一种染料木素纳米混悬液的制备方法及该方法制备的染料木素纳米混悬液

摘要

本发明公开了一种染料木素纳米混悬液的制备方法及该方法制备的染料木素纳米混悬液，制备方法包括如下步骤：取适量染料木素，将其加入到含有稳定剂的溶液中，搅拌使其混合均匀，制成混悬液；将上述混悬液加入到研磨罐中，在行星研磨机中研磨，即得；其中，所述稳定剂为十二烷基硫酸钠和PVP‑VA64。与有机溶剂沉淀法相比，介质研磨法能够避免有机溶剂在制剂中的使用，且更便于工业生产，具有简单、高效、可控等优点，本发明采用介质研磨法成功制备出GNS‑NS，有效地提高了GNS的体外溶出度以及膜渗透性，为GNS的后续口服给药制剂设计提供了依据。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种染料木素纳米混悬液的制备方法及该方法制备的染料木素纳米混悬液。

背景技术

染料木素(Genistein,GNS)是一种天然的异黄酮类化合物，其作为典型的植物雌性激素具有广泛的药理学作用，如抑制酪氨酸和拓扑异构酶活性、诱导细胞凋亡、抑制破骨细胞和淋巴细胞功能、抗骨质疏松症、降低心血管疾病发作的风险、缓解绝经后的问题、以及降低患乳腺癌、前列腺癌和肺癌的风险等，是极具发展潜力的药物。GNS易溶于二甲基亚砜、甲醇等有机溶剂，但其极难溶于水，溶出度低，口服生物利用度低。目前已有报道将染料木素制备成固体分散体、固体脂质体、纳米晶体、纳米乳等制剂从而提高其在体内的生物利用度。

纳米混悬液是一种含稳定剂的纯药物粒子的亚微米胶体分散体。通过研磨或者晶体析出的方式使难溶性药物粒子的粒径达到亚微米甚至毫微米级，从而提高药物比表面积，进而提高难溶性药物的溶出度、溶出速率以及生物利用度。除此之外，将纳米混悬液固化后还能提高制剂的载药量和物理化学稳定性。根据纳米粒子形成原理的不同，纳米混悬液的制备方法主要有沉淀法、介质研磨法和高压匀质法。由于介质研磨法使用时不涉及有机溶剂，且操作简单、研磨效率高、重现性好而运用广泛。近年来，运用介质研磨法制备的已上市的纳米制剂药物有惠氏制药公司的西罗莫司

为了提高染料木素的溶出速率和生物利用度，本实验前期筛选稳定剂，通过介质研磨法制备了染料木素纳米混悬液，运用响应面曲线法优化处方工艺，并对其粒径及分布、Zeta电位、晶型结构、粒子形态进行表征，通过μDiss和μFlux原位光纤系统支持的体外溶出及渗透性实验等对GNS-NS进行体外评价。基于该研究结果，特提出本发明创造。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种染料木素纳米混悬液的制备方法及该方法制备的染料木素纳米混悬液。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种染料木素纳米混悬液的制备方法，包括如下步骤：

取适量染料木素，将其加入到含有稳定剂的溶液中，搅拌使其混合均匀，制成混悬液；将上述混悬液加入到研磨罐中，在行星研磨机中研磨，即得；

其中，所述稳定剂为十二烷基硫酸钠和PVP-VA64。

优选地，所述十二烷基硫酸钠和PVP-VA64的质量比为1:1。

优选地，搅拌条件为：在200r/min的磁力搅拌速度下搅拌30min。

优选地，混悬液浓度为10mg/mL。

优选地，在研磨罐中加入半径0.3mm的锆珠。

优选地，在行星研磨机以300r/min的研磨速度研磨1.5h。

上述制备方法制备的染料木素纳米混悬液。

上述染料木素纳米混悬液用于制备染料木素口服给药制剂的用途。

有益效果：

与有机溶剂沉淀法相比，介质研磨法能够避免有机溶剂在制剂中的使用，且更便于工业生产，具有简单、高效、可控等优点，本发明采用介质研磨法成功制备出GNS-NS，有效地提高了GNS的体外溶出度以及膜渗透性，为GNS的后续口服给药制剂设计提供了依据。

附图说明

图1为药物浓度与PVP-VA64浓度对染料木素平均粒径D50影响的响应面图(上)与等高线图(下)；

图2为药物浓度与研磨时间对染料木素平均粒径D50影响的响应面图(上)与等高线图(下)；

图3为研磨时间与PVP-VA64浓度对染料木素平均粒径D50影响的响应面图(上)与等高线图(下)；

图4为GNS(上)、PM(中)、GNS-NS(下)的偏光显微镜结果图；

图5为GNS(③)、PM(①)、GNS-NS(②)的X射线粉末衍射结果图；

图6为GNS、PM、GNS-NS在FaSSIF中的溶出曲线图；

图7为GNS、PM、GNS-NS的渗透曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

1、实验材料

1.1试剂

染料木素(含量高于99.8％，上海源叶生物有限公司)；PVP-VA64(上海源叶生物有限公司)；HPMC-AS(阿拉丁试剂有限公司)；MC(美国ISP公司)；PEG400(阿拉丁试剂有限公司)；TPGS(阿拉丁试剂有限公司)；PVA(阿拉丁试剂有限公司)；SDS(阿拉丁试剂有限公司)；Tween 80(阿拉丁试剂有限公司)；Poloxamer188(阿拉丁试剂有限公司)；PEG6000(阿拉丁试剂有限公司)；FaSSIF powder(美国Biorelevant公司)；水为超纯水；其他试剂均为市售分析纯。

1.2仪器

Malvern Zerasizer纳米粒径仪(英国马尔文公司)；PM400行星式球磨机(德国莱驰公司)；ZX95氧化锆珠(江苏卓新研磨科技有限公司)；徕卡LAS X偏光显微镜(德国徕卡公司)；X射线粉末衍射仪(美国布鲁克公司)；飞纳扫描电镜(荷兰飞纳公司)；PION微量溶出渗透仪(美国PION公司)。

2、实验方法和结果

2.1GNS-NS的制备

采用介质研磨法制备GNS-NS。精确称量40mg的GNS，将其加入到含有稳定剂的4mL溶液中，在200r/min的磁力搅拌速度下，搅拌30min，使其混合均匀,制成质量浓度约10mg/mL的混悬液。将上述混悬液加入到12mL研磨罐中，加入4mL半径为0.3mm的锆珠，在行星研磨机以300r/min研磨速度，研磨1.5h，得到GNS-NS。

2.2染料木素粗混悬液(PM)的制备

精确称量40mg的GNS，将其加入到含有稳定剂的4mL溶液中，在200r/min的磁力搅拌速度下，搅拌3h，使其混合均匀，制成质量浓度约10mg/mL的PM。

2.3粒径(D50)、多分散指数(PDI)以及Zeta电位的测定

取适量GNS-NS用超纯水稀释50倍，置于纳米粒度分析仪器中，测量其粒径(D50)、多分散指数(PDI)、Zeta电位。

2.4处方筛选

2.4.1稳定剂筛选

为了制备出稳定的纳米混悬液，需要通过稳定剂来提供空间位阻或静电排斥作用来避免粒子之间的聚集以及保持粒子均匀的粒径。而根据Noyes-Whitney溶出速率方程，药物的粒径越小，其表面积越大，溶出越快

由表1可知，当使用单一表面活性剂作为稳定剂时，Tween 80和Poloxamer188制备的纳米混悬液平均粒径较大，分别为(543±8)nm和(842±7.5)nm，使用SDS作为稳定剂时混悬液平均粒径较小且分布均匀，Zeta电位的绝对值大于30mV，可以提供较好地稳定作用。由于带电表面活性剂与中性聚合物对稳定纳米混悬液具有协同作用，可以使前者在药物上排列的更紧密，所以选择SDS和另外一种可以提供空间位阻的聚合物进行试验。由结果可知SDS与PVP-VA64联合使用时结果较好，故选择SDS和PVP-VA64作为稳定剂进行后续实验。

稳定剂的含量会对粒径及分布产生影响。当染料木素的含量为10mg/mL，使用PVP-VA64与SDS质量分数都是0.25％时，D50为(197±0.8)nm，PDI为(0.220±0.015)；当同时提高质量分数为0.5％时，D50降低到(150±1.2)nm，PDI为(0.217±0.001)；继续提高质量分数至1％时，D50升高到(172±1)nm，PDI为(0.291±0.004)；当质量分数提高到1.5％时，D50增大到(218±0.7)nm，PDI增大到(0.306±0.002)。由结果可知随着稳定剂用量的增大，纳米混悬液的粒径呈现先减小后增大的趋势。

表1稳定剂筛选

2.4.2单因素实验

2.4.2.1稳定剂配比优化

采用表2所示稳定剂配比按照“2.1”项下制备纳米混悬液，测量其粒径、PDI及Zeta电位，结果见表2。由表可知，当固定SDS的含量为0.5％，设定PVP-VA64含量分别为0.5％、1％、1.5％时，D50为(180±1.5)、(161±1.2)、(186±0.8)nm，呈现先减小后增大的趋势；当固定PVP-VA64含量为1％，设定SDS含量分别为0.5％、1％、2％时，D50分别为(161±1.2)、(194±1.7)、(285±2.6)nm，呈现逐渐增大的趋势。因此后续实验固定SDS含量为0.5％，对PVP-VA64含量进行优化。

表2稳定剂配比优化

2.4.2.2药物浓度优化

当药物质量浓度分别为10、15、20、30、40mg/mL时，按照“2.1”项下制备纳米混悬液，测量其粒径、PDI及Zeta电位，结果见表3。当药物浓度从10mg/mL增大到15mg/mL时，D50从(180±1.5)nm略微减小到(172±1.3)nm，而当药物浓度从15mg/mL增大到40mg/mL时，D50逐渐增大。因此选择10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL进行后续筛选。

表3药物浓度优化

2.4.2.3研磨时间优化

按照“2.1”项下制备纳米混悬液，分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h时取样测定混悬液的粒径、PDI及Zeta电位，结果见表4。由结果可知，随着研磨时间不断增加，D50不断减小。考虑到研磨时间过长会带来氧化锆珠磨损，引起氧化锆珠的残留，因此，选择2h、3h、4h进行后续优化。

表4研磨时间优化

2.4.2.4研磨介质尺寸

分别采用半径为0.5、0.3、0.2mm的氧化锆珠，按照“2.1”项下制备纳米混悬液，测定混悬液的粒径，结果分别为(210±1.5)、(182±1.2)、(130±1.5)nm。可知当使用半径为0.2mm的氧化锆珠时，产品的粒径最小，所以选择0.2mm的氧化锆珠进行后续实验。

2.4.2.5研磨介质含量

分别使用相当于混悬液体积0.5、0.75、1、1.25、1.5倍体积的氧化锆珠，依法所得的纳米混悬液粒径分别为(326±5)、(234±6)、(180±1.7)、(138±1.5)、(125±2)nm。从结果可知，当研磨介质含量增大时，产品的粒径会降低。但介质含量过大会降低研磨效率。因此后续实验研磨介质的体积为混悬液体积的1.5倍。

2.4.3响应面曲线法优化处方

由单因素实验可知，稳定剂配比、药物浓度以及研磨时间对混悬液的粒径影响较大，因此选择这三个因素，运用Design——Expert(version 7.0)软件程序，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面曲线法，以纳米混悬液的平均粒径D50为响应值，对实验数据进行回归分析，优化制备染料木素纳米混悬液的处方(水平设计表见表5)。再采用Design-Expert(version 7.0)数据处理软件对表6的实验结果进行统计处理，结果见表7与表8，得如下方程，模型P<0.0001，差异极其显著，具有统计学意义；失拟项P>0.05，表明模型拟合度良好；B、C、BC、B

Y＝+69.62-0.2125A+11.39B-18.53C+0.05AB-0.825AC-5.58BC+1.89A

响应面分析见图1～图3，由图可知，PVP-VA64浓度与研磨时间的曲面较陡，表明其交互作用对D50的影响显著，而与研磨时间、PVP-VA64浓度与药物浓度的响应面的曲线较平滑，表明其交互作用对D50的影响较小。可知PVP-VA64浓度和研磨时间之间交互作用有明显影响。

表5水平设计表

表6响应面优化实验设计结果

表7方差分析表

*P<0.05 was generally significant；**P<0.01 indicates significantdifference；***P<0.001 is considered as extremely significant difference.

2.4.4最优制备工艺及验证

通过Design-expert软件分析得到的最佳提取工艺为：药物浓度：16.6mg/mL、SDS含量为0.5％、PVP-VA64含量为1.06％、研磨时间为2.7h。按照该工艺制备的GNS-NS的平均粒径为(63.4±3.5)nm，PDI为(0.212±0.007)，Zeta电位为(-30±3)mV，符合预期。

2.5GNS-NS的表征

2.5.1PLM

使用偏振光显微镜对GNS-NS进行观察，采用20X物镜，调节合适焦距，结果与GNS、PM的图谱作比较，如图4所示。由结果可知，GNS-NS中药物有晶体结构，粒径小于2μm。

2.5.2XRPD

将GNS-NS涂硅基板上进行XRPD的测试，结果与GNS、PM的图谱作比较，如图5所示。由图可知，GNS-NS中药物晶体结构未发生改变。

2.5.3SEM

取经干燥后的GNS-NS适量，黏于贴有导电胶的样品台上，吹未黏附于导电胶的药物，真空镀金后用SEM观察，其SEM照片与GNS、PM照片作比较。由结果可知GNS-NS呈不规则球状，且大小均一。

2.6体外溶出实验

由于纳米粒子很难通过过滤或者离心等方法去除，这给准确测定纳米混悬液的体外溶出带来了挑战。传统上一般使用透析膜或者尼龙滤膜来达到限制纳米颗粒的效果，但由于本实验中的纳米混悬液的粒径过小，采用传统方法仍然难以准确测量。因此本实验采用μDiss光纤药物溶解性测定仪来进行实验，通过一种特殊的二阶导数光谱分析(零截距法，ZIM

精密称取GNS、GNS-NS、PM适量(相当于GNS 1mg)，以空腹状态下人工胃液(FaSSIF)为溶出介质，体积为20mL，搅拌速度为250r/min，温度为37℃，采集时间为2h，采样间隔为30s，在280～320nm紫外波长范围内采用光纤探头分别检测药物浓度。实验结果如图6所示。由图6可知，GNS-NS的累积释放量明显高于GNS以及PM。GNS-NS在1min内，在人工胃液中基本溶出完全；在5min时，GNS-NS的溶出度分别是GNS、PM的倍；因此，将GNS制备成GNS-NS后能够显著提高其溶出速率和溶出度，原因在于原料药经过研磨后，粒径变小，从而表面积增大。根据Noyes-Whitney方程可知，表面积增大可以提高溶出速率，而由于药物粒径的减小，其增强了小纳米晶体的溶解压力，进而提高了溶出度。

2.7体外渗透性实验

本实验采用人工过滤膜所支撑的体外渗透性技术(PAMPA)测定样品在被动转运中的有效渗透性。该装置由供给室和接受室组成，两室之间由仿生膜隔开。装有人工胃液(FaSSIF)的供给室代表人体胃肠道，装有ASB缓冲液的接受室代表人体血液，涂有胃肠道模拟脂质体(GIT)的仿生膜则代表胃肠道细胞。待测样品于供给室中溶解，通过仿生膜，进入接受室，期间通过原位光纤实时检测药物的浓度变化，测定药物的渗透相关参数。

精密量取人工胃液和ASB缓冲液各20mL，分别置于供给室和接受室中，用25uL的脂溶液(GIT)润湿面积为1.54cm

Flux＝dc/dt*V/A

Flux为渗透速率，即药物在单位时间通过单位膜面积的量(μg.min

渗透曲线如图7所示，渗透速率如表所示。结果显示，GNS-NS的渗透速率为，高于GNS和PM。这是由于相同质量不同大小的粒子，粒子粒径越小，其与膜表面积接触的更多，与膜的粘附性更强，在膜上转移时间更长，能更迅速，且更多的透过人工膜。

3、总结分析

通过前期稳定剂筛选，本实验筛选出提供空间位阻作用的PVP-VA64与提供静电排斥作用的SDS为稳定剂，并利用介质研磨法制备出GNS-NS。接着以药物浓度、稳定剂配比及研磨时间为主要考察因素，粒径为主要指标，采用3因素3水平的响应面曲线设计法得到最优处方。通过测定优化处方的粒径，发现其比处方优化前降低了65％。结合PLM、XRPD和SEM方法对GNS-NS的形态进行分析，发现其药物粒子为不规则球形，晶型结构没有改变。通过μDiss光纤药物溶解性测定仪来进行体外溶出实验发现，GNS-NS相比于GNS和PM在FaSSIF中的溶出速度、溶出度都显著提高。通过体外渗透性技术(PAMPA)测定GNS-NS的渗透性，结果发现与GNS和PM相比，GNS-NS的膜渗透性显著提高。

筛选稳定剂用量时发现随着稳定剂用量的增大，纳米混悬液的粒径呈现先减小后增大的趋势。这可能是由于当稳定剂含量较低时，其不能充分的润湿粒子的表面，从而达不到稳定作用；而当稳定剂含量过高则会使得溶液黏度增高，弱化粒子在分散介质中的震动频率及加快Ostwald熟化的过程，反而不利于纳米混悬液的稳定。

通过响应面曲线法优化处方结果可知，药物浓度对D50的影响并不显著，这可能是由于实验所考察的稳定剂浓度相对于药物浓度比例较大，即少量的稳定剂足以达到稳定作用。后续可以继续提高药物浓度的范围，探求最高药物浓度。本实验只对GNS-NS进行了体外表征，并未进行体内评价，后续应该进行动物实验以更好地考察制剂的效果。

相比于pH buffer，本实验采用空腹状态下模拟人胃液(FaSSIF)来作为溶出介质，能更好的模拟体内溶出的真实环境。由于GNS-NS的D50为(64.2±3.5)nm，若采用传统的微孔过滤或透析袋的方法，难以完全除去纳米粒子对实验结果的干扰，而本实验采用原位光纤溶出仪进行溶出试验，不仅可以排除纳米粒子的干扰，还可以实现实时监测溶出的作用。而本实验所采用的渗透技术是基于人工滤膜支撑的体外渗透膜性(PAMPA)，其具有使用便捷、迅速、重复性好、价格便宜等优点，且有文献证明其与人体小肠灌流测定的结果具有正相关性，相关系数为0.83。

与有机溶剂沉淀法相比，介质研磨法能够避免有机溶剂在制剂中的使用，且更便于工业生产，具有简单、高效、可控等优点，而本实验采用介质研磨法成功制备出GNS-NS，有效地提高了GNS的体外溶出度以及膜渗透性，为GNS的后续口服给药制剂设计提供了依据。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。