奶牛乳房炎致病菌分离鉴定及快速诊断试剂盒的研发与应用

摘要

本研究对广西的5个奶牛场的75份乳房炎奶样进行细菌分离鉴定,并根据鉴定结果对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌4种主要的致病菌建立多重PCR快速诊断技术。并对该技术进行体系优化和检测评价,在此基础上开发研制出可用于临床实际中牛奶及乳制品的目标病原菌的快速检测试剂盒。实验内容和结果如下:
　　1.通过对广西的5个大型奶牛场75份乳样进行细菌分离鉴定,实验结果表明,75份乳样中共检出共135株病原菌微生物,其中金黄色葡萄球菌有24株,占17.87％;表皮葡萄球菌8株,占5.93%;腐生葡萄球菌5株,占3.70%;无乳链球菌17株,占12.59%;乳房链球菌9株,占6.67%;乳链球菌7株,占5.19%;停乳链球菌5株,占3.70%;粪链球菌5株,占3.70%;白色念珠菌12株,8.89%;酵母菌6株,占4.44%;大肠杆菌17株,占12.59%;沙门杆菌6株,占4.44%;福氏志贺杆菌2株,占1.48%;化脓棒状杆菌2株,占1.48%;蜡样芽孢杆菌10株,占7.42%。鉴定结果表明引起广西地区奶牛乳房炎的主要致病菌是无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌以及白色念珠菌,而且多呈混合感染,混合感染率为88.00%。
　　2.以无乳链球菌sip基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌rrnB基因和蜡样芽孢杆菌hblA基因作为目的靶基因并设计4对特异性引物,建立并优化一套快速检测牛奶中的上述4种病原菌的多重PCR方法。结果表明,无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的多重PCR扩增条带大小分别为252bp、464bp、722bp、995bp,通过测序及BLAST比对证明了产物的准确性;该技术具有良好的敏感性和特异性,4种致病菌的最低检出量是无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌为0.1pg/uL,大肠杆菌为0.01pg/uL,用该方法对50份临床乳样进行检测,并与生化鉴定结果对比验证,得出4种病原菌的整体符合率达97%以上,同时大幅缩短检测时间,提高检测效率。
　　3.实现了牛奶中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌多重PCR快速检测试剂盒的组装。对该试剂盒的稳定性,保存方式进行了测评。结果表明,该试剂盒检测效果良好,0℃可保存60天,-20℃或-80℃条件下,保质期可达半年,但试剂盒反复冻融后,对检测结果影响较大,使用者可根据实际检测情况选择合适的保存方式或分装保存。

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第一章 奶牛乳房炎研究概述

1.1 奶牛乳房炎的流行病学调查

1.2 乳房炎的类型

1.3 奶牛乳房炎的发病因素

1.4 奶牛乳房炎诊断和检测方法研究进展

1.5 多重PCR检测方法的研究及应用现状

1.6 PCR试剂盒研究现状

1.7 本课题的研究内容与意义

第二章 广西地区奶牛乳房炎致病菌的分离鉴定

2.1 材料与方法

2.2 乳样采集

2.3 致病菌的分离鉴定及纯化

2.4 结果与分析

第三章 奶牛乳房炎4重PCR检测方法的建立及优化

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 四重PCR快速检测试剂盒的组装、保存期试验及使用方法

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

第五章 小结、创新点与展望

5.1研究小结

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

附录1扩增序列

附录2 英文缩写词表

附录3 部分细菌分离结果

致谢

硕士期间发表论文及专利