用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒、方法及系统

摘要

本发明提供了用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒、方法及系统，包括分子标志物检测试剂和/或分子生物学特征参数检测试剂；分子标志物包括GNAS、CDK6、DRD2、EGFR、MGMT、PDL1、SNAI1、SNAI2、TWIST1、TWIST2、VEGFA、VEGFR2、SSTR2/5和ZEB2中的一种或多种；分子生物学特征参数包括GNAS基因拷贝数变异、GNAS基因突变、USP8基因突变、上皮间质化特征、基质细胞百分比、免疫耗竭、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生中的一种或多种。本发明基于大规模样本分析和验证提出了新的与垂体腺瘤的疗效及预后相关的分子标志物和/或分子生物学特征参数，可将垂体腺瘤整合为7个具有预后指导意义的亚型，对垂体腺瘤治疗方案选择和垂体腺瘤药物靶点筛选提供了新的方案和选择。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤技术领域，尤其涉及一种用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒、方法及系统。

背景技术

垂体腺瘤是一种神经内分泌肿瘤，部分肿瘤可过度分泌激素，导致肢端肥大症，库欣病等严重过的神经内分泌紊乱，最终导致全身代谢改变。目前国际上基于WHO的分类标准(表1)，将TPIT，SF1和PIT1作为除垂体激素以外的主要表征之一。该类亚型仅是基于临床现象提出的亚型，PIT，SF1和PIT1三个指标只能预测肿瘤的激素分泌表型，与患者预后无相关性。需要开发一种能够指导垂体腺瘤预后治疗和预测肿瘤预后的临床亚型方法，并寻找新的分子标志物。

表1WHO2017对垂体腺瘤的10个亚型及其标志物

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供了一种可预测垂体腺瘤治疗效果及预后的试剂盒、方法及系统，提出了新的与垂体腺瘤的疗效及预后相关的分子标志物和/或分子生物学特征参数，可将垂体腺瘤整合为7个具有预后指导意义的亚型，对垂体腺瘤治疗方案选择和垂体腺瘤药物靶点筛选提供了新的方案和选择。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒，包括分子标志物检测试剂和/或分子生物学特征参数检测试剂；分子标志物包括GNAS(鸟苷酸结合蛋白活性刺激肽)、CDK6(细胞分裂蛋白激酶6)、DRD2(多巴胺受体D2)、EGFR(表皮生长因子受体)、MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶)、PDL1(细胞程序性死亡-配体1)、SNAI1(SNAIL同源物1)、SNAI2(SNAIL同源物2)、TWIST1(人类直系同源物为TWIST1)、TWIST2(人类直系同源物为TWIST2)、VEGFA(血管内皮生长因子A)、VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)、SSTR2/5(人源生长抑素Ⅱ/V型受体)和ZEB2(锌指E-box结合同源异型盒2)中的一种或多种，在本发明的一些具体实施方案中，分子标志物包括上述的2种以上、3种以上、4种以上、6种以上、8种以上、10种以上；分子生物学特征参数包括GNAS基因拷贝数变异(GNAS CNV)、GNAS基因突变、USP8基因突变、上皮间质化特征(EMT feature)、基质细胞百分比、免疫耗竭(Immune exhausted)、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生(hypoxiaangiogenesis)中的一种或多种，在本发明的一些具体实施方案中，分子生物学特征参数包括上述的2种以上、3种以上、4种以上。

本发明优选的，所述分子标志物包括GNAS、CDK6、TWIST1、TWIST2、SNAI1、SNAI2、ZEB2、MGMT、PDL1、SSTR2/5和EGFR。

本发明优选的，所述分子生物学特征包括GNAS基因拷贝数变异、上皮间质化特征、免疫耗竭、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生。

本发明的第二方面提供了上述技术方案所述试剂盒在制备垂体腺瘤疗效及预后预测的试剂或装置中的应用。

本发明的第三方面提供了前述技术方案所述试剂盒在制备垂体腺瘤诊断试剂或装置中的应用。

本发明的第四方面提供了一种垂体腺瘤治疗效果及预后预测方法，包括以下步骤：

S1，对待测样本中的分子标志物和/或分子生物学特征参数进行检测；

分子标志物包括GNAS、CDK6、DRD2、EGFR、MGMT、PDL1、SNAI1、SNAI2、TWIST1、TWIST2、VEGFA、VEGFR2、SSTR2/5和ZEB2中的一种或多种；

分子生物学特征参数包括GNAS基因拷贝数变异、GNAS基因突变、USP8基因突变、上皮间质化特征、基质细胞百分比、免疫耗竭、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生中的一种或多种；

S2，对比待测样本和正常人样本的检测数据，获取显著差异特征并进行垂体腺瘤亚型，得到垂体腺瘤不同亚型对应的肿瘤侵袭概率以预测垂体腺瘤治疗效果及预后；

若待测样本中的显著差异特征为GNAS和/或CDK6分子标志物，和/或，GNAS基因拷贝数变异和/或GNAS基因突变时，判断为GH

若待测样本中的显著差异特征为TWIST1、TWIST2、SNAI1、SNAI2和ZEB2中的一种或多种分子标志物，和/或上皮间质化特征和/或基质细胞百分比时，判断为EMT

若待测样本中的显著差异特征为DRD2和/或MGMT分子标志物时，判断为PRL

若待测样本中的显著差异特征为PDL1、SSTR2/5和MGMT中的一种或多种分子标志物，和/或存在免疫耗竭时，判断为TSH/silent pit1

若待测样本中的显著差异特征为EGFR分子标志物，和/或USP8基因突变和/或EGFR配体激活时，判断为ACTH亚型，肿瘤侵袭概率≥33.3％；

若待测样本中的显著差异特征为MGMT分子标志物，和/或EGFR T693位点磷酸化时，判断为Silent TPIT亚型，肿瘤侵袭概率≥76％；

若待测样本中的显著差异特征为VEGFA、VEGFR2和DRD2中的一种或多种分子标志物，和/或缺氧性血管新生时，判断为SF1/NULL

本发明的第五方面提供了一种垂体腺瘤的疗效及预后评估系统，包括数据采集模块和数据分析模块；

数据采集模块用于获得前述技术方案所述试剂盒的检测结果；

数据分析模块，用于将检测结果与正常样本数据进行对比，得到显著差异特征；根据显著差异特征进行亚型处理，根据垂体腺瘤亚型得到肿瘤侵袭概率；

所述亚型处理包括：

若待测样本中的显著差异特征为GNAS和/或CDK6分子标志物，和/或，GNAS基因拷贝数变异和/或GNAS基因突变时，判断为GH

若待测样本中的显著差异特征为TWIST1、TWIST2、SNAI1、SNAI2和ZEB2中的一种或多种分子标志物，和/或上皮间质化特征和/或基质细胞百分比时，判断为EMT

若待测样本中的显著差异特征为DRD2和/或MGMT分子标志物时，判断为PRL

若待测样本中的显著差异特征为PDL1、SSTR2/5和MGMT中的一种或多种分子标志物，和/或存在免疫耗竭时，判断为TSH/silent pit1

若待测样本中的显著差异特征为EGFR分子标志物，和/或USP8基因突变和/或EGFR配体激活时，判断为ACTH亚型，肿瘤侵袭概率≥33.3％；

若待测样本中的显著差异特征为MGMT分子标志物，和/或EGFR T693位点磷酸化时，判断为Silent TPIT亚型，肿瘤侵袭概率≥76％；

若待测样本中的显著差异特征为VEGFA、VEGFR2和DRD2中的一种或多种分子标志物，和/或缺氧性血管新生时，判断为SF1/NULL

本发明的第六方面提供了一种计算机可读储存介质，包含计算机指令，所述计算机指令被处理器执行时完成上述技术方案所述的系统。

本发明的第七方面提供了DRD2抑制剂在制备预防或治疗SF1谱系垂体腺瘤和/或零细胞瘤的药物中的应用；优选的，所述DRD2抑制剂包括溴隐亭和/或卡麦角林，

本发明的第八方面提供了SSTR2/5抑制剂在制备预防或治疗TSH型垂体腺瘤和/或Silent PIT1型垂体腺瘤的药物中的应用；优选的，所述SSTR2/5抑制剂包括索玛杜林和/或善龙。

本发明的第九方面提供了MGMT抑制剂在制备预防或治疗PRL型垂体腺瘤、TSH型垂体腺瘤和/或Silent PIT1型垂体腺瘤的药物中的应用；优选的，所述MGMT抑制剂包括替莫唑胺。

本发明的第十方面提供了EGFR抑制剂在制备预防或治疗非USP8基因突变的ACTH型垂体腺瘤的药物中的应用；优选的，EGFR_T693磷酸化激酶抑制剂在制备预防或治疗silent T-PIT型垂体腺瘤的药物的中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明首次提出了与垂体腺瘤治疗效果及预后相关的分子标志物和/或分子生物学特征参数组合，上述组合可将垂体腺瘤划分为与疗效及预后相关的新亚型，进而应用于试剂盒、系统、预测方法中实现对垂体腺瘤治疗效果及预后的早期预测，对临床治疗方案选择、垂体腺瘤药物靶点筛选等具有极强的指导意义，促进垂体腺瘤药物。

2、本发明首次发现GNAS、CDK6、TWIST2、SNAI1、SNAI2、MGMT、SSTR2/5和VEGFA蛋白可作为垂体腺瘤的标志物，为垂体腺瘤药物筛选提供了新的作用靶点。

3、垂体腺瘤作为低频突变肿瘤，除了USP8和GNAS这2个明星突变外，在基因组层面缺乏更多的诊断标志物，本发明首次提出GNAS拷贝数变异(CNV)、上皮间质化特征、免疫耗竭、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生可作为垂体腺瘤的分子生物学特征参数，并且上述参数与垂体腺瘤的疗效及预后有关。

4、本发明基于首次发现的新型标志物为垂体腺瘤治疗提供了新的药物或已有药物的新适应症。

附图说明

图1为与垂体腺瘤治疗效果及预后相关的分子标志物和/或分子生物学特征参数与垂体腺瘤分型之间的数据分析图；

图2为本发明实施例中对垂体腺瘤分型的标志物热图；

图3为WHO2017垂体腺瘤分型涉及的标志物热图；

图4为GNAS基因的CNV、mRNA、蛋白含量与垂体腺瘤侵袭性的热图；

图5为PIT1谱系中GNAS的表达量与CDK6表达量的相关性分析图

图6为TPIT谱系中三种不同的EGFR激活方式热图

具体实施方式

本发明所称“显著差异特征”是指本发明所述与正常人相比垂体腺瘤治疗效果及预后有关的标志物的蛋白或mRNA含量有显著的增加或减少，和/或，与正常人相比存在本发明所述与垂体腺瘤治疗效果及预后有关的分子生物学特征参数。

本发明所述用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒中，分子标志物可以是蛋白或表达该蛋白的核酸序列，所述分子标志物和/或分子生物学特征参数的检测试剂可以是Westernblot、免疫组化染色、免疫荧光或免疫抗体芯片等。在本发明中，术语“GNAS基因拷贝数变异(GNAS CNV)”是指GNAS基因的拷贝数是否有改变，可以采用WES测序、芯片基因探针等方法检测；术语“GNAS基因突变”是指GNAS基因是否存在碱基突变，可以采用Sanger测序，WES测序、芯片基因探针等方法检测；术语“USP8基因突变”是指USP基因是否存在碱基突变，可以采用Sanger测序，WES测序、芯片基因探针等方法检测；术语“上皮间质化特征(EMT fueature)”是指是否存在上皮细胞特性及表达特征向间质细胞改变的生物过程，可以采用RNA测序，免疫组化等方法检测；术语“基质细胞百分比”是指肿瘤中基质细胞，比如成纤维细胞等，所占的百分比，可以采用免疫组化，HE染色等方法检测；术语“免疫耗竭(Immune exhausted)”是指存在免疫细胞消耗最终导致肿瘤内部浸润的免疫细胞减少的现象，可以采用流式分析，免疫组化，HE染色等方法检测；术语“EGFR配体激活”是指EGFR受体通过对应的配体，激活下游信号通路，可以采用免疫组化，WB等方法检测；术语“EGFR T693位点磷酸化”是指EGFR蛋白第693位氨基酸是否被氧化，可以采用免疫组换，WB等方法检测；术语“缺氧性血管新生(hypoxia angiogenesis)”是指缺氧环境下的血管新生，可以采用免疫组换，WB等方法检测。

本发明所述用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒可将垂体腺瘤进行亚型(如图1和表2所示)，该新型垂体腺瘤亚型不仅可为垂体腺瘤治疗效果及预后预测提供依据，还可以作为垂体腺瘤的用药指导以及药物靶点筛选依据。

表2垂体腺瘤7种亚型及用药指导示例

垂体腺瘤一线治疗是手术，且只有两种特定亚型的药物结合治疗，即分别用于PRL和GH的多巴胺激动剂(针对DRD2受体)和生长抑素类似物(针对SSTR2/5受体)，这两种药物的总体缓解率为中等。针对这2类已知的药物，本发明通过多组学研究，发现应用本发明所述试剂盒、方法和系统获得的部分垂体腺瘤亚型可得到一些潜在的治疗方案：

(1)DRD2作为SF1/NULL

(2)SSTR2/5作为TSH/silent PIT1

(3)本发明研究表明PRL

(4)WHO2017分类中，垂体腺瘤T-PIT谱系分为激素过度分泌型(ACTH)和侵袭性较高的静息型T-PIT(silent TPIT)，本发明发现与T-PIT谱系与USP8基因突变、EGFR配体激活、EGFR蛋白含量以及EGFR_T693磷酸化等有关，提示对于存在USP8基因突变的ACTH型垂体腺瘤可采用USP8抑制剂治疗，对于不存在存在USP8基因突变的ACTH型垂体腺瘤可采用针对EGFR的药物治疗，针对silent T-PIT型垂体腺瘤可采用EGFR_T693磷酸化激酶抑制剂治疗。

以上仅是本发明所述试剂盒、方法和系统在垂体腺瘤用药指导方面的部分示例。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明首次通过对大样本垂体腺瘤的DNA、RNA、蛋白以及磷酸化修饰组的鉴定，通过200人队列的数据采集和独立的750人验证队列进行免疫组化研究，发现并验证了与垂体腺瘤治疗效果及预后有关的分子标志物和/或分子生物学特征参数，并构建了新型的垂体腺瘤亚型分型系统，为垂体腺瘤治疗效果及预后预测、用药指导、药物筛选提供了新方案，具体步骤如下：

1.对于200例垂体腺瘤患者在DNA、RNA、蛋白以及蛋白修饰层面进行分析，得到大样本的垂体腺瘤多组学数据集：

(1)全外显子数据采集

采用微量试剂盒从15mg低温粉碎后的均质组织中提取DNA，质检后取100ng基因组DNA建库。

建库流程主要包括：通过流体动力剪切系统进行片段化以产生180-280bp的片段，剩余的突出端通过核酸外切酶/聚合酶活性转化为平末端；DNA片段3'末端进行腺苷酸化后，连接寡核苷酸；在PCR反应中选择性富集两端连接了衔接子分子的DNA片段；PCR反应后，文库与生物素标记的探针在液相中杂交，然后使用带有链霉素的磁珠捕获基因的外显子；捕获的文库在PCR反应中富集，以添加索引标签以准备测序。使用AMPure XP系统纯化产品，并使用安捷伦Bioanalyzer 2100系统上的安捷伦高灵敏度DNA测定法对产品进行定量。

测序及数据处理流程包括：在Illumina Hiseq平台上对DNA文库进行测序，并产生150bp的配对末端读数；下游生物信息学分析均基于高质量数据，QC统计数据包括总reads数、测序深度、测序错误率、Q30读数的百分比；测序数据与参考序列的匹配，通过Burrows-Wheeler Aligner软件将有效的测序数据映射到参考人类基因组(UCSC hg19)，以获得以BAM格式存储的原始映射结果；Samtools mpileup和bcftools用于突变过滤，包括单核苷酸突变和插入突变；连接基因突变和疾病之间的功能注释。

(2)转录组数据采集

采用微量试剂盒从15mg低温粉碎后的均质组织中提取RNA，质检后取500ng用于后续建库。

建库流程包括：先去除核糖体RNA，随后将RNA进行片段化，再与随机引物结合；合成cDNA一链后，再合成cDNA二链；获得链特异性文库后，进行接头连接，为了保证测序时结合的一致性，再进行大片断筛选过程；PCR扩增，最后进行文库纯化并进行DNA文库质量检测。

按照12G测序数据量进行测序分析，数据处理流程包括：第一步先去除接头污染，一般使用软件trim_galore；第二步是数据比对，用TCGA官方使用的比对软件STAR，先构建一个基因组的索引，然后进行比对；第三步就是利用比对生成的bam文件生成表达量FPKM/TPM。

(3)蛋白质组和修饰组数据的采集

取50mg低温粉碎后的均质组织溶解于8M脲素裂解液中，离心后取上清蛋白，采用还原烷基化和FASP酶解的方式获得肽段样本，肽段在离子源中发生电离，在磁场和电场的作用下，按照离子不同质荷比进行检测。采用数据依赖采集模式(DDA)，蛋白经蛋白酶消化后的肽段，进行一级质谱的扫描，然后选择肽段离子进行二级碎裂，然后完成二级质谱的检测，将产出的真实谱图与数据库中理论谱图进行匹配打分和严格卡值，从而推断出蛋白信息。磷酸化蛋白质组在进行质谱鉴定前，利用Fe-NTA试剂盒进行磷酸化肽段的富集，再进行非标定量的大规模蛋白质组鉴定。

2.整合基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组的数据

(1)对步骤1得到的基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组原始文件进行质量控制和定量分析：FastQC(v0.11.9)用于基因组和转录组的数据质控，蛋白定量分析采用Firmiana，磷酸化定量分析采用Proteome Discover(version 2.3)。

(2)用maftools软件对基因组数据进行突变和拷贝数变异的分析；

(3)基于一致性聚类分析软件，分别构建转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组的分子分型，具体分子分型参数如下：reps＝1,000,pItem＝0.8,pFeature＝0.8,clusterAlg＝“hc”,distance＝“spearman”。鉴于转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组的分子分型具有高度一致性，最后选取最有临床转化价值的蛋白分型入组，筛选了1716个蛋白将临床10亚型分成7型：GH

结果如图1和图2所示，图3为WHO2017对垂体腺瘤分型的标志物热图以供参照。GNAS、CDK6、DRD2、EGFR、MGMT、PDL1、SNAI1、SNAI2、TWIST1、TWIST2、VEGFA、VEGFR2、SSTR2/5和ZEB2中的一种或多种可作为垂体腺瘤治疗效果及预后预测相关的分子标志物；GNAS基因拷贝数变异(GNAS CNV)、GNAS基因突变、USP8基因突变、上皮间质化特征(EMT fueature)、基质细胞百分比、免疫耗竭(Immune exhausted)、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生(hypoxia angiogenesis)中的一种或多种可作为垂体腺瘤治疗效果及预后预测相关的分子生物学标记。

实施例2 GNAS与垂体腺瘤预后的预测

以WES测序方法统计实施例1步骤1所述垂体腺瘤患者中有关GNAS的mRNA、CNV、蛋白含量，结果如图4所示，GNAS的CNV、mRNA、蛋白含量与垂体腺瘤的侵袭性高度相关，可作为垂体腺瘤预后的预测标志物。

CDK6是细胞周期的促进因子，CDK6表达水平与GNAS的CNV、mRNA、蛋白含量呈正相关(如图5所示)，因此通过CNK6蛋白表达水平可评估垂体腺瘤患者的GNAS CNV状况。

实施例3EGFR的T693位点磷酸化与silent TPIT垂体腺瘤

按照实施例1步骤1中(3)所述垂体腺瘤患者的修饰组数据采集方式获得数据并分析，结果如图6所示，发现在silent TPIT中EGFR的T693位点磷酸化显著增高，EGFR的T693位点磷酸化可作为silent TPIT垂体腺瘤的诊断标志物。

实施例4

一种用于垂体腺瘤治疗效果及预后预测的试剂盒，包括分子标志物检测试剂和分子生物学特征参数检测试剂；分子标志物检测试剂包括GNAS、CDK6、TWIST1、TWIST2、SNAI1、SNAI2、ZEB2、MGMT、PDL1、SSTR2/5和EGFR蛋白表达量检测试剂；分子生物学特征参数检测试剂包括GNAS基因拷贝数变异、上皮间质化特征、免疫耗竭、EGFR配体激活、EGFR T693位点磷酸化和缺氧性血管新生检测试剂。

使用本试剂盒进行垂体腺瘤治疗效果及预后预测使包括以下步骤：

S1，利用本试剂盒中的检测试剂对待测样本中的分子标志物和/或分子生物学特征参数进行检测；

S2，对比待测样本和正常人样本的检测数据，获取显著差异特征并进行垂体腺瘤亚型，得到垂体腺瘤不同亚型对应的肿瘤侵袭概率以预测垂体腺瘤治疗效果及预后；

若待测样本中的显著差异特征为GNAS和/或CDK6分子标志物，和/或，GNAS基因拷贝数变异和/或GNAS基因突变时，判断为GH

若待测样本中的显著差异特征为TWIST1、TWIST2、SNAI1、SNAI2和ZEB2中的一种或多种分子标志物，和/或上皮间质化特征和/或基质细胞百分比时，判断为EMT

若待测样本中的显著差异特征为DRD2和/或MGMT分子标志物时，判断为PRL

若待测样本中的显著差异特征为PDL1、SSTR2/5和MGMT中的一种或多种分子标志物，和/或存在免疫耗竭时，判断为TSH/silent pit1

若待测样本中的显著差异特征为EGFR分子标志物，和/或USP8基因突变和/或EGFR配体激活时，判断为ACTH亚型，肿瘤侵袭概率≥33.3％；

若待测样本中的显著差异特征为MGMT分子标志物，和/或EGFR T693位点磷酸化时，判断为Silent TPIT亚型，肿瘤侵袭概率≥76％；

若待测样本中的显著差异特征为VEGFA、VEGFR2和DRD2中的一种或多种分子标志物，和/或缺氧性血管新生时，判断为SF1/NULL

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。