菌的基因组多态性数据，包括插入序列(insertion sequence，IS)方法、差异区段(different region，DFR)方法、基因组板块(genome plate)重排方法、间区规律聚积的短回文重复(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)方法和多位点串联重复序列分析(multiple loci VNTR analysis，MLVA)等，这些方法可以鉴定鼠疫菌基因组中部分等位基因发生的变异，但由于分辨率低，难以全面客观的反映整个物种的系统发育结构。

高通量测序技术的发展使得在短时间内获得大量细菌序列成为可能。结合高效的生物信息分析手段，高通量测序技术展现出传统实验室诊断方法无法比拟的优势。

发明内容

本发明的目的是鉴定待测鼠疫耶尔森菌种群。所述种群为23个种群中的至少一个。

本发明首先保护一种鉴定待测鼠疫耶尔森菌种群的方法，可包括如下步骤：检测待测鼠疫耶尔森菌基于50个SNP位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中某种群基于50个SNP位点的基因型完全一致，则待测鼠疫耶尔森菌属于该种群；如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中的任一个基于50个SNP位点的基因型均不一致，则待测鼠疫耶尔森菌不属于23个种群；23个种群分别为0.PE7、0.PE2、0.PE3、0.PE4、0.ANT1、0.ANT2、0.ANT3、1.ORI1、1.ORI2、1.ORI3、1.IN1、1.IN2、1.IN3、1.ANT、2.ANT1、2.ANT2、2.ANT3、2.MED1、2.MED2、2.MED3、3.ANT1、3.ANT2和4.ANT；

所述50个SNP位点的名称、在CO92染色体上的位置及其在各个种群中的基因型见下表；

上述方法中，50个SNP位点在CO92染色体上的位置是基于参考序列确定的。所述参考序列可为鼠疫菌CO92的基因组序列，基因组编号为GCF_000009065.1。

上述方法中，所述检测待测鼠疫耶尔森菌基于50个SNP位点的基因型的方法可如下：直接测序。

上述方法中，所述检测待测鼠疫耶尔森菌基于50个SNP位点的基因型的方法可如下：采用引物对待测鼠疫耶尔森菌的核酸进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物进行测序，从而评判待测鼠疫耶尔森菌基于50个SNP位点的基因型。

上述任一所述的方法在在鉴定待测鼠疫耶尔森菌种群中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述50个SNP位点在鉴定待测鼠疫耶尔森菌种群中的应用也属于本发明的保护范围。

检测上述任一所述50个SNP位点的基因型的物质在鉴定待测鼠疫耶尔森菌种群中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述检测50个SNP位点的基因型的物质可为引物。

上述应用中，所述检测50个SNP位点的基因型的物质还可为其它试剂，这些试剂的功能为鉴定SNP位点的基因型。试剂可为测序试剂或PCR扩增试剂。

上述任一所述的应用中，所述种群可为23个种群中的至少一种；所述23个种群分别为0.PE7、0.PE2、0.PE3、0.PE4、0.ANT1、0.ANT2、0.ANT3、1.ORI1、1.ORI2、1.ORI3、1.IN1、1.IN2、1.IN3、1.ANT、2.ANT1、2.ANT2、2.ANT3、2.MED1、2.MED2、2.MED3、3.ANT1、3.ANT2和4.ANT。

本发明还保护上述任一所述50个SNP位点。

进行上述任一的应用时，50个SNP位点在CO92染色体上的位置是基于参考序列确定的。所述参考序列可为鼠疫菌CO92的基因组序列，基因组编号为GCF_000009065.1。

本发明建立了一种基于核心基因组SNP矩阵快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法，该方法通过对目前已知的鼠疫耶尔森菌分离株进行全基因组测序，将核心基因组中鉴定的单核苷酸多样性(SNP)矩阵集合应用于鼠疫耶尔森菌基因组型别进行快速鉴定，追踪病原体来源，从而为生物恐怖袭击的确认和流行病学防护提供有力保障。本发明在对鼠疫菌进行初筛、确诊、分型的同时，在单碱基水平上获得鼠疫菌序列的差异性，从而实现对鼠疫菌的精准溯源，有效加强鼠疫菌的监控力度，在第一时间准确确定来源，防止传染病的进一步传播。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为鼠疫菌进化关系图及对应的50个群特异性SNP靶标位点信息。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法的建立

一、快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的SNP位点的筛选

1、从Genbank下载鼠疫菌CO92的基因组序列(基因组编号：GCF_000009065.1)作为参考序列。

2、本发明的发明人选取118株鼠疫菌，应用Illumina第二代测序技术进行深度测序，将测序结果与已报道的15株鼠疫菌全基因组序列和1株假结核菌株序列IP32953(基因组编号：GCA_000007885.1)进行了系统发育基因组学分析。

发明人选取的118株鼠疫菌和已报道的15株鼠疫菌的菌株名称、网站基因组编号等详见表1。

表1.本发明中用到的133株鼠疫菌

3、以步骤1的参考序列为基准，将步骤2的133株鼠疫菌序列与其进行全局比对，获得鼠疫菌的核心基因组；保留其具有不同碱基类型的关键位点(共得到2298个SNP位点)，并形成相应的SNP矩阵(即鼠疫菌的核心基因组SNP矩阵)。

以鼠疫菌祖先假结核的一个参考基因组IP32953(基因组编号：GCA_000047365.1)作为参考，定位鼠疫菌的祖先状态。

4、筛选特异性靶标位点

本发明的发明人经过大量实验，从鼠疫菌的核心基因组SNP矩阵中筛选出可以区分23个种群的50个特异性靶标位点。23个种群分别为0.PE(即0.PE7、0.PE2、0.PE3、0.PE4)、0.ANT(即0.ANT1、0.ANT2、0.ANT3)、1.ORI(即1.ORI1、1.ORI2、1.ORI3)、1.IN(即1.IN1、1.IN2、1.IN3)、1.ANT、2.ANT(即2.ANT1、2.ANT2、2.ANT3)、2.MED(即2.MED1、2.MED2、2.MED3)、3.ANT(即3.ANT1、3.ANT2)和4.ANT。

50个特异性靶标位点的编号、在CO92染色体位置和在23个种群中的基因型分布见表2。种群名称记载于如下文献中：

表2.50个特异性靶标位点

5、聚类分析

根据23个种群基于50个特异性靶标位点的基因型，利用软件对23个种群进行聚类分析。

23个种群的聚类分析结果见图1。结果表明，基于50个特异性靶标位点的基因型可以完全区分23个种群。

由此可见，根据50个特异性靶标位点的基因型可以鉴定鼠疫耶尔森菌属于23个种群中的哪一个。

二、快速鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法的建立

本发明的发明人经过大量实验，建立了根据步骤一筛选出的50个特异性靶标位点的基因型鉴定鼠疫耶尔森菌种群的方法，具体步骤如下：

1、将待测鼠疫耶尔森菌进行高通量测序并拼接，得到拼接序列。

2、将拼接序列和参考序列进行比对，获得步骤一筛选出的50个特异性靶标位点的基因型。

3、根据步骤2的结果和表2，进行如下判断：如果待测鼠疫耶尔森菌的50个位点与23个种群中某种群基于相应特异性靶标位点的突变基因型完全一致，则待测鼠疫耶尔森菌属于该种群；如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中某种群基于相应特异性靶标位点的突变基因型均不一致，则待测鼠疫耶尔森菌不属于该种群。根据图1的进化树和表2，从根部(root)开始，依据50个特异性靶标是否与突变基因型一致，逐渐缩小目标种群范围，直到最终确定目标种群。

实施例2、实施例1建立的方法的准确性鉴定

待测鼠疫耶尔森菌为属于2.MED2群的鼠疫耶尔森菌。

1、将待测鼠疫耶尔森菌进行高通量测序并拼接，得到拼接序列。

2、将拼接序列和参考序列(基因组编号：GCF_000009065.1)进行比对，获得步骤一筛选出的50个特异性靶标位点的基因型。

检测结果见表3中第4列。

表3

3、根据表3进行如下判断：如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中某种群基于相应特异性靶标位点的突变基因型完全一致，则待测鼠疫耶尔森菌属于该种群；如果待测鼠疫耶尔森菌与23个种群中某种群基于相应特异性靶标位点的突变基因型均不一致，则待测鼠疫耶尔森菌不属于23个种群。

结果表明，待测鼠疫耶尔森菌与2.MED2群的特异性SNP靶标位点完全一致。因此，待测鼠疫耶尔森菌属于2.MED2群。检测结果与预期结果完全一致。

由此可见，实施例1建立的方法具有较高的准确性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。