一种短双歧杆菌M-16V在制备缓解卵清蛋白诱导的食物过敏药物中的应用

摘要

本发明涉及一种短双歧杆菌M‑16V在制备缓解卵清蛋白诱导的食物过敏药物中的应用。所述短双歧杆菌M‑16V能够调控肠道菌群组成和代谢过程，减少肥大细胞的激活，进而缓解食物过敏。

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，特别涉及一种短双歧杆菌M-16V在制备缓解卵清蛋白诱导的食物过敏药物中的应用。

背景技术

目前，过敏性疾病在全球范围内广泛流行。而食物过敏作为常见的过敏性疾病，已成为严重危害成人和儿童健康的公共卫生问题。近年来，食物过敏发病率不断攀升，流行病学调查显示，近13％人群受到食物过敏的影响，严重危害人们生活健康。食物过敏是对摄入食物蛋白质(即过敏原)的一种有害的免疫学反应。食物过敏患者摄入特定种类的过敏原后，快速引发机体多个部位不同的症状反应，如皮肤的瘙痒、红肿、荨麻疹，呼吸道的哮喘、咳嗽，胃肠道的恶心、呕吐、腹泻等，反应严重时甚至导致休克和死亡。由于食物过敏症状反复，且现阶段没有彻底治愈的办法，严重降低患者的生活质量，给家庭和社会带来巨大精神和经济负担。因此，阐明食物过敏发病机制，寻找有效缓解和治疗途径，对于食物过敏防治尤为重要。

尽管食物过敏发病机制尚不明确，但肠道微生态失调与免疫功能紊乱是其核心。生命早期肠道微生态形成对生命健康成长起到重要作用。随着对肠道微生态形成及生理作用的深入研究,发现肠道微生态紊乱可能通过影响人体肠道免疫因子等,引起生命早期发生过敏性疾病。研究显示，婴儿期发生食物过敏可能由于肠道菌群丰度失衡引起免疫细胞理化性质变化，导致肠道通透性增高，引起机体免疫系统紊乱。动物实验与临床研究结果基本一致，小鼠生命早期肠道菌群丰度的变化，可能会引起2型免疫受损，导致过敏反应产生。目前，有关食物过敏发病机制尚不明确，尤其是肠道微生态与食物过敏的关联性及具体机制尚未完全解析，有待进一步深入探讨。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种短双歧杆菌M-16V在制备缓解卵清蛋白诱导的食物过敏药物中的应用。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备预防、治疗或缓解食物过敏症状药物中的应用。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备预防、治疗或缓解卵清蛋白诱导的食物过敏症状药物中的应用。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备抑制肥大细胞活化药物中的应用。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备降低Bacteroidetes，Bacteroidales，Prevotella hominis的相对丰度药物中的应用。

本发明提供一种短双歧杆菌在制备调节肠道菌群药物中的应用。

所述药物的制剂剂型包括口服液、胶囊剂、油滴剂、水剂、粉剂、片剂或注射剂。

所述药物包括食品、健康食品或营养补充剂。

所述药物包括单方制剂或复方制剂。

本发明中短双歧杆菌M-16V是通过抑制肥大细胞活化而起作用的，其中所述的与肥大细胞有关的差异基因积极地影响了过敏性反应的发展，这使得本发明的菌株特别有效地用于预防和/或治疗食物过敏。经哺乳动物摄入本发明的菌株之后，血清IgE分泌水平下调，炎性细胞浸润减少，小肠炎症反应缓解，调节肠道菌群失调。提示短双歧杆菌M-16V能够重建肠道菌群间的微生态平衡，抑制肥大细胞活化来缓解食物过敏症状。

本发明的菌株干预的小肠差异基因筛选结果显示，摄取所述菌株可能明显抑制小肠Kit、Gata2和Mcpt4等差异基因的表达，上述基因与肥大细胞生长发育及分泌颗粒有关。

本发明的菌株干预的肠道菌群研究结果显示，摄取所述菌株可能通过降低Bacteroidetes，Bacteroidales，Prevotella hominis的相对丰度来部分缓解肠道菌群失调。Bacteroidetes，Bacteroidales，Prevotellahominis认为与过敏性反应发生密切相关。上述结果提示所述菌株可能通过调控肠道菌群来缓解食物过敏症状。

此外，本发明的菌株的代谢组学研究证明，摄取该菌株会引起与过敏性反应发生有关的乙酰胆碱和花生四烯酸的一系列代谢变化，同时也能诱导与维生素和RNA合成有关的代谢产物的明显增加。就上述与过敏有关的代谢产物含量明显降低而言，乙酰胆碱和花生四烯酸等可以识别为本发明菌株的靶物。

附图说明

图1为短双歧杆菌M-16V干预食物过敏的实验流程图。

图2为小肠组织的HE染色结果。实心箭头标出的为炎性细胞浸润，空心箭头标出的为脱落绒毛上皮细胞。

图3为肛温和血清免疫球蛋白分泌情况；*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001，****P≤0.0001。

图4为各组小鼠CD4

图5为血清免疫因子分泌情况。*P≤0.05,****P≤0.0001。

图6为小肠基因表达情况；A.差异基因表达热图；B.基因通路富集分析。

图7为小肠基因表达情况：差异基因mRNA表达。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。

图8短双歧杆菌M-16V缓解肠道菌群失调。A.样本聚类树。B.LEfSe工具计算细菌类群的相对丰度。

图9为短双歧杆菌M-16V缓解肠道菌群失调：细菌群落的相对丰度。**P≤0.01,***P≤0.001，****P≤0.0001。

图10短双歧杆菌M-16V调控肠道菌群代谢。A.OPLS-DA图。B.气泡图。

图11为短双歧杆菌M-16V调控肠道菌群代谢：相关热图。

图12机制示意图(短双歧杆菌M-16V通过调控肠道菌群组成和代谢过程，减少肥大细胞的激活，进而缓解食物过敏)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

短双歧杆菌M-16V：迪辅乐M-16V益生菌。

实施例1

使用卵清蛋白OVA建立食物过敏小鼠在体模型，经短双歧杆菌M-16V干预，研究短双歧杆菌M-16V对食物过敏的预防和/或治疗作用。

选择用8周雌性BALB/c小鼠，模型组：第0和14天，腹腔注射100μg OVA/1mg alum；第28、30、32、34、36、38天，口服灌胃50mgOVA/200μLPBS。治疗组：采用2×10

经口灌胃一个月后，对小鼠实施安乐死并收集组织。基于实验目的，将脾脏机械分离成单细胞悬液进行进一步测量。粪便和肠道保存在-80℃，分别用于宏基因测序、非靶向代谢组学检测和RNA-seq分析。

实施例2

末次灌胃处死小鼠，取小肠组织，HE染色后进行形态学观察。如观察发现空肠黏膜水肿、炎性细胞浸润、潘氏细胞脱颗粒和肥大细胞数目增加，提示小鼠发生肠道过敏。结果显示，对照组肠道组织结构完整，无明显炎症变化。模型组肠道粘膜被破坏，绒毛上皮细胞排列不整齐或脱落，大量的炎症细胞渗透如淋巴细胞和嗜酸性粒细胞被观察到。经短双歧杆菌M-16V干预后，短双歧杆菌M-16V明显改善了OVA诱导的小肠炎症反应，减少了炎性细胞的浸润。如图2所示。

实施例3

ELISA法测定血清免疫球蛋白IgE、IgA和IgG分泌水平。所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔加入抗原，置37℃，4h；弃去孔中液体。5％小牛血清置37℃封闭40min。封闭时将封闭液加满各反应孔，去除各孔气泡，封闭结束用洗涤液洗涤。样品加入酶标反应孔，置37℃，40～60min。洗涤液满孔洗涤。加入酶标抗体和底物液，置37℃，3～5min，加入终止液显色；每孔加入终止液，终止反应，测定实验结果。

如图3所示，对各组小鼠肛温和血清免疫球蛋白分泌水平进行分析。结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肛温升高，血清IgE、IgA和IgG1分泌水平显著增高。经短双歧杆菌M-16V干预后，肛温降低，血清IgE和IgG1分泌水平明显下降，IgA、IgG2a及IgG2a/IgG1分泌水平明显增高。ELISA法检测血清IgE水平，若显著增加，提示小鼠发生速发型超敏反应，食物过敏模型建立成功。IgE的显著下降提示，短双歧杆菌M-16V可明显抑制食物过敏发生发展。IgG2a/IgG1作为益生菌的重要的干预评价指标，其明显增高表明短双歧杆菌M-16V干预食物过敏的有效性。

实施例4

采用流式细胞术测定脾淋巴细胞亚群的变化。用流式细胞术染色缓冲液洗涤T细胞，Fc阻断液阻断T细胞，4℃染色30min。洗涤后重悬。将100μL PBS中的10

实施例5

如图5所示为各组小鼠血清免疫因子分泌水平。IL-4、IL-10和IL-13为Th2细胞分泌的细胞因子，能够加速食物过敏的发生。结果显示，模型组血清IL-13分泌水平明显增高，而短双歧杆菌M-16V明显抑制IL-13的分泌。各组IL-4和IL-10分泌水平无显著性差异。

实施例6

mRNA-seq技术筛选小肠差异基因，并进行RT-PCR验证。引物序列：

Kit，F:TCACGGGCGGATCACAAAGA，如SEQ ID NO.1所示；

R:CACGGGCAGTCGTGCATTTC，如SEQ ID NO.2所示。

Gata2，F:CCGCCGCAGCTCATGACTAT，如SEQ ID NO.3所示；

R:ACACACTCCCGGCCTTCTGA，如SEQ ID NO.4所示。

Cpa3，F:TTTGGTCATGGACACAGGATCG，如SEQ ID NO.5所示

R:GAGGTCAGTGCCAATGCAGG，如SEQ ID NO.6所示。

Mitf，F:ACGGGAACAGCAACGAGCTA，如SEQ ID NO.7所示

R:TGCATCTCCAGCTCCTGTACTC，如SEQ ID NO.8所示。

Lilr4b，F:TTTAAGTGCAGCTCATCCACAC，如SEQ ID NO.9所示

R:ATTGGCCTGATGCTGTGAGT，如SEQ ID NO.10所示。

Mcpt4，F:CTGCACACTGTAGTGGAAGAGAA，如SEQ ID NO.11所示

R:CTTCTGCTGTGTGGATTCTGTCT，如SEQ ID NO.12所示。

β-actin，F:GATATCGCTGCGCTGGTCG，如SEQ ID NO.13所示

R:GCCCACGATGGAGGGGAATA，如SEQ ID NO.14所示。

β-actin转录水平被确定为管家基因。RT-PCR执行如下：变性30s 95℃，紧随其后的是40周期5s 95℃和31s 60℃。采用2

如图6、7所示，RT-PCR法检测小肠关键基因表达结果显示，与对照组比较，模型组小肠肥大细胞生长发育和分泌颗粒相关基因Kit、Gata2、Lilr4b、Mcpt4、Mitf和Cpa3表达明显增高，经短双歧杆菌M-16V干预后，上述基因表达水平明显被抑制。结果提示，短双歧杆菌M-16V可能通过抑制小肠肥大细胞活化相关基因表达，来缓解食物过敏症状。

实施例7

对样本进行宏基因组抽提；通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，Nanodrop2000检测基因组DNA浓度及质量；取基因组DNA，将DNA片段化；片段化后DNA存在5’或3’端突出，向纯化后DNA片段加入末端补齐体系；使用Taq polymerase在DNA片段3’末端加上单个腺苷酸“A”，防止DNA片段之间平末端自连。加入连接缓冲液和双链测序接头，利用T4 DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端；PCR扩增获得测序文库并质控；文库于Illumina Hiseq平台，以2×150bp双端测序模式进行高通量测序，获FastQ数据。

如图8A所示，在样本聚类树分析中，不同分组的样本以不同颜色区分，树枝长度代表样本间的距离，树枝越靠近表示样本的物种组成越相似。结果表明，各组组内样本组成成分接近，对照组、模型组和治疗组间样本组成成分无交叉。

如图8B所示，对照组Clostridiaceae为主，模型组以Bacteroidetes为典型的生物标志物，短双歧杆菌M-16V处理后以Verrucomicrobia为主。换句话说，短双歧杆菌M-16V干预前后最明显的对比是Bacteroidetes的丰度明显减少，而Verrucomicrobia的丰度明显增加。这些数据可作为一种辅助诊断方法。结果显示，模型组小鼠粪便中与过敏相关的Bacteroidetes，Bacteroidales，Prevotella hominis含量明显增加，而短双歧杆菌M-16V可能通过降低Bacteroidetes，Bacteroidales，Prevotella hominis的相对丰度来部分缓解肠道菌群失调。经短双歧杆菌M-16V干预，Coriobacteriaceae的相对丰度明显增高，Coriobacteriaceae被认为与过敏性反应的抑制有关。结果见图9。上述结果提示短双歧杆菌M-16V可能通过调控肠道菌群来缓解食物过敏症状。

实施例8

样本于离心管中，加甲醇研磨，涡旋振荡充分混匀，4℃超声；静置，涡旋，4℃静置后离心；取全部上清于一新离心管中，静置后离心；移取上清，加入内标，转入小瓶；取相同体积的每个待测样本进行混合，制成QC样本，在待测样本进样前、进样中和进样后上机检测。色谱分离条件：柱温40℃；流速0.3mL/min；正模式流动相组成A水+5％乙腈+0.1％甲酸，B乙腈+0.1％甲酸；负模式流动相组成A水+5％乙腈+0.05％甲酸，B乙腈+0.05％甲酸；3μL进样量；自动进样器温度4℃。质谱条件：a)正模式：加热器温度300℃；鞘气流速45arb；辅助气流速15arb；尾气流速1arb；电喷雾电压3.0KV；毛细管温度350℃；S-Lens RF Level,30％；b)负模式：加热器温度300℃；鞘气流速45arb；辅助气流速15arb；尾气流速1arb；电喷雾电压3.2KV；毛细管温度350℃；S-Lens RF Level,60％。

如图10A所示，模型组和干预组之间存在显著的代谢组差异(R2X＝0.516,R2Y＝0.998)。根据OPLS-DA模型获得不同的代谢产物(VIP>1,P<0.05)，纳入进一步分析。本研究通过200×permutation验证OPLS-DA模型的拟合程度。在差异显著的代谢产物中，模型组与过敏性反应发生有关的乙酰胆碱和花生四烯酸含量明显增高，与维生素合成相关的泛酸和核黄素，以及与RNA合成相关的腺嘌呤和尿嘧啶含量明显减少，经短双歧杆菌M-16V干预后，乙酰胆碱和花生四烯酸含量降低，与维生素和RNA合成有关的代谢产物明显增加(图10B)。如图11所示，模型组与治疗组的差异代谢通路涉及多种维生素代谢，包括维生素消化和吸收，泛酸和辅酶A合成。研究发现，维生素可能是控制过敏性反应发生的参与者，例如，维生素A和D的缺乏已被证明能够加剧致敏和过敏症状。

综上所述，短双歧杆菌M-16V可能通过调控肠道菌群组成和代谢过程，减少肥大细胞的激活，进而缓解食物过敏(图12)。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

迪辅乐生物(上海)有限公司

2, 1

<120> 一种短双歧杆菌M-16V在制备缓解卵清蛋白诱导的食物过敏药物中的应用

<130> 1

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tcacgggcgg atcacaaaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cacgggcagt cgtgcatttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccgccgcagc tcatgactat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

acacactccc ggccttctga 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tttggtcatg gacacaggat cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gaggtcagtg ccaatgcagg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

acgggaacag caacgagcta 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tgcatctcca gctcctgtac tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tttaagtgca gctcatccac ac 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

attggcctga tgctgtgagt 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ctgcacactg tagtggaaga gaa 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cttctgctgt gtggattctg tct 23

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gatatcgctg cgctggtcg 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gcccacgatg gaggggaata 20