野鸢尾黄素作为Wnt/β-catenin通路抑制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用

摘要

本发明公开野鸢尾黄素作为Wnt/β‑catenin通路抑制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。野鸢尾黄素通过对胶质瘤母细胞瘤细胞具有抑制其增殖和侵袭以及促进其凋亡和细胞周期阻滞的作用；野鸢尾黄素可以透过血脑屏障，抑制裸鼠颅内肿瘤的生长，侧重促进胶质瘤细胞中YAP表达量降低和Wnt/β‑catenin信号通路抑制的抗胶质瘤药物研究。野鸢尾黄素可用于制备治疗胶质瘤的药物，提高胶质瘤患者治疗水平，改善预后，进一步拓展了抗脑胶质瘤药物的研发进展。

说明书

技术领域

本发明属于脑胶质瘤药物研发领域，特别涉及野鸢尾黄素作为Wnt/β-catenin通路抑制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤之一，约占颅内肿瘤的45％。根据WHO分级，胶质瘤可分为I～IV级，III级和IV级为高级别胶质瘤，其中尤以多形性胶质母细胞瘤恶性程度最高。尽管GBM的治疗范围很广，包括手术、放疗和化疗，但其中位生存期约为12-14个月，5年生存期患者生存率仅为5.8％。替莫唑胺是目前治疗胶质瘤的一线化疗药物，但耐药性的产生限制了其疗效，因此针对脑胶质瘤治疗的药物研发是该领域研究的热点。

野鸢尾黄素是从中药射干中提取的活性化合物。射干是一种常见的中药，为鸢尾科射干属植物，主要入药部位为根茎。之前的研究表明，野鸢尾黄素具有如抗炎、抗氧化和神经保护作用等多种药理作用。近年来，已有多篇文献证明野鸢尾黄素具有显著的抗癌效果，包括抑制癌细胞增殖和转移、促进细胞凋亡、诱导线粒体凋亡和细胞周期阻滞，自噬以及细胞外基质降解。目前虽然已有研究证实野鸢尾黄素对胶质母细胞瘤具有抗癌作用，但野鸢尾黄素的药理作用广泛，抗肿瘤机制也仍未阐明。了解抗肿瘤药物的作用机制则更有利于临床上根据分子诊断选择合适的药物与疫病项匹配。

中药具有毒副作用小、价格相对便宜、疗效稳定持久等特点，与传统化疗药物相比具有良好的应用前景。榄香烯、姜黄素、槲皮素等是从中药材提取的单体化合物并广泛用于抗胶质瘤的研究。它们可以通过诱导胶质瘤细胞凋亡、抑制癌细胞增殖和转移等多种方法发挥抗胶质瘤作用。由于脑胶质瘤相较于其他部位实体瘤渗透强和血脑屏障的存在，药物很难起到杀伤肿瘤细胞的作用，但是野鸢尾黄素可以透过血脑屏障，在抗胶质瘤药物制备上具有良好的应用前景。

正如背景技术所介绍的，脑胶质瘤浸润性高，预后差，目前开发治疗胶质瘤的新型化疗药物仍面临如耐药性、毒性、无法穿越血脑屏障等困难。因此，研究和开发具有良好疗效和较低毒性的药物对脑胶质瘤的治疗具有重要意义。本发明提供了野鸢尾黄素作为活性成分在研发防治脑胶质瘤药物中的应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供野鸢尾黄素作为通过YAP介导的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供野鸢尾黄素在制备抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭、增殖和诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的药物产品中的应用。

本发明的第三个目的是一种治疗脑胶质瘤药物，其活性成分为野鸢尾黄素。

作为优选，还包括药物上可接受的载体；

作为优选，所述活性成分的重量百分比含量为1-99％。

作为优选，所述药物的剂型采用片剂、注射剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液或气雾剂，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中，按照药学领域的常规制备方法制备。

本发明的第四个目的是野鸢尾黄素在制备促进胶质瘤细胞中YAP表达量降低和Wnt/β-catenin信号通路抑制的药物产品中的应用。

本发明的第五个目的是一种通过YAP介导的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂，采用野鸢尾黄素。

本发明通过体外细胞试验证实了野鸢尾黄素对于脑胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用。本发明设计了在24h和48h下用不同浓度野鸢尾黄素处理胶质瘤细胞株，证实了野鸢尾黄素对于脑胶质瘤的抑制作用具有一定的浓度依赖性和时间依赖性。野鸢尾黄素抑制胶质母细胞瘤细胞DBTRG和C6效果显著，IC50值在20-50μM。以C6-Luc构建的原位脑胶质瘤裸鼠为模型，野鸢尾黄素采用灌胃的给药方式，剂量为20mg/kg/d，连续治疗19天，可以观察到野鸢尾黄素对治疗裸鼠颅内脑胶质瘤效果显著。

所述野鸢尾黄素制备的药物通过下调YAP的表达和抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性发挥抗胶质瘤的作用。在一定范围内，浓度越高对胶质瘤细胞中YAP、β-catenin、GSK-3β及相关凋亡分子和细胞周期相关分子的表达抑制作用越强。

本发明明确了野鸢尾黄素是否通过YAP介导的Wnt/β-catenin调控胶质母细胞瘤的发生发展。结果表明，野鸢尾黄素能抑制DBTRG和C6两种胶质母细胞瘤细胞株的增殖和侵袭。此外，本发明还探索了与调节胶质母细胞瘤细胞的细胞凋亡有关的Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2表达水平以及与细胞周期阻滞有关的Cyclin D1和Cyclin B1的表达水平。本发明的结果表明，野鸢尾黄素可以抑制YAP的表达水平，进而引起Wnt/β-catenin信号通路上GSK-3β、和β-catenin等分子的表达改变，导致该通路活性被抑制。通过本发明的研究，可以将野鸢尾黄素按照其作用机理运用到治疗胶质瘤的药物中。

与现有的一些化疗药物相比，野鸢尾黄素可以透过血脑屏障，作为中药的活性成分副作用低，疗效显著。

附图说明

图1为不同浓度野鸢尾黄素抑制胶质瘤细胞增殖实验结果柱状图；其中A表示脑胶质瘤DBTRG细胞-CCK-8细胞增殖实验，B表示脑胶质瘤C6细胞-CCK-8细胞增殖实验，C表示细胞克隆实验，D表示脑胶质瘤DBTRG细胞-细胞克隆实验结果统计，E表示脑胶质瘤C6细胞-细胞克隆实验结果统计，F表示细胞-PH3免疫荧光染色实验，G表示脑胶质瘤DBTRG细胞-PH3阳性细胞统计，H表示脑胶质瘤C6细胞-PH3阳性细胞统计。

图2为野鸢尾黄素抑制胶质瘤细胞迁移实验结果图；其中A表示细胞划痕实验，B表示脑胶质瘤DBTRG细胞-细胞划痕实验结果C表示脑胶质瘤C6细胞-细胞划痕实验结果D表示细胞transwell实验，E表示脑胶质瘤DBTRG细胞-细胞transwell实验结果，F表示脑胶质瘤C6细胞-细胞transwell实验结果。

图3为野鸢尾黄素诱导胶质瘤细胞周期阻滞实验结果图；其中A表示给药组和对照组流式细胞周期结果，B表示脑胶质瘤DBTRG细胞-细胞周期结果统计，C表示脑胶质瘤C6细胞-细胞周期结果统计，D表示给药组和对照组脑胶质瘤DBTRG细胞Cyclin B1蛋白的表达差异，E表示脑胶质瘤DBTRG细胞Cyclin B1蛋白表达的统计结果。

图4为野鸢尾黄素促进胶质瘤细胞凋亡实验结果图；其中A表示给药组和对照组流式细胞凋亡实验，B表示胶质瘤DBTRG细胞中凋亡细胞所占的百分比，C表示胶质瘤C6细胞中凋亡细胞所占的百分比，D表示细胞-Cleaved-caspase 3免疫荧光染色实验，E表示脑胶质瘤DBTRG细胞-Cleaved-caspase 3阳性细胞统计，F表示C6G细胞-Cleaved-caspase 3阳性细胞统计，G表示细胞PI染色实验，H表示脑胶质瘤DBTRG细胞中凋亡细胞所占的百分比，I表示脑胶质瘤C6细胞中凋亡细胞所占的百分比，J表示给药组和对照组脑胶质瘤DBTRG细胞Bcl-2，Bax，Cleaved-caspase 3蛋白的表达差异，K表示胶质瘤DBTRG细胞Bcl-2蛋白表达的统计结果，L表示胶质瘤DBTRG细胞Cleaved-caspase 3蛋白表达的统计结果，M表示胶质瘤DBTRG细胞Bax蛋白表达的统计结果。

图5为野鸢尾黄素抑制Wnt/β-catenin信号通路的实验结果图；其中A表示细胞-β-catenin免疫荧光染色实验，B表示脑胶质瘤DBTRG细胞-β-catenin的平均荧光强度统计，C表示脑胶质瘤C6细胞-β-catenin的平均荧光强度统计，D表示给药组和对照组脑胶质瘤DBTRG细胞β-catenin，p-β-catenin，GSK-3β蛋白的表达差异，E表示脑胶质瘤DBTRG细胞β-catenin蛋白表达的统计结果，F表示脑胶质瘤DBTRG细胞p-β-catenin蛋白表达的统计结果，G表示脑胶质瘤DBTRG细胞GSK-3β蛋白表达的统计结果，H表示脑胶质瘤DBTRG细胞Cyclin D1蛋白表达的统计结果，I表示脑胶质瘤DBTRG细胞GSK-3βmRNA表达的统计结果。

图6为野鸢尾黄素降低胶质瘤细胞中YAP表达的实验结果图；其中A表示细胞-YAP免疫荧光染色实验，B表示脑胶质瘤DBTRG细胞-YAP的平均荧光强度统计，C表示脑胶质瘤C6细胞-YAP的平均荧光强度统计，D表示给药组和对照组脑胶质瘤DBTRG细胞YAP，p-YAP蛋白的表达差异，E表示脑胶质瘤DBTRG细胞YAP/p-YAP蛋白表达的统计结果。图7为野鸢尾黄素对裸鼠颅内肿瘤抑制作用研究的实验结果图；其中A表示给药组和实验组小鼠颅内肿瘤生物发光的强度变化，B表示从给药开始到结束小鼠颅内肿瘤生物发光的强度统计，C表示给药结束时小鼠颅内肿瘤生物发光的平均强度统计，D表示从给药开始到结束小鼠体重变化的统计E表示给药组和对照组小鼠脑切片β-catenin、YAP和Cleaved-caspase3的免疫组化染色结果。

图8为在胶质瘤细胞中过表达YAP可以逆转野鸢尾黄素抗胶质瘤作用的实验结果图；其中A表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞-CCK-8细胞增殖实验结果，B表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞-PH3免疫荧光染色的结果，C表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞-PH3阳性细胞的结果统计，D表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞transwell实验E表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞透过小室的细胞的结果统计，F表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞划痕实验，G表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞划痕实验结果统计，H表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞YAP、β-catenin、GSK-3β蛋白的表达差异，I表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞YAP蛋白表达的差异统计，J表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞β-catenin蛋白表达的差异统计，K表示转染YAP过表达质粒24h后并给药脑胶质瘤C6细胞GSK-3β蛋白表达的差异统计。

具体实施方式

以下是本发明附图的阐述，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

(1)细胞增殖实验

1.CCK-8细胞增殖实验：采用脑胶质瘤DBTRG、C6细胞株作为研究模型，研究野鸢尾黄素对脑胶质瘤细胞增殖活性的影响。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞计数试剂盒测量细胞活力。将细胞重悬、计数，约5,000个/孔铺于96孔板中，培养过夜。使用培养基将野鸢尾黄素稀释至100μM、75μM、50μM、25μM、10μM分别培养24和48小时，测CCK8，使用酶标仪在450nm波长下测量细胞的光密度(如图1所示)。从图1A-B中可观察到随着野鸢尾黄素的浓度升高，对胶质瘤细胞增殖的抑制作用越强。

2.细胞克隆实验：将DBTRG和C6细胞以1000细胞/孔接种到6孔板中，培养过夜。之后设置一定浓度的野鸢尾黄素实验组和DMSO对照组处理，并将细胞在5％CO

3.PH3免疫荧光染色：将DBTRG和C6细胞以3万个/孔接种于铺有细胞爬片的12孔板中，待细胞长到合适密度时，换液并加入一定体积的野鸢尾黄素和对照溶剂，继续培养24h。将细胞用PBS漂洗一次，用4％多聚甲醛固定20min，然后再用PBS清洗爬片3次，每次5min。之后，用破膜封闭液(5％BSA+0.1％Triton)室温破膜并封闭1h。随后，将细胞与一抗鼠抗PH3(1:2,500)和DAPI(1:1,000)在4℃下孵育过夜PBS漂洗3次，每次5min，并与二抗抗鼠AlexaFluor488(A21202,Invitrogen 1:1,000)在室温下孵育1h。用PBS漂洗三次后，用抗荧光衰减封片剂封片，使用激光共聚焦获取图像。根据所有核染色计算细胞总数，其中PH3阳性信号占所有细胞的百分比越高代表细胞的增殖越快。如图1F-H所示，野鸢尾黄素处理24h后细胞的增殖作用明显降低。

(2)细胞迁移实验

1.划痕实验：将DBTRG、C6铺于接种到6孔板上，待细胞密度接近100％时，使用1ml无菌移液器吸头刮擦单层细胞形成创口，并用PBS洗涤数次，以除去漂浮细胞。拍照记录0h的伤口间隙，然后对照组和实验组分别在无血清和无血清加野鸢尾黄素的培养基中培养24h。PBS洗涤并拍照记录细胞的伤口间隙，根据伤口间隙的缩小范围计算细胞迁移速率，使用ImageJ软件对划伤的表面积进行定量。从图2A-C中可观察到随着野鸢尾黄素的浓度升高，对胶质瘤细胞迁移的抑制作用越强。

2.Transwell实验：将细胞(2000个)在200μl无血清培养基的上室中培养，下室为500μl含10％FBS的DMEM；分别在上室中加入一定量的野鸢尾黄素和对照溶剂。培养36h后，4％多聚甲醛固定30min，0.1％的结晶紫染色，用并用棉签擦拭上小室未迁移的细胞。利用显微镜(Ci-S,Nikon,Japan)拍照，记录多个视野中透过小室基质胶的细胞数目并统计(如图2D-F所示)。

(3)流式细胞周期

用野鸢尾黄素或对照试剂DMSO处理细胞24h，培养或分离的细胞约1×106，用胰酶消化后的细胞离心沉淀后用1ml PBS重悬，移入1.5ml EP管中，200g离心5min，弃上清液，用l ml PBS重悬细胞再离心洗涤细胞一次。弃上清液，将沉淀的细胞用500μl DNA染色溶液和5μl Permeabilization(细胞周期染色试剂盒，Multi Sciences，CCS012)重悬，涡旋振荡5s，并在37℃下孵育30min。使用流式细胞仪(CytoFLEX S，Beckman Coulter，USA)在样品上检测DNA直方图，并使用FlowJo软件分析细胞周期分布。根据流式报告中检测的G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比进行分析，如图3所示，野鸢尾黄素处理显示可以将DBTRG和C6细胞的细胞周期阻滞在G2/M期。

(4)细胞凋亡实验

1.流式细胞凋亡：DBTRG和C6细胞分别予野鸢尾黄素处理24h。每孔取5～10×104个细胞。按照同样的预处理方式，用500μl Binding Buffer重悬细胞，使用FITC和PI染液进行混匀染色，室温避光孵育5min。最后用流式细胞仪测定，。根据流式报告中检测的凋亡百分比进行实验分析。从图4A-C中可以观察到，50μM的野鸢尾黄素处理后使细胞凋亡率上升了11％作用。

2.PI染色：将DBTRG和C6细胞以适当的密度接种在6孔板中并培养过夜。用一定浓度的野鸢尾黄素处理细胞24小时。根据PI染色试剂盒(Propidium Iodide,Beyotime,ST511)的说明，配制10mg/ml的工作液，以(1μl/100ul培养基)的浓度处理细胞。在黑暗中孵育10分钟后，用荧光显微镜(Olympus，Japan)观察细胞并拍照。从图4G-I中可以观察到，野鸢尾黄素处理24h后细胞的凋亡比率明显上升。

3.Cleaved-caspase3免疫荧光染色：与PH3染色步骤相同，仅一抗换为兔抗C-caspase3(1:500)。根据所有核染色计算细胞总数，其中Cleaved-caspase3阳性信号占所有细胞的百分比越高代表细胞的凋亡率越高。如图4D-F所示，野鸢尾黄素处理24h后细胞的凋亡比率明显上升。

4.蛋白质印迹法测Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2的蛋白表达：用野鸢尾黄素或DMSO处理细胞后，使用预冷的RIPA裂解液(含PIC：1:100和PMSF：1:100)，裂解C6和DBTRG细胞，超声裂解，20％功率超声，每次超声1min，冰上裂解30min后，13000g，4℃离心15min，吸取上清到干净的1.5ml EP管中，利用BCA定量试剂盒对蛋白进行定量，加入5×上样缓冲液，并于10℃煮沸8-10min。随后使用8-12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质样品并转移到硝酸纤维素膜，在含有5％脱脂乳的1×TBST封闭1h，将免疫印迹与不同的一抗孵育过夜，4℃过夜，用1×TBST洗涤膜三次，并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1小时。使用1×TBST洗涤膜三次后，使用ECL检测试剂盒检测蛋白质信号。使用Image J软件计算灰度值，定量比较两组样本中Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2的蛋白表达，并做统计学分析，利用graphpad软件统计分析，如图4J-M所示。

(5)野鸢尾黄素抑制Wnt/β-catenin信号通路

研究中采用脑胶质瘤U87、DBTRG细胞作为研究模型，研究野鸢尾黄素抑制脑胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路的分子机制。使用培养基将野鸢尾黄素稀释至50μM培养24小时，荧光定量PCR实验检测细胞中GSK-3β基因表达的变化，使用RNA-easy IsolationReagent(R701,Vazyme)从DBTRG细胞中提取总RNA。根据制造商的说明，使用

(6)野鸢尾黄素降低胶质瘤细胞中YAP的表达

采用脑胶质瘤C6和DBTRG细胞作为研究模型，研究野鸢尾黄素对脑胶质瘤细胞中YAP及p-YAP等表达的影响。使用培养基将野鸢尾黄素稀释至50μM培养24小时，免疫荧光结果显示野鸢尾黄素处理后使YAP出核增多且平均荧光强度降低，如图6A-C所示。Westernblot实验检测细胞中YAP及p-YAP等表达的变化，如图6D-E所示，YAP/p-YAP表达量降低。

(7)野鸢尾黄素对裸鼠颅内肿瘤抑制作用研究

采用带荧光素酶的脑胶质瘤C6-luciferace细胞构建裸鼠原位脑胶质瘤模型作为研究模型，研究野鸢尾黄素对裸鼠颅内胶质瘤生长的影响。可以观察到通过野鸢尾黄素灌胃给药，剂量为20mg/kg/d，疗程为19天，可以明显抑制裸鼠颅内脑胶质瘤的生长，见图7。

(8)胶质瘤细胞中过表达YAP可以逆转野鸢尾黄素抗胶质瘤作用

采用脑胶质瘤C6细胞作为研究模型，研究升高胶质瘤细胞中YAP的表达能否逆转野鸢尾黄素抗胶质瘤作用。胶质瘤细胞中转染YAP质粒24h后，使用培养基将野鸢尾黄素稀释至50μM培养24小时,从图8A-G中可观察到升高胶质瘤细胞中YAP的表达能逆转野鸢尾黄素抑制胶质瘤细胞增殖、迁移作用。通过Western blot技术观察到YAP的过表达能逆转野鸢尾黄素引起的胶质瘤细胞内YAP、β-catenin的下调和一些其他相关分子的改变(图8H-K)。综合这些结果，我们得出结论，野鸢尾黄素通过YAP抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性来抑制DBTRG和C6细胞的进展。

(9)统计分析所有实验至少进行三次，数据采用GraphPad Prism Version 7.0软件进行分析，取平均值±标准差。采用对于实验数据的分析，使用t检验或单因素/双因素方差分析来确定统计学意义。P<0.05为差异有统计学意义。

(10)结果显示。

以上所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明,对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。