一种利用HPLC-MS/MS法检测水体中S-诱抗素含量的方法及应用

摘要

本发明涉及一种利用HPLC‑MS/MS法检测水体中S‑诱抗素含量的方法及应用，所述检测方法采用HPLC‑MS/MS法测定水体中S‑诱抗素含量，该检测方法时间短，操作简便、快速、准确，分离效果好，准确度和精密度高，其检出限LOQ可以达到0.022μg/L，定量限LOQ可达到0.073μg/L，对水质检测、环境生物及水资源保护有重要意义，为水质评价及水环境检测提供检测技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种利用HPLC-MS/MS法检测水体中S-诱抗素含量的方法及应用。

背景技术

S-诱抗素(S-abscisic acid)又叫脱落酸，是植物五大激素之一。它存在于衰老的叶片组织、成熟的果实、种子及植物的茎、根等部位，是植物生长发育、成熟各阶段的重要调控因子。S-诱抗素具有促进植物叶片脱落、芽和种子休眠、抑制植物细胞的分裂和延长、引起气孔关闭、影响种子胚的发育、增加植物在生物和非生物胁迫下的抗逆性、影响性的分化等多方面的作用。S-诱抗素在实际生产中主要用于促进葡萄、草莓、红枣、苹果等果实的转色，延缓或抑制麦草、小麦、水稻等种子萌发和发芽；提高作物在高温、低温、干旱和水涝下的生存能力；提高作物对病原菌和害虫的抗性，从而提高防治药剂的药效；延长鲜切花的花期，促进氮磷钾的吸收，提高作物产量。因此，S-诱抗素在农业生产中具有广阔的应用前景。但农药使用必然会对环境生物产生一定的影响，而农药施用后也会通过淋溶、飘移、径流等途径进入水环境中，降低水生生态环境的质量，影响水生生态系统，甚至整个生态系统的结构和功能，进而对水生生物产生危害，因此，寻找检测水体中S-诱抗素含量的测定的方法，对水体中S-诱抗素含量进行分析测定十分必要。

文献1：S-诱抗素的高效液相色谱分析，四川农药检定所的陈丙坤、高立明,吴春先,王广成。本方法公开了S-诱抗素的反相高效液相色谱定量分析方法。样品溶于甲醇中,采用二极管阵列检测器和Agilent chiradex 250mm×4mm(i.d),5μm手性柱；以甲醇:纯水(60:40,v/v)作为流动相,流速为0.8mL/min，其测定浓度为100mg/L。

文献2：高效液相色谱法测定S-诱抗素及对其设计浓度验证，山东农业大学植物保护学院，姚晨涛，刘铭钰，孙晓，贾芳莹，彭宇漩，姜兴印。本方法建立了S-诱抗素的高效液相色谱检测方法，采用Pgrandsil-STC-C18分离，紫外检测器检测，以甲醇+甲酸水溶液为流动相，在260nm波长条件下测定S-诱抗素质量分数，其测定浓度范围为1～100mg/L范围内。

文献1和文献2存在的技术问题：检测灵敏度并不高，检测时间长，检测限级别均为mg/L，不能满足水中S-诱抗素检测痕量或超痕量的检测。

针对以上问题，发明团队经过了大量的试验探究，采用HPLC-MS/MS法测定水体中S-诱抗素含量，克服了用高效液相色谱法高检出限，检测时间长的技术问题。本发明具有检测时间短，操作简便、快速、准确，分离效果好，准确度和精密度高，其检出限LOQ可以达到0.022μg/L，定量限LOQ可达到0.073μg/L，对水质检测、环境生物及水资源保护有重要意义，为水质评价及水环境检测提供检测技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用HPLC-MS/MS法检测水体中S-诱抗素含量的方法。

本发明的另一目的是提供了一种利用HPLC-MS/MS法检测水体中S-诱抗素含量的方法的应用。

本发明所所述检测方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备

精密称取1～50％S-诱抗素可溶粒剂0.10g～2.00g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声5～15min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱，规格为2.1mm×50mm×1.8μm，以比例为20～60：40～80的0.05～0.15％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，母离子263.1，子离子219为定量离子，驻留时间180～220s，Fragmentor 105V，碰撞能量10eV；监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，母离子263.1，子离子153为定量离子，驻留时间180～220s，Fragmentor 105V，碰撞能量8eV；

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2～5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

优选的，

所述(1)供试品溶液的制备为：精密称取3～10％S-诱抗素可溶粒剂0.20g～1.00g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声8～12min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用。

进一步优选的，

所述(1)供试品溶液的制备为：精密称取5％S-诱抗素可溶粒剂0.2003g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声10min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用。

本发明所述曝气水为饮用水经过曝气处理24h以上。

优选的，

所述步骤(3)色谱条件与系统适用性试验中，HPLC操作条件为：仪器为Agilent1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic Plus RRHD柱，规格为2.1mm×50mm×1.8μm，以比例为30～50：50～70的0.06～0.12％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃。

进一步优选的，

所述步骤(3)色谱条件与系统适用性试验中，HPLC操作条件为：仪器为Agilent1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic Plus RRHD柱，规格为2.1mm×50mm×1.8μm，以比例为35～45：55～65的0.08～0.1％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃。

更进一步优选的,

所述步骤(3)色谱条件与系统适用性试验中，HPLC操作条件为：仪器为Agilent1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic Plus RRHD柱，规格为2.1mm×50mm×1.8μm，以比例为40：60的0.1％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃。

本发明所述方法的定性鉴定为：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对比色谱峰S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

本发明所述检测方法对S-诱抗素的检出限LOQ为0.022μg/L，定量限LOQ为0.073μg/L。

本发明所述检测方法在水质检测、环境生物及水资源保护方面的应用。

本发明具有以下优点：

1、本发明通过了MRM离子参数的考察试验，步骤为：1)根据S-诱抗素结构设置质谱扫描模式为负极性，采用全扫描模式(SCAN)对对照品溶液进行扫描，设置Fragmentor电压为80～160V，得到S-诱抗素母离子为263.1，Fragmentor电压为110V时响应值最高。(2)采用负极性选择离子监测模式(SIM)对对照品溶液进行扫描，设置监测离子为263.1，进一步设置Fragmentor电压为100～120V，得到Fragmentor电压为105V时响应值最高。(3)采用负极性子离子监测模式(PRO)对对照品溶液进行扫描，设置监测母离子为263.1，Fragmentor电压为105V，设置碰撞能量为0～20ev，得到S-诱抗素响应较高的两个子离子分别为219和153，且碰撞能量为10ev时子离子219响应值最高；碰撞能量为8ev时子离子153响应值最高。(4)设置质谱条件为负极性多反应监测模式(MRM)，监测母离子为263.1，Fragmentor电压为105V，监测的两个子离子分别为219和153，子离子219的碰撞能量设置为10ev，子离子153的碰撞能量设置为8ev，最终得到的S-诱抗素的MRM参数。

2、本发明明通过了色谱柱的考察试验，结果显示：色谱柱Hilic Plus RRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)，峰型和分离度均较好，所以水体中S-诱抗素含量检测方法用Hilic PlusRRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)色谱柱。

3、本发明通过了流动相的考察试验，结果显示：流动相为“0.1％甲酸水：乙腈(40：60)”时，色谱峰的分离度好，峰形好，出峰时间短，故为优选流动相。

4、本发明的检测方法通过了方法学验证，结果显示：1)线性验证，S-诱抗素在5.0μg/L～200.0μg/L浓度范围内的线性关系良好，线性方程为y＝64.158x-13.617，相关系数为R2＝0.9997；2)重复性试验，取标准试验液，重复进样6次，S-诱抗素平均浓度为49.28μg/L，RSD值为0.45％，表明该方法精密度好；3)检出限和定量限，取同一标准试验液，重复进样6次，结果水中S-诱抗素检测的检出限LOD为0.022μg/L，定量限LOQ为0.073μg/L；4)加标回收率试验，分别准确加入1.0mL1000μg/L的S-诱抗素标样溶液加入S-诱抗素试验溶液中进行检测，结果显示5次平行测定的平均回收率为95.9％；5)样品检测试验，精密称取同一批5％S-诱抗素可溶粒剂10份，按本发明方法检测，结果显示十个样品含平均含量为19.91μg/L，RSD值为1.3％，证明该方法检测稳定性和可靠性。

5、本发明具有操作简便、快速、准确，分离效果好，准确度和精密度高等优点，克服了以往用高效液相色谱法等方法的高检出限，运行时间长等的技术问题，采用HPLC-MS/MS法测定水体中S-诱抗素的含量，检出限LOD值可以达到0.022μg/L，定量限可达到0.073μg/L，而且仪器运行时间短，灵敏度高，能很好检测出水体中S-诱抗素的含量，为水质评价及水环境检测提供检测技术支撑。

6、S-诱抗素是植物五大激素之一，属于子午生长调节剂类农药，活性很高，应用作物范围广泛。对人低毒性，但对家蚕毒性很高，对水生植物藻类有毒，本发明对水质检测、环境生物及水资源保护有重要意义。

附图说明

图1：S-诱抗素线性关系图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)供试品溶液的制备

精密称取5％S-诱抗素可溶粒剂0.2003g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声10min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为40：60的0.1％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例2

(1)供试品溶液的制备

精密称取1％S-诱抗素可溶粒剂2.0000g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声10min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为20：80的0.05％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例3

(1)供试品溶液的制备

精密称取50％S-诱抗素可溶粒剂0.1000g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声15min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为60：40的0.15％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例4

(1)供试品溶液的制备

精密称取3％S-诱抗素可溶粒剂0.2002g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声8min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为30：70的0.08％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各3μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例5

(1)供试品溶液的制备

精密称取10％S-诱抗素可溶粒剂0.2008g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声12min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为50：50的0.12％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各4μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例6

(1)供试品溶液的制备

精密称取20％S-诱抗素可溶粒剂0.2005g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声6min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为25：75的0.07％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例7

(1)供试品溶液的制备

精密称取30％S-诱抗素可溶粒剂0.3003g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声7min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为35：65的0.09％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例8

(1)供试品溶液的制备

精密称取40％S-诱抗素可溶粒剂0.2009g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声9min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为25：75的0.11％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例9

(1)供试品溶液的制备

精密称取8％S-诱抗素可溶粒剂0.2006g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声13min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为35：65的0.13％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各3μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例10

(1)供试品溶液的制备

精密称取3％S-诱抗素可溶粒剂0.2003g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声14min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为55：45的0.14％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例11

(1)供试品溶液的制备

精密称取15％S-诱抗素可溶粒剂0.2001g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声5min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为25：75的0.11％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实施例12

(1)供试品溶液的制备

精密称取25％S-诱抗素可溶粒剂0.1000g于100mL容量瓶中，加入曝气水溶解，超声9min，再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic PlusRRHD柱(2.1mm×50mm×1.8μm)，以比例为38：62的0.09％甲酸水溶液-乙腈为流动相，流速为0.3mL/min，柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：

1仪器及试剂

1.1仪器

Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS，具有AJS ESI离子源，Masshunter数据采集、定性分析、定量分析工作站；

色谱柱：Hilic Plus RRHD(2.1×50mm，1.8μm)。

1.2试剂

乙腈：色谱纯，ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai)Inc Lot：A0521440)

超纯水：电阻率，18.2MΩ*cm；

曝气水：实验室自制；

S-诱抗素标准品：已知质量浓度，100μg/mL(A ChemTek Inc，Lot：S007321)。

2检测方法的考察

2.1S-诱抗素MRM离子采集参数的考察

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

母离子的确定：以监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，根据S-诱抗素结构设置质谱扫描模式为负极性，采用全扫描模式(SCAN)对对照品溶液进行扫描，设置Fragmentor电压为80～160V，得到S-诱抗素母离子为263.1，Fragmentor电压为110V时响应值最高。

电压的确定：以监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，采用负极性选择离子监测模式(SIM)对对照品溶液进行扫描，设置监测离子为263.1，进一步设置Fragmentor电压为100～120V，得到Fragmentor电压为105V时响应值最高。

碰撞能量的确定：以监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，采用负极性子离子监测模式(PRO)对对照品溶液进行扫描，设置监测母离子为263.1，Fragmentor电压为105V，设置碰撞能量为0～20ev，得到S-诱抗素响应较高的两个子离子分别为219和153，且碰撞能量为10ev时子离子219响应值最高；碰撞能量为8ev时子离子153响应值最高。

MRM离子参数的确定的步骤为：(1)根据S-诱抗素结构设置质谱扫描模式为负极性，采用全扫描模式(SCAN)对对照品溶液进行扫描，设置Fragmentor电压为80～160V，得到S-诱抗素母离子为263.1，Fragmentor电压为110V时响应值最高。(2)采用负极性选择离子监测模式(SIM)对对照品溶液进行扫描，设置监测离子为263.1，进一步设置Fragmentor电压为100～120V，得到Fragmentor电压为105V时响应值最高。(3)采用负极性子离子监测模式(PRO)对对照品溶液进行扫描，设置监测母离子为263.1，Fragmentor电压为105V，设置碰撞能量为0～20ev，得到S-诱抗素响应较高的两个子离子分别为219和153，且碰撞能量为10ev时子离子219响应值最高；碰撞能量为8ev时子离子153响应值最高。(4)设置质谱条件为负极性多反应监测模式(MRM)，监测母离子为263.1，Fragmentor电压为105V，监测的两个子离子分别为219和153，子离子219的碰撞能量设置为10ev，子离子153的碰撞能量设置为8ev，最终得到的S-诱抗素的MRM参数，见表1。

表1 S-诱抗素的MRM参数表

*为定量离子

定性鉴定：HPLC-MS/MS测定记录色谱峰面积，对于S-诱抗素的母离子和子离子对，若其离子色谱保留时间与标样品工作溶液变化范围在±2.5％之内；且样品中目标化合物的两个离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在S-诱抗素，若上述两个条件不能同时满足，则判断不含S-诱抗素。

2.2色谱柱的考察

精密称取5％的S-诱抗素可溶粒剂0.2003g于100mL容量瓶中,用曝气水溶解,超声10min,再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，分别用以下色谱柱测定：

ACQUITY HPLC BEH(100mm×2.1mm,1.7μm)；

ACQUITY HPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)MVK；

Hilic Plus RRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)。

结果显示：用不同规格的色谱柱考察优化中的含量色谱条件，色谱柱Hilic PlusRRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)，峰型和分离度均较好，所以水体中S-诱抗素含量检测方法用Hilic Plus RRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)色谱柱。

2.3流动相的考察

取“2.2”项下处理的供试品，以检测仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS,色谱柱为Hilic Plus RRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；分别用表2中的流动相进行测定。

表2流动相考察结果表

结果：由表2可知，流动相为“0.1％甲酸水：乙腈(40：60)”时，色谱峰的分离度好，峰形好，出峰时间短，故为优选流动相。

2.3结论

经过以上筛选实验，得出水体中S-诱抗素含量测定的优选方法如下：

(1)供试品溶液的制备

精密称取5％的S-诱抗素可溶粒剂0.2003g于100mL容量瓶中,用曝气水溶解,超声10min,再用曝气水稀释至刻度得供试品储备液；取供试品储备液2.0mL于100mL的容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，再取该溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用曝气水稀释至刻度，混匀，得供试品溶液，备用；

(2)对照品溶液的制备

准确移取S-诱抗素标样0.10mL置于100.00mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得对照品储备液；取适当对照品储备液，用超纯水稀释成浓度5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L的对照品标准工作溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验

HPLC操作条件：仪器为Agilent 1260-6460C HPLC-MS/MS；色谱柱为Hilic PlusRRHD(2.1mm×50mm×1.8μm)；以0.1％甲酸水溶液-乙腈(40：60)为流动相；流速为0.3mL/min；柱温为40℃；

MSD操作条件：质谱检测使用AJS ESI离子源，负离子模式，离子源参数：干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，鞘气：N2，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10L/min，雾化器压力：45psi，喷嘴电压：500V，毛细管电压：+3500V；

MRM离子采集参数:监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，母离子263.1，子离子219为定量离子，驻留时间180～220s，Fragmentor 105V，碰撞能量10eV；监测时间为0～2.0min，化合物名称S-诱抗素，母离子263.1，子离子153为定量离子，驻留时间180～220s，Fragmentor 105V，碰撞能量8eV；

(4)测定和结果计算

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，进行HPLC-MS/MS测定，记录色谱图，按外标法计算S-诱抗素的含量。

3方法验证试验

3.1线性验证

准确取0.10mLS-诱抗素标样(100μg/mL)置于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得S-诱抗素浓度为200.0μg/L的标样母液。准确吸取适当该对照品母液，用超纯水稀释配制成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg/L的S-诱抗素标准工作溶液，上机进行测定，以S-诱抗素的浓度为横坐标，S-诱抗素的峰面积为纵坐标绘制校正曲线。得到S-诱抗素线性方程为y＝64.158x-13.617，其线性相关系数为0.9997，线性相关性的测定结果见表3和图1。表明S-诱抗素线性关系良好。

表3分析方法的线性相关性试验结果

3.2重复性试验

取“3.1”项下制备的标准试验液，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定S-诱抗素的含量，S-诱抗素平均浓度为49.28μg/L，计算S-诱抗素精密度RSD值为0.45％，表明该方法精密度好，测定结果见表4。

表4重复性试验结果

3.3检出限和定量限

取“3.1”项下制备的5.0μg/L标准试验液STD-1，在上述色谱条件下，重复进样6次，根据S/N值计算出方法检出限LOD和定量限LOQ值，试验结果表明，所建立的方法对S-诱抗素的LOD为0.022μg/L，LOQ为0.073μg/L。详细结果见表5。

表5检出限和定量限试验结果

3.4加标回收率试验

取5％S-诱抗素可溶粒剂5份，分别用曝气水溶解稀释配制成20μg/L的S-诱抗素试验溶液，取20μg/L的S-诱抗素试验溶液50.0mL于100ml容量瓶中，准确加入1.0mL乙腈配制的浓度为1000μg/L的S-诱抗素标样溶液，用曝气水定容至刻度，混合均匀，用于回收率试验，按前述操作条件进行测定，同时取20μg/L的S-诱抗素试验溶液上机测定样品溶液浓度，以实测值计算加标回收率，5次平行测定的平均回收率为95.9％，结果见表6。

表6 S-诱抗素曝气水中回收率试验结果

3.5样品检测试验

精密称取同一批5％S-诱抗素可溶粒剂10份，分别按“2.3”的方法进行含量测定，结果见表7。

表7样品检测试验结果

结论：从表7可知，十个样品含平均含量为19.91μg/L，十个样品测定值RSD值为1.3％，证明该方法检测的可靠性和稳定性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。