Deptor作为靶点在制备促进头颈癌放疗增敏的药物中的应用

摘要

本发明涉及Deptor作为靶点在制备促进头颈癌放疗增敏的药物中的应用。本发明对Deptor与头颈癌放疗耐受的相关性进行了深入研究，发现了因放疗导致的细胞内Deptor水平降低是产生头颈癌放疗耐受的关键原因之一，而通过过表达Deptor或通过Deptor增强剂维持或提高Deptor蛋白水平将能够有效降低头颈癌放疗耐受性的产生，提高放疗敏感性。本发明通过对临床头颈癌患者的分析发现，Deptor可作为独立的因素用于临床头颈癌患者放疗疗效的预测以及预后的评估，其对于解决头颈癌个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，为更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及Deptor作为靶点在制备促进头颈癌放疗增敏的药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤（癌症）是导致死亡的主要原因之一，是世界各国延长寿命的重要障碍，是严重威胁世界各国人民健康主要的公共问题。2015年，我国有429.2万人新诊断为恶性肿瘤，而恶性肿瘤的死亡率占所有死亡人数的23.91%。

恶性肿瘤的发生，与遗传以及来自于生活方式和环境因素导致的基因突变相关，如：吸烟、肥胖、不合理的膳食、缺乏运动、酗酒、激素、病毒感染等等。其恶性肿瘤的发生发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活以及非编码RNA、表观遗传学、干细胞的调控，进而影响下游信号通路有关。目前肿瘤的主要治疗手段包括：手术、化疗、放疗、生物治疗以及免疫治疗等的综合治疗。

头颈部肿瘤包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤三大部分。颈部肿瘤在综合性医院属于普通外科，比较常见的就是甲状腺肿瘤；耳鼻喉科肿瘤常见的有喉癌、副鼻窦癌等；口腔颌面部肿瘤常见的为各种口腔癌，如舌癌、牙龈癌、颊癌等。因此，头颈部所发生的肿瘤，其原发部位和病理类型之多，居全身肿瘤之首。超过90%的头颈部肿瘤为鳞状细胞癌。最近10年全球头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）的发病率明显上升，特别是在女性中。

近年来，在不断的技术进步的推动下，以放射治疗为基础的综合治疗正在增加，并已成为头颈癌的主要治疗方法，同时手术切除术的使用率也在下降。事实上，与放疗后行切除术相比，放疗后化疗具有相似的生存结果，但是生活质量却大幅度提高。尽管如此，头颈癌的预后仍然很差，其总生存率通常在治疗3-5年后低于50%。

此外，目前放疗决策通常是基于临床因素、手术难度和患者意愿，而不是肿瘤分子特征或放疗敏感性。因此，肿瘤可能因再耐药而对放疗无效。同时，这不仅导致患者可能无法从放疗中获益，产生难以忍受的副作用，而且在资源方面造成过度治疗。了解其机制或发现一些放疗耐受的生物标志物将有助于为未来的治疗提供新的药物靶点信息，克服放疗耐受性，使头颈癌细胞对放射敏感，减少放疗后的复发和转移。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中头颈癌放疗过程中易产生耐受的问题，从而提供了一种新的治疗靶点Deptor，通过维持或提高体内Deptor的表达水平，能够有效提升头颈癌放疗过程中的敏感性，降低耐受性的产生。且通过检测体内Deptor的表达情况，可以预期头颈癌的放疗耐受情况，为后期的治疗方案的制订以及预后评估提供辅助诊断依据。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了Deptor蛋白和/或Deptor增强剂在制备促进头颈癌放疗增敏的药物中的应用。

作为优选地，所述Deptor增强剂包括但不限于维持Deptor稳定性的试剂、促进Deptor过表达的试剂。

作为优选地，所述维持Deptor稳定性的试剂选自如下结构所示的化合物：

作为优选地，所述促进Deptor过表达的试剂选自包含Deptor mRNA序列的载体。

作为优选地，所述Deptor mRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选地，所述头颈癌选自下咽癌、鼻咽癌、甲状腺癌、喉癌、口腔癌中的一种或多种。

作为优选地，所述放疗选自光子线放疗。

作为优选地，所述光子线放疗选自X射线放疗、γ射线放疗中的一种或多种。

本发明第二方面提供了检测Deptor表达水平的试剂在制备用于检测头颈癌放疗敏感性和/或疗效预测的产品中的应用。

作为优选地，所述检测Deptor表达水平的试剂包括检测Deptor基因表达水平的引物和/或检测Deptor蛋白含量的试剂。

作为优选地，所述检测Deptor基因表达水平的引物选自下列引物对中的至少一对：

引物对1：上游序列如SEQ ID NO：2所示，下游序列如SEQ ID NO：3所示；

引物对2：上游序列如SEQ ID NO：4所示，下游序列如SEQ ID NO：5所示；

引物对3：上游序列如SEQ ID NO：6所示，下游序列如SEQ ID NO：7所示；

引物对4：上游序列如SEQ ID NO：8所示，下游序列如SEQ ID NO：9所示；

引物对5：上游序列如SEQ ID NO：10所示，下游序列如SEQ ID NO：11所示；

引物对6：上游序列如SEQ ID NO：12所示，下游序列如SEQ ID NO：13所示；

引物对7：上游序列如SEQ ID NO：14所示，下游序列如SEQ ID NO：15所示；

引物对8：上游序列如SEQ ID NO：16所示，下游序列如SEQ ID NO：17所示；

引物对9：上游序列如SEQ ID NO：18所示，下游序列如SEQ ID NO：19所示；

引物对10：上游序列如SEQ ID NO：20所示，下游序列如SEQ ID NO：21所示。

作为优选地，所述检测Deptor蛋白含量的试剂选自Deptor单克隆抗体和/或Deptor多克隆抗体。

作为优选地，所述检测Deptor蛋白含量的试剂选自DEPTOR/DEPDC6 （D9F5）（CellSignaling Technology，CST，货号为11816）。

作为优选地，所述头颈癌选自下咽癌、鼻咽癌、甲状腺癌、喉癌、口腔癌中的一种或多种。

作为优选地，所述放疗选自光子线放疗。

作为优选地，所述光子线放疗选自X射线放疗、γ射线放疗中的一种或多种。

泛素-蛋白酶体系统介导的非溶酶体蛋白降解过程是机体调节细胞内蛋白水平与功能发挥的重要机制。本发明通过大量研究发现，放疗处理后会导致头颈癌细胞中Deptor表达水平降低，通过对Deptor过表达或利用Deptor增强剂，则可以有效恢复由于放疗导致的细胞内Deptor水平降低；同时还发现，Deptor增强剂诱导的放疗后Deptor的回复与蛋白酶体介导的蛋白降解有关，通过抑制蛋白降解，将可以有效维持细胞内Deptor的水平。当敲除头颈癌细胞中Deptor后，则会促进细胞对放疗耐受性的产生，而在对Deptor过表达，亦或是利用Deptor增强剂维持或增加细胞内Deptor的表达水平时，则能够有效降低头颈癌细胞在放疗过程中耐受性的出现，进而提高放疗敏感性。

除此以外，通过对临床头颈癌患者的分析发现，体内Deptor表达水平的高低，与患者治疗效果、预后情况存在密切关联性，具体的，高表达Deptor与肿瘤退缩显著相关，同时于更长的总生存期（OS）以及无进展生存期（PFS）密切相关，意味着Deptor可作为独立的因素用于临床头颈癌患者放疗疗效的预测以及预后的评估，对于Deptor低表达的患者，则可以采用使用例如Deptor增强剂联合放疗的方式，以稳定Deptor的表达，进而提高患者的放疗敏感性及预后，为临床头颈癌患者的治疗提供更为个性化、更为科学的治疗方案。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明对Deptor与头颈癌放疗耐受的相关性进行了深入研究，发现了因放疗导致的细胞内Deptor水平降低是产生头颈癌放疗耐受的关键原因之一，而通过过表达Deptor或通过Deptor增强剂维持或提高Deptor蛋白水平将能够有效降低头颈癌放疗耐受性的产生，提高放疗敏感性。

（2）本发明明确了Deptor所介导的头颈癌放疗耐受降低过程中的具体作用机制，明确了与之相互作用的相关靶点和通路，为后续进一步的深入研发奠定了理论基础。

（3）本发明通过对临床头颈癌患者的分析发现，Deptor可作为独立的因素用于临床头颈癌患者放疗疗效的预测以及预后的评估，其对于解决头颈癌个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题，为更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克头颈癌提供了一个新的药物治疗靶点，从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。

附图说明

图1为利用WB检测XR对内源性及外源性Deptor的影响结果示意图。

图2为利用WB检测Deptor增强剂对XR后Deptor的影响结果示意图。

图3为利用WB检测CHX处理后Deptor增强剂对XR后Deptor的影响结果示意图。

图4为Co-IP和WB检测K48位泛素化Deptor结果示意图。

图5为2D Fadu细胞模型平板克隆实验结果示意图。

图6为在条件3D细胞球培养模型中，XR联合Deptor增强剂在两种不同模式下处理的示意图。

图7为在条件3D细胞球培养模型中，XR联合Deptor增强剂在Day4对肿瘤细胞球形成的影响结果示意图。

图8为在条件3D细胞球培养模型中，XR联合Deptor增强剂在Day1对肿瘤细胞球形成的影响结果示意图。

图9为XR联合Deptor增强剂处理细胞72h后对细胞凋亡影响流式结果示意图。

图10为XR联合Deptor增强剂处理细胞72h后对细胞凋亡影响定量结果示意图。

图11为Deptor增强剂对放疗处理下小鼠体内肿瘤质量影响结果示意图。

图12为Deptor增强剂对放疗处理下小鼠体内肿瘤瘤体示意图。

图13为利用WB检测细胞内Deptor敲除效率结果示意图。

图14为在敲除Deptor的细胞中进行不同剂量放疗处理下2D平板克隆实验中细胞生存率影响结果示意图。

图15为在敲除Deptor的细胞中进行0Gy放疗处理下2D平板克隆实验中细胞生存状态示意图。

图16为在敲除Deptor的细胞中进行3Gy放疗处理下2D平板克隆实验中细胞生存状态示意图。

图17为在敲除Deptor的细胞中进行6Gy放疗处理下2D平板克隆实验中细胞生存状态示意图。

图18为在利用不同sgRNA获得的敲除Deptor的细胞中进行0Gy放疗处理下2D平板克隆实验中细胞生存状态示意图。

图19为在利用不同sgRNA获得的敲除Deptor的细胞中进行3Gy放疗处理下2D平板克隆实验中细胞生存状态示意图。

图20为在敲除Deptor的细胞中进行不同剂量放疗下的2D平板实验克隆数比值（KO/NC）结果示意图。

图21为Deptor增强剂对XR处理下Deptor敲除细胞2D平板克隆实验细胞生存率的影响结果示意图。

图22为Deptor增强剂对XR处理下Deptor敲除细胞2D平板克隆实验细胞生存状态示意图。

图23为利用Oncomine和TCGA数据库对头颈癌患者体内Deptor表达水平分析结果示意图。

图24为下咽癌患者放化疗前后MRI图以及相应的治疗前Deptor免疫组化结果示意图。

图25利用Kaplan-Meier分析Deptor高低表达患者的总生存期和无进展生存期结果示意图。

图26单因素及多因素生存分析下咽癌患者PFS生存因素结果示意图。

图27因素及多因素生存分析下咽癌患者OS生存因素结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括Fadu、Detroit 562等细胞系均购于美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），并由本实验室保存，根据ATCC指南进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海Biothrive Sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如DNA提取、全基因组测序、引物设计、载体构建、免疫共沉淀、免疫组化、Western blot、流式细胞术、细胞实验、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 20.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1 放疗对细胞内Deptor水平的影响

（1）以Deptor的mRNA（序列如SEQ ID NO：1所示）为模板，逆转录为cDNA，随后通过PCR进行扩增；

（2）将所获得的扩增产物进行酶切、纯化后连接至质粒上，随后转化至大肠杆菌感受态细胞并进行鉴定；

（3）质粒鉴定正确后，将对应的大肠杆菌进行扩大培养，获取大量细菌后，使用去内毒素质粒提取试剂盒获取目标质粒；

（4）将目标质粒与慢病毒功能转染至293T细胞中，培养48h后收集培养基，过滤细胞碎片后即可获得病毒液；

（5）将对数生长期的Fadu细胞接种至培养皿中，待其完全贴壁后，弃去原有培养基，加入病毒液和聚凝胺促进病毒感染，24h后弃去病毒液，更换新鲜培养基，继续培养24h；

（6）感染48h后，弃去培养基，利用嘌呤霉素筛选Deptor过表达稳转细胞株，并通过qPCR或WB进行鉴定；

（7）分别取上述Deptor过表达的Fadu细胞以及野生型Fadu细胞，利用X射线进行放射处理（6Gy），分别于处理后的第0、8、12及24小时收获细胞样品，利用Western Blot对细胞中内源性Deptor以及外源性Flag-Deptor表达量进行检测。

检测结果如图1所示。结果显示，在放疗处理后，Fadu细胞内Deptor表达水平会显著降低，而无论是对于内源性的Deptor还是外源性Flag-Deptor，其均在一定时间内以时间依赖的方式呈现降低趋势。

进一步地，考察是否可通过外源性药物刺激恢复细胞内Deptor水平的影响，具体步骤如下：

（1）取对数生长期的Fadu细胞，分为两组，其中组1加入如下结构式的化合物1（100nM），组2加入等体积溶剂DMSO作为对照；

（2）分别对组1和组2细胞进行X射线放射处理（6Gy），并于处理后的第0、5min、4h、8h、12h以及24h收获细胞样品，通过WB检测其中Deptor表达水平的变化情况。

结果如图2所示。结果显示，在经X射线放射处理后，Fadu细胞内Deptor表达水平在一定时间内呈现时间依赖性的降低趋势，其与上述结果相一致；而在加入化合物1后，其能够显著改善因放射导致的细胞内Deptor水平降低，维持Deptor细胞内稳定性，甚至提高Deptor的表达水平，即能够作为Deptor的增强剂。

为了研究上述Deptor增强剂维持细胞内Deptor表达稳定性的作用机制，利用放线菌酮（CHX）进行追踪分析，即在放射治疗开始前2小时，加入CHX使其对细胞内的核糖体蛋白合成功能产生抑制作用，再进行放疗后的时效考察，实验采用蛋白免疫印迹（WesternBlot）的方法，结果如图3所示。结果显示，在放疗后，与DMSO对照组相比，化合物1处理后Deptor的增加主要是由于Deptor半衰期的增加所致。

实施例2 稳定细胞内Deptor表达水平对头颈癌细胞放疗敏感性的影响

为了验证Deptor增强剂诱导的放疗后Deptor的回复是否依赖于蛋白酶体介导的蛋白降解，进一步在Fadu的Flag-Deptor稳转细胞（构建方式参见实施例1）中转染HA-Ubiquitin（K48位点特异性），再进行CO-IP免疫共沉淀实验，具体步骤如下：

（1）试剂配置：细胞裂解液：用ddH

（2）提取蛋白：将对数期Fadu细胞（组1采用100nM的化合物1处理，组2采用等体积DMSO处理，两组细胞分别采用X射线放射处理（6Gy））于不同时间点消化、收集，用PBS清洗两遍去除残余的培养基；加入适量cell lysis buffer；冰上裂解1h；4℃15000×g离心15min，取上清备用；用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度；留取30L蛋白溶液作为总蛋白样品，加入loading buffer（5×） 7.5L，95℃水浴5min，备用；

（3）一抗孵育：

①若目的蛋白带Flag标签，取 M2 anti-flag agarose 30L，加入提前预冷的TBS 溶液1mL，然后4℃ 5000×g离心 1min，弃上清，然后加入蛋白溶液，4℃ 垂直摇床 10~12rpm 翻转过夜；

②若目的蛋白不带Flag标签，则向蛋白溶液中加入目的蛋白的 IP 级抗体（1ug抗体:1mg 蛋白），4℃ 垂直摇床 10~12rpm 翻转过夜。次日，每组样品中再加入 Protein GPLUS-Agarose 50L，于 4℃垂直摇床 10~12rpm 孵育 3~4h。

（4）洗珠子：将上述样品4℃3000×g离心5min，小心吸除上清，注意不要吸到珠子；加入中度盐浓度TBS 1mL，4℃垂直摇床中速清洗5min，然后4℃3000×g离心5min，小心弃上清，重复至少5次；

（5）每个样品加入1×loading buffer 40L，95℃水浴5min，对于IP Flag继而用IB检测K48位泛素化Deptor。

检测结果如图4所示。结果显示，在放疗后12h，K48位泛素化Deptor表达达到峰值，之后虽然表达有所降低，但仍持续到24h，其为一个单向泛素-降解的过程；该过程可以被Deptor增强剂所阻断，从而维持K48位泛素化及非泛素化Deptor的表达，由此推定Deptor增强剂诱导的放疗后Deptor的回复与蛋白酶体介导的蛋白降解有关，通过抑制蛋白降解，将可以有效维持细胞内Deptor的水平，从而增强肿瘤细胞对放疗的敏感性。

对此，通过如下实验进行验证：

将对数生长期的Fadu细胞按1000/孔接种于6孔板；24小时后进行放疗（XR）或放疗（XR）+药物（化合物1，100nM）干预；继续培养10～14天；弃培养基，每孔加入含0.5%结晶紫的甲醇1mL，染色30min；弃甲醇，用水清洗残留的甲醇，即可观察到细胞克隆；显微镜下观察，细胞数>50个才计为一个有效克隆，计数各组的克隆总数以及细胞存活分数，其中细胞存活分数计算方式如下：细胞存活分数（Survival fraction）=干预组克隆数/对照组克隆数×100%。

实验结果如图5所示。结果显示，在使用了Deptor增强剂化合物1后，能够显著降低放射后Fadu细胞的平板克隆形成数量，抑制细胞的增殖，增加对放疗的敏感性。

随后，利用3D细胞球形成实验验证Deptor以及Deptor增强剂对于细胞放疗敏感性的作用，具体步骤如下：

取2D贴壁生长的对数生长期的带mCherry荧光的Fadu细胞，将其消化、过滤网形成单细胞悬液，计数，按1000-4000/孔的密度接种于低粘附6孔板中。将培养皿置于37℃、5%CO2中培养，按照实验计划对细胞进行处理（处理方式参见图6），每3-4天补充500µL培养基，培养14天，于倒置荧光显微镜下观察肿瘤球数量与直径，用ImageJ软件测量球体数和直径，直径>75um计为一个有效肿瘤球，计数各组肿瘤球的数量。

实验结果如图7-8所示。结果显示，无论是在Day4（图7）还是Day1（图8）处理细胞，与XR或化合物1单处理组相比，XR联合化合物1能更加显著地抑制Fadu细胞肿瘤细胞球形成的数量。与此同时，我们计算Q value分析XR联合化合物1的协同效应。Q值=EAB/[EA+EB（1-EA）]（EA，EB以及EAB分别代表化合物1、XR以及化合物1+XR的抑制率：Q＜0.85、0.85≤Q≤1.15或Q>1.15分别代表了拮抗作用、相加作用或协同作用。值得注意的是，无论是在Day4或Day1，化合物1（5或10nM）均能协同增加XR对肿瘤细胞球形成的抑制率（所有Q>1.15）。

随后，通过细胞凋亡实验验证Deptor对于肿瘤细胞放疗敏感性的作用，结果如图9-10所示。结果显示，在Fadu、Detroit 562细胞中，化合物1均显著增加XR诱导的凋亡，在Fadu细胞中，细胞平均凋亡比率从23.29%增加到37.78%；在Detroit 562细胞中，细胞平均凋亡比率从13.61%增加到19.77%。而化合物1单药处理后对细胞凋亡几乎无影响。我们也用Q值计算了XR和化合物1促进细胞凋亡的联合效应，在两个细胞中，所有Q>1.15。

进一步地，通过体内实验明确Deptor及其增强剂促进放疗对头颈癌细胞的抗肿瘤效应。具体步骤如下：

（1）取4～6周龄的雌性Balb/c裸鼠2～3只，于其背部皮下接种Fadu细胞（1～5×106/只），待肿瘤生长至适当大小；

（2）将上述肿瘤取出，处理成若干约5mm

（3）另取4～6周龄的雌性Balb/c裸鼠60只，随机分成4组，编号为组1-4，15只/组，麻醉后将肿瘤块移植到背部皮下，建立移植瘤模型，该模型可以减少肿瘤的异质性；

（4）移植7天后开始干预，其中组1为空白对照组，无药物处理也不进行放射治疗；组2给予化合物1（1mg/kg·day，隔天一次），不进行放射治疗；组3进行放射治疗（1Gy/day，隔天一次），无药物处理；组4进行化合物1（1mg/kg·day）和放射治疗（1Gy/day）交替干预处理；各组总治疗周期均为2周；

（5）1个月后处死小鼠，收集瘤块。

实验结果如图11-12所示，结果显示，化合物1单独处理组对小鼠瘤子的肿瘤增长无显著影响（P>0.05）。与体外实验一致，与XR单治疗组相比，化合物1联合XR能显著降低肿瘤体积。值得注意的是，XR联合化合物1的抑瘤率分别为86.63%，而单XR组的抑瘤率为51.21%。另外，化合物1和XR的联合也具有协同作用（Q=1.46）。

综合上述实验结果可以明确，Deptor表达水平降低是导致头颈癌放疗耐受产生的关键原因之一。通过提高细胞内Deptor蛋白表达水平或利用增强剂稳定或者提高Deptor水平，则能够有效提高头颈癌细胞对于放疗的敏感性，降低放疗耐受的产生。Deptor增强剂诱导的放疗后Deptor的回复与蛋白酶体介导的蛋白降解有关，通过抑制蛋白降解，将可以有效维持细胞内Deptor的水平，对于此，进一步选择了其他对蛋白酶体有一定抑制作用的活性成分（Ixazomib、Bortezomib等）重复了上述细胞及体内实验，结果与化合物1相类似（图中未示出），即均能够有效维持甚至增加细胞内Deptor水平，防止放疗过程中的Deptor降解，促进头颈癌细胞对放疗的敏感性。

实施例3 Deptor敲除对头颈癌细胞放疗耐受的影响

为了探究Deptor缺失是否会影响放疗耐受过程，进行如下实验：

（1）利用Crispr细胞敲除技术于Fadu细胞内构建Deptor敲除的稳定细胞株（所采用的sgRNA1序列如SEQ ID NO：22所示；sgRNA2序列如SEQ ID NO：23所示）；并通过WB进行了效率验证（参见图13）；

（2）利用敲除后的Fadu细胞进行2D细胞克隆形成实验：将对数生长期的细胞按1000/孔接种于6孔板；24小时后进行放疗或放疗+药物干预；继续培养10～14天；弃培养基，每孔加入含0.5%结晶紫的甲醇1mL，染色30min；弃甲醇，用水清洗残留的甲醇，即可观察到细胞克隆；显微镜下观察，细胞数>50个才计为一个有效克隆，计数各组的克隆总数以及细胞存活分数，其中细胞存活分数计算方式如下：细胞存活分数（Survival fraction）=干预组克隆数/对照组克隆数×100%。

结果如图14-19所示，图中Mock组为野生型Fadu细胞，未进行Deptor敲除处理；NC组为转染有空白载体的Fadu细胞。结果显示，在敲除DEPTOR的细胞中进行中等剂量的放疗（3Gy）后，会显著增加放疗的耐受性。用较高剂量（6Gy）处理敲除Deptor的细胞，细胞仍会提高放疗耐受性。

通过计算各个放疗剂量组DEPTOR KO组与NC组平板克隆数的比值，0Gy时DEPTORKO/NC＞1，结合以上数据可知，敲除DEPTOR本身可以促进Fadu细胞的增殖。放疗后DEPTORKO/NC=3~4，这与细胞生存实验中敲除DEPTOR导致放疗耐受一致（参见图20）。

随后，在野生型及敲除Deptor的Fadu细胞中，加入Deptor增强剂化合物1（100nM）处理后再进行2D平板克隆实验。结果如图21-22所示。结果显示，在Deptor野生型细胞中，Deptor增强剂有明显的放疗增敏作用，而在Deptor缺乏的细胞中，Deptor增强剂几乎失去了放疗增敏的能力。

以上实验共同表明，Deptor与头颈癌细胞的放疗耐受性的产生具有十分密切的关系。通过敲除Deptor可以促进头颈癌细胞放疗耐受性的产生。而在对Deptor过表达，亦或是利用Deptor增强剂维持或增加细胞内Deptor的表达水平时，则能够有效降低头颈癌细胞在放疗过程中耐受性的出现。

实施例4 Deptor表达水平与头颈癌患者放疗耐受及预后相关性研究

通过利用Oncomine Cancer Microarray database数据库分析Deptor在不同肿瘤中Deptor的总体表达水平，同时用Oncomine以及TCGA数据库分析正常头颈部组织和头颈部鳞状细胞癌Deptor的表达水平差异。发现与正常组织相比，头颈部鳞癌的Deptor表达水平显著降低，说明Deptor的低表达可能与头颈部鳞癌的发生发展有关（参见图23）。

前述结果共同表明Deptor基因在头颈癌中发挥着重要的功能，而且其低表达与放疗耐受性密切相关。为了进一步验证该结论，收集了中山大学附属第一医院下咽癌患者的活检标本（N=63），这些患者之后接受了标准的根治性放疗。之后采用免疫组化检测Deptor在这些下咽癌组织中的表达水平，其中有28例患者Deptor高表达（cut-off≥12），35例患者Deptor低表达（cut-off＜12）。放化疗综合治疗后，这些患者根据RECIST 1.1实体瘤评价标准，分别有15、16、24、16患者达到完全缓解（complete response，CR）、部分缓解（partialresponse，PR）、疾病稳定（stable disease，SD）、疾病进展（progressive disease，PD），CR+PR定义为客观缓解（objective response，OR），它代表着肿瘤对放化疗敏感。

临床分析显示，在27例低表达DEPTOR的下咽癌患者中，有8例达OR（13.3%），33例高表达DEPTOR的下咽癌患者中，有23例达到OR（38.3%）。同时分析临床参数的相关性，发现高表达DEPTOR与OR（P=0.002）以及更好的预后有关（P=0.002），具体如下表1所示。

表1 DEPTOR表达与放化疗前样本临床参数的相关性

随后，在收集了下咽癌患者放化疗前后的MRI图像，用RECIST 1.1作为实体瘤评价标准，结果如图24所示。在MRI图像中可以看到，总体而言，高表达Deptor的患者肿瘤退缩较好。

通过对接受了标准化放疗方案的下咽癌患者的生存情况进行分析，发现高表达DEPTOR与更长的总生存期Overall survival，OS）相关（P<0.001）以及无进展生存期（progressive free survival，PFS）相关（P<0.001）（参见图25）。

而在单因素生存分析中，诱导化疗（OS

综合上述结果可知，本发明对Deptor在头颈癌放疗耐受中的作用及机制进行明确揭示。发现放疗处理后会导致头颈癌细胞中Deptor表达水平降低，通过对Deptor过表达或利用Deptor增强剂，则可以有效恢复由于放疗导致的细胞内Deptor水平降低，防止放疗过程中导致的Deptor降解；同时还发现，Deptor增强剂诱导的放疗后Deptor的回复与蛋白酶体介导的蛋白降解有关，通过抑制蛋白降解，将可以有效维持细胞内Deptor的水平。当敲除头颈癌细胞中Deptor后，会促进细胞对放疗耐受性的产生，而在对Deptor过表达，亦或是利用Deptor增强剂维持或增加细胞内Deptor的表达水平时，则能够有效降低头颈癌细胞在放疗过程中耐受性的出现。

除此以外，通过对临床头颈癌患者的分析发现，体内Deptor表达水平的高低，与患者治疗效果、预后情况存在密切关联性，具体的，高表达Deptor与肿瘤退缩显著相关，同时于更长的总生存期（OS）以及无进展生存期（PFS）密切相关，意味着Deptor可作为独立的因素用于临床头颈癌患者放疗疗效的预测以及预后的评估，对于Deptor低表达的患者，则可以采用使用例如Deptor增强剂联合放疗的方式，以稳定Deptor的表达，进而提高患者的放疗敏感性及预后，为临床头颈癌患者的治疗提供更为个性化、更为科学的治疗方案。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> Deptor作为靶点在制备促进头颈癌放疗增敏的药物中的应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaggagg gcggcagcac tggcagtgct ggcagtgaca gcagcaccag cgggagtggc 60

ggggcgcagc aaagggagct ggagcgcatg gctgaggtct tggtcaccgg ggaacagcta 120

cggctcaggc tgcacgaaga aaaggttatt aaagatagac gtcatcatct caagacctac 180

ccaaactgtt ttgtcgcaaa agaactgatt gactggctga ttgaacacaa agaggcttct 240

gacagagaga cggcaattaa actcatgcag aaattagcag accggggcat tattcaccat 300

gtgtgtgatg agcataagga attcaaggat gtcaaactct tctaccgctt tagaaaggat 360

gacggcacct tcccattgga taatgaagtg aaggccttta tgagaggaca gaggctatat 420

gaaaagctga tgagccctga aaacacactc ctgcagccca gggaggagga aggggtcaag 480

tatgagcgca ccttcatggc atctgaattc ctggactggc tggttcagga aggtgaggcc 540

accacgagga aagaggcaga gcagctttgc caccggctta tggagcatgg catcatccag 600

catgtgtcca acaagcaccc atttgtggac agcaatcttc tctaccagtt cagaatgaac 660

ttccggcgga ggcgaagact gatggagctg ctcaatgaaa agtccccctc ctcccaggaa 720

actcatgaca gtcccttctg cctgaggaag cagagccatg acaatcggaa atctaccagc 780

tttatgtcag tgagccccag caaggagatc aagatcgtgt ctgcagtgag gagaagcagc 840

atgagcagct gtggcagcag cggctacttc agcagcagcc ccaccctcag cagcagcccc 900

cctgtgctct gcaaccccaa gtccgtgctg aagagacctg tcacctctga ggaactcctt 960

actcccgggg ctccgtatgc aaggaagaca ttcacgattg ttggtgacgc ggttggctgg 1020

ggttttgtgg tgcgaggaag taagccatgc cacatccagg ctgtagaccc cagtggccct 1080

gcagccgcag caggaatgaa ggtctgtcag tttgtcgtct ctgtcaacgg gctcaatgtc 1140

ctgcatgtag actaccggac cgtgagcaat ctgattctga cgggcccacg gacgattgtc 1200

atggaagtca tggaggagtt agagtgc 1227

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtcgtctc tgtcaacggg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtcgctgtt tgggctagag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgcgagga agtaagccat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgctgttt gggctagaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaaaccatg gaggagggcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgctcatac ttgacccctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actgatccga gcacccaaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggtgcgctc atacttgacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catgtgtcca acaagcaccc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcagctcca tcagtcttcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccacatccag gctgtagacc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caggacattg agcccgttga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcgacatgc taaagtcccc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggaatttcct ctgcacgctg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgtgctgaag agacctgtca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cttcctcgca ccacaaaacc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggttttgtgg tgcgaggaag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggacattga gcccgttgac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctctagccc aaacagcgac 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tccctaacta cccccaacca 20

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccgtcgca aaagaactga ttgac 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caccggccgc acggccctaa aacca 25