快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用。包括如下引物对中的至少两对：检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。该方法采用特异性引物组对驼乳样品中提取的样品总DNA进行多重PCR扩增，检测所述驼乳中是否含有上述五种致病菌；并且当含有目标致病菌时，确定致病菌的种类。该方法具有良好的特异性、敏感性和准确性，样品需求量少，对样品的储存和运输条件要求低。同时还具有成本低、效率高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用。

背景技术

目前，关于双峰驼乳房炎的主要致病菌准确、快速的检测方法尚未被系统建立。现有技术中，为了检测双峰驼乳房炎的方法主要是采用PCR技术依次检测可能的致病菌，或采用传统的细菌分离方法进行鉴定。然而，由于可能致病菌种类较多，这样的方法效率很低，样本需求量很大，检测成本高。

例如，目前主要采用的检测方法为细菌分离鉴定或宏基因组方法。细菌分离鉴定虽然准确性较高，但是对样品采集、保存、运输等条件的要求也比较高，且需要针对不同致病菌选择合适的分离培养基，实验周期较长，实验设备要求较高、耗费较大。而宏基因组技术虽然可以较为全面的检测样品中的细菌分布，但是费用昂贵、样品需求量较大，通常在10mL以上。同时，宏基因组的检测周期在1月以上，检测效率低不适用于临床诊治。

另外，其他的一般PCR方法的特异性和敏感性比较低，不适合检测可能由多种致病菌导致引起的双峰驼乳房炎。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、特异性引物组、试剂盒及应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，包括如下引物对中的至少两种：检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。

本发明还可以通过以下进一步技术方案实现：

进一步，包括检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。

进一步，所述检测大肠杆菌的引物对包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物，和如SEQ ID NO：2所示的下游引物；

所述检测金黄色葡萄球菌的引物对包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物，和如SEQID NO：4所示的下游引物；

所述检测无乳链球菌的引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物，和如SEQ IDNO：6所示的下游引物；

所述检测粪肠球菌的引物对包括如SEQ ID NO：7所示的上游引物，和如SEQ IDNO：8所示的下游引物；

所述检测支原体的引物对包括如SEQ ID NO：9所示的上游引物，和如SEQ ID NO：10所示的下游引物。

本发明提供一种试剂盒，包括如上述的引物组及辅助试剂。

本发明提供如上述的试剂盒在快速检测骆驼乳房炎主要致病菌中的应用。

本发明提供一种快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，采用上述的引物组对驼乳样品中提取的样品总DNA进行多重PCR扩增，检测所述驼乳中是否含有所述主要致病菌；并且当含有所述主要致病菌时，确定所述主要致病菌的种类。

进一步，支原体、无乳链球菌、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的最低检出浓度均为1ng/μL，粪肠球菌的最低检出浓度为10ng/μL。

进一步，包括以下步骤：

S1、取所述驼乳样品，将所述驼乳样品依次进行离心，采用水煮法提取所述样品DNA；

S2、采用所述引物组对所述样品DNA进行多重PCR扩增，得到PCR产物；

S3、将所述PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带判断所述驼乳样品中是否含有致病菌及致病菌的种类。

进一步，所述多重PCR扩增的反应体系为50μL，包括25μL的2×预混聚合酶、1μL的样品DNA、1μL检测金黄色葡萄球菌的上游引物、1μL检测金黄色葡萄球菌的下游引物、其他各上游引物和各下游引物分别为0.5μL,余量为ddH

所述多重PCR扩增的反应程序为：预变性：98℃、5min；变性：95℃、20s；退火：58℃、30s；延伸：72℃、40s；循环数：30；终延伸：72℃、10min。

进一步，所述步骤S1中，所述驼乳样品的体积为0.5～1mL。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，对应的五种致病菌为分离率最高、危害较大的主要致病菌；该引物组含有至少两个引物对，可以检测至少两种主要致病菌，能够快速有效的实现对骆驼乳房炎的主要致病菌的检测。

(2)本发明的特异性引物组，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体具有良好的特异性，对这些致病菌与其他致病菌也有良好的特异性。

(3)本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，采用多重PCR扩增的方法进行检测，样品需求量少，最大仅需0.5～1mL；这样不仅便于取样，而且能够降低样品量对检测方法的限制，便于对该方法进行推广和应用。

(4)本发明的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，其采用的样品可仅通过低温保存或短时间常温保存，降低了样品保存条件，便于长距离运输。

(5)本发明的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，采用上述引物组进行检测，敏感性高，样品中致病菌的DNA浓度大于5ng，即可得到检测结果。

(6)本发明的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，准确率可达95.7％，是一种可靠的检测方法，能够为后续的骆驼乳房炎诊断和治疗提供了有效的依据。

(7)本发明的快速检测骆驼乳房炎主要致病菌的方法，还具有良好的特异性、效率高、成本低的优点。

附图说明

图1为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例1中，分别对仅含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体的DNA模板样品进行PCR扩增的电泳图；

图2为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例1中，分别对仅含有驼乳中普遍存在的细菌，如莫林枸橼酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯、不动杆菌、干酪溶解巨球菌、克雷伯、变形杆菌及各阳性对照组的DNA模板进行PCR扩增的电泳图；

图3为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例2中，对含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体的DNA模板样品进行五重PCR扩增的电泳图；

图4为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例3中，实验组的电泳图；

图5为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例4中，对各驼乳样品进行五重PCR扩增的电泳图；

图6为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例4中，对各驼乳样品进行单一PCR扩增的电泳图；

图7为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例5中，各浓度的金黄色葡萄球菌DNA模板的扩增电泳图；

图8为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例5中，各浓度的大肠杆菌DNA模板的扩增电泳图；

图9为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例5中，粪肠球菌DNA模板的扩增电泳图；

图10为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例5中，无乳链球菌DNA模板的扩增电泳图；

图11为本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，实施例5中，支原体DNA模板的扩增电泳图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，包括如下引物对中的至少两种：检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对。

本发明的检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组，其中包含的上述引物对所对应的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体，为分离率最高、危害较大的致病菌。该引物组含有至少两个引物对，可以检测至少两种主要致病菌，能够快速有效的实现对双峰驼乳房炎主要致病菌的检测。

本发明的特异性引物组，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体具有良好的特异性，对这些致病菌与其他驼乳中普遍存在的细菌也有良好的特异性；驼乳中普遍存在的细菌为莫林枸橼酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯、不动杆菌、干酪溶解巨球菌、克雷伯、变形杆菌等。

优选的，本发明的特异性引物组包括检测大肠杆菌的引物对、检测金黄色葡萄球菌的引物对、检测无乳链球菌的引物对、检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物对；含有五种检测这些致病菌的引物对，可以使该引物组能够更全面、准确的检测双峰驼乳房炎主要致病菌。

优选的，检测大肠杆菌的引物对包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物，和如SEQ IDNO：2所示的下游引物；

检测金黄色葡萄球菌的引物对包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物，和如SEQ IDNO：4所示的下游引物；

检测无乳链球菌的引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物，和如SEQ ID NO：6所示的下游引物；

检测粪肠球菌的引物对包括如SEQ ID NO：7所示的上游引物，和如SEQ ID NO：8所示的下游引物；

检测支原体的引物对包括如SEQ ID NO：9所示的上游引物，和如SEQ ID NO：10所示的下游引物。

上述各引物对的核苷酸序列、对应的致病菌种、退火温度以及其检测的致病菌DNA模板的片段大小，如表1所示：

表1各引物对的核苷酸序列及其对应的菌种

本发明的试剂盒，包括如上述的特异性引物组及辅助试剂；该试剂盒可应用于快速检测骆驼乳房炎。

本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，采用如上述的特异性引物组对驼乳样品中提取的样品DNA进行多重PCR扩增，检测所述驼乳中是否含有特定致病菌；并且当含有目标致病菌时，确定致病菌的种类。

本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，采用多重PCR扩增的方法进行检测，样品需求量少，最大仅需0.5～1mL；这样不仅便于取样，而且能够降低样品量对检测方法的限制。

本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，其采用的样品可仅通过低温保存或短时间常温保存，降低了保存条件的要求，便于样品的长距离运输。

本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，检测周期短，可在2h内得到检测结果。

本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，采用上述引物组进行检测，敏感性高，样品中致病菌的DNA浓度大于5ng，即可得到检测结果。

本发明的快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法，采用上述引物组进行检测，特异性高，能够与驼乳中的其他细菌菌区别开，可以对后续的治疗提供更准确的检测结果。

优选的，支原体、无乳链球菌、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的最低检出浓度均为1ng/μL，粪肠球菌的最低检出浓度为10ng/μL。

具体而言，本发明的检测方法包括以下步骤：

S1、取驼乳样品，将驼乳样品依次进行离心，采用水煮法提取样品DNA；

S2、采用引物组对样品DNA进行多重PCR扩增，得到PCR产物；

S3、将PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带对应的检测出的DNA片段大小，判断驼乳样品中是否含有致病菌及致病菌的种类。

具体而言，当电泳检测得到451bp的条带时，说明样品中含有大肠杆菌；当电泳检测得到270bp的条带时，说明样品中含有金黄色葡萄球菌；当电泳检测得到820bp的条带时，说明样品中含有无乳链球菌；当电泳检测得到660bp的条带时，说明样品中含有粪肠球菌；当电泳检测得到1485bp的条带时支原体。并且，在对同一份样品检测时，电泳检测结果可以含有上述多个条带，对应多种致病菌。

当电泳检测没有上述条带时，说明样品中不含有上述致病菌。

优选的，多重PCR扩增的反应体系为50μL，包括25μL的2×预混聚合酶、1μL的样品DNA、1μL检测金黄色葡萄球菌的上游引物、1μL检测金黄色葡萄球菌的下游引物、其他各上游引物和各下游引物分别为0.5μL、余量为ddH

所述多重PCR扩增的反应程序为：预变性：98℃、5min；变性：95℃、20s；退火：58℃、30s；延伸：72℃、40s；循环数：30；终延伸：72℃、10min。

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明或验证。

实施例1

本实施例对本发明的各引物对的特异性进行了检测。具体检测了这些引物对针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体之间的特异性和与其他细菌的特异性。

(1)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体之间的特异性验证：

采用本发明的五种引物对，分别对仅含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体的DNA模板样品进行PCR扩增，同时以不含有任何致病菌DNA模板的样品作为阴性对照。各实验组及其对应的菌种如表2所示，电泳检测结果如图1所示。

表2各组菌种

根据图1的电泳检测图可以看出，本发明的五种引物对对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体具有特异性，能够准确的检测出对应的致病菌DNA模板。

(2)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体与其他致病菌之间的特异性验证：

采用本发明的五种引物对，分别对仅含有莫林枸橼酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯、不动杆菌、干酪溶解巨球菌、克雷伯、变形杆菌的DNA模板进行PCR扩增，并分别与阳性对照组a、b、c、d、e进行对照。各实验组及其对应的菌种如表3所示，电泳检测结果如图2所示。

表3各组菌种及阳性对照组含有的菌种

根据图2可以看出，本发明的各引物对，能够检测出各阳性对照组中含有的致病菌DNA，而无法检测出实验组1～7的致病菌，这说明本发明的这些引物对具有特异性。

实施例2

本实施例对本发明的五重PCR扩增方法的特异性进行模拟测试，具体方法为，采用本发明的方法对同时含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌及支原体DNA模板的样品进行扩增和电泳检测，结果如图3所示。

本实施例的五重PCR扩增体系如表4所示：

表4五重PCR扩增体系

本实施例的五重PCR反应程序如表5所示：

表5五重PCR反应程序

根据图3可以看出，本实施例的两个平行实验组中的上述致病菌，均具有显著的条带，说明本发明的五重PCR扩增检测方法对这些致病菌的检测具有良好的特异性。

实施例3

本实施例对本发明的快速检测方法的特异性进行模拟测试，具体方法为：以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌以及支原体的DNA模板组合作为待检测的样品，验证本发明的检测方法得到的检测结果是否与已知的致病菌种类相同，以进一步考察本发明的检测方法的特异性。

具体分组如表6所示：

表6各实验组的致病菌DNA模板组合

本实施例的PCR扩增体系和反应程序与实施例2相似，其中，PCR扩增体系中的致病菌DNA模板按照表6各组对应的模板组合添加。

由于上述致病菌的DNA模板片段大小是已知的，因此，可以根据电泳条带所对应的片段大小判断该条带是否是对应的致病菌。

本实施例的电泳图如图4所示。通过图4可以可以看出，每个实验组对应的电泳条带所代表的致病菌种类与其对应的致病菌种类相同，说明本发明的检测方法具有良好的特异性。

实施例4

本实施例分别采用本发明的快速检测方法、针对每种致病菌的单一PCR检测方法以及细菌培养鉴定方法对同一份驼乳样品中的样品DNA进行检测，以验证本发明的检测方法的准确性。

本实施例分别取不同骆驼的驼乳作为一份样品，本实施例共检测23份样品。

采用本发明的五重PCR扩增检测方法分别对各组样品进行检测，电泳检测结果如图5所示。

采用单一PCR检测方法分别对各组样品进行检测，电泳检测结果如图6所示。

采用细菌分离鉴定的方法，分别鉴定各实验组中的致病菌种，鉴定结果如表7所示：

表7各实验组致病菌种鉴定结果

通过图5～6和表7可以看出，与单一PCR扩增检测的方法相比，23个实验组的检测结果中，22个实验组的检测结果与单一PCR扩增检测和细菌分离鉴定的结果相同，说明本发明的检测方法准确率可达95.7％。

实施例5

本实施例通过单重PCR分别验证本发明的各引物对的敏感性。

具体的，本实施例分别对50ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL浓度各致病菌DNA模板进行扩增和电泳检测。

PCR扩增电泳图如图7～11所示。各电泳图中，条带1为50ng/μL，条带2为10ng/μL，条带3为1ng/μL，条带4为100pg/μL。

图7显示金黄色葡萄球菌在10ng/μL的模板浓度下产生条带，图8显示大肠杆菌在10ng/uL的模板浓度下产生条带；图9显示粪肠球菌在10ng/uL的模板浓度下产生条带；图10显示无乳链球菌在1ng/uL的模板浓度下产生条带；图11显示支原体在1ng/μL的模板浓度下产生条带。

上述结果可以证明本发明的各引物对具有良好的敏感性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

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