应用微流控技术检测脑缺血模型外周血中性粒细胞电学特性的动态变化的方法

摘要

本发明公开了一种脑缺血模型电学特性的检测方法，采用双频交流信号作为检测信号检测获自脑缺血模型的外周血中性粒细胞的电学特性的动态变化。本发明首次将单细胞电学的方法应用于疾病模型体内中性粒细胞特性的检测。不同于以往的免疫细胞电学检测方法，本方法的特点在于免标记、高通量、可以实时计算得到细胞的电生理特性结果，具有高效率的优势。该系统将来可用于临床缺血性卒中后的中性粒细胞的电学特性，具有广阔的应用前景，可以推动缺血性卒中中性粒细胞分子机制的研究，以及临床上可以应用于缺血性卒中的预后和治疗药物的选择。

说明书

技术领域

本发明涉及脑缺血动物模型外周血中性粒细胞的电学特性检测领域，主要检测中性粒细胞的细胞膜比电容、细胞质电导率的检测。

背景技术

缺血性卒中是全球性的危害民众健康的主要疾病之一，尽管研究广泛，但是迄今为止，治疗方法十分有限，亟需拓展研究路径，以进一步深入研究其病理过程。

单细胞电学特性，作为一种重要的单细胞生物物理特性，在单细胞的状态评估以及相应疾病的病理机制的研究有着潜在研究意义。单细胞电学特性在细胞分型方面有了一定的研究基础，同基于单细胞电学特性检测方法，表征了多种细胞的电学特性，已经被证明可以用于区分不同的肿瘤细胞和血细胞，可以有效区分不同的肺癌细胞系；单个细胞膜蛋白或胞浆蛋白调控的肿瘤细胞亚型、固定和/或染色的肿瘤细胞亚型、恶性程度不同的肿瘤细胞亚型、不同类型的裸鼠肿瘤样本、不同分化程度的神经干细胞、和不同病人的循环肿瘤细胞。而对于脑缺血后中性粒细胞的电学特性的变化和意义这方面的研究是缺失的。

基础研究表明，缺血性卒中后中性粒细胞的很多生物学特性包括细胞迁移、细胞脱颗粒、细胞释放中性粒细胞胞外杀菌网络、中性粒细胞表型转化均对缺血性卒中的急性期的神经功能损伤和恢复期的神经元重塑的均具有重要调控作用(PMID:33691513)。在单细胞电学特性的研究中，细胞电学特性反映了细胞的功能状态，如细胞膜比电容主要反映细胞膜面积的变化，细胞质电导率反映细胞膜的通透性。细胞膜电容的监测具有重要的生理意义，当细胞发生胞吞和胞吐时，细胞膜的表面积会发生变化，由于细胞膜具有电容特性，其膜电容也会随着膜表面积的变化而变化，通过对膜电容的监测可以间接了解细胞的胞吞胞吐活动。然而，缺血性卒中后人类或者动物的中性粒细胞的电学特性发生怎样的变化并不清楚。而对于脑缺血后中性粒细胞的两个十分重要的生物学过程包括脱颗粒、释放中性粒细胞胞外杀菌网络，都会发生细胞膜的动态变化，如果监测细胞膜比电容的动态变化，可以判断中性细胞释放发生了上述变化，可以应用于相关缺血性卒中靶向中性粒细胞的药物的筛选。

传统单细胞电学特性表征方法(膜片钳、介电电泳、电致旋转法和微电阻抗谱)的缺点主要是通量低、耗时、操作复杂。无法满足高通量的单细胞研究的需求。以下分别阐述：

1.膜片钳技术，是一种经典的被广泛应用于单细胞电生理特性的主要研究方法，测量精确性依赖于操作中娴熟的封接技术以及测量位置的选择，而且测量单个细胞耗时很长，用于单细胞膜特性测量效率太低。因此，基于传统方法，虽然可以得到群体或者个别单个细胞的电学特性，但是无法得到具有统计学意义数量的单个细胞电学特性。

2.介电电泳，附着在介电泳电极上的细胞数量作为频率的函数被量化并转化为细胞的固有电特性。然而，介电泳只能得到细胞群体特性，无法研究单个细胞的电学特性。传统介电电泳的方法是在电极周围有一堆细胞，然后加不同频率后，匹配的细胞会向电极比较快的靠近。就是电泳。介电电泳最大的问题是对尺寸和细胞所在位置很敏感，而且只能用电阻比较大的溶液。

3.电致旋转法，也是利用了介电泳力，且操作复杂，测量效率极低。但在电致旋转法中，细胞操作和定位非常耗时，这使得该技术成为一种低吞吐量方法。

4.在微电阻抗谱中，单个细胞被微加工电极捕获，在那里施加频率相关的信号并记录细胞的电响应。这种方法同样吞吐量有限。

与上述技术检测单细胞电学特性的方法不同，微流阻抗细胞仪是一种高通量、免标记的新型单细胞检测技术(PMID:33759381)，其生物学应用被不断拓展。

然而，由于电流泄漏问题和缺乏等效电路模型，之前报道的大多数微流控阻抗细胞术只能采集原始电信号，而不能采集细胞膜电容和细胞质电阻。最近，一种改进的微流控阻抗式细胞术被报道用来定量细胞内特定的膜电容和细胞质电导率的电参数，然而，由于微流控芯片的几何结构的限制，其吞吐量仍然有限，只能报告数百个单细胞的数据。目前存在的微流控检测方法中，还包括基于单入单出(“一”字形)压缩通道(即横截面积小于细胞横截面积)的单细胞电学特性测量方法，方法中包含的检测系统核心为包括单入单出(“一”字形)压缩通道结构的微流控芯片，当细胞在负压驱动下被拉过压缩通道时，阻抗测量模块测量压缩通道两端阻抗，图像采集模块采集细胞在压缩通道中运动的图像，再结合电学模型转换得到穿过压缩通道的细胞膜比电容等单细胞固有电学特性参数。这种方法虽然能够高通量(约1个/秒)得到单细胞电学特性，然而，该方法中需要使用显微镜通过光学方法得到细胞的长度，从而进一步得到细胞独立于尺寸的电学特性参数，因此需要用到显微镜和高速摄像头，且图像、数据处理的过程极为复杂。不能高通量检测独立于细胞尺寸的固有单细胞电学参数(如细胞膜比电容和细胞质电导率)，制约单细胞研究。

以往对中性粒细胞电学特性的检测，以体外中性粒细胞细胞系、或者是分离动物原代中性粒细胞进行体外培养之后，再诱导炎症模型，检测炎症状态下的电学特性变化。由于技术原因，迄今为止，没有构建直接反映体内模型包括脑缺血模型的中性粒细胞电学特性变化的研究方法和研究体系。

发明内容

本发明目的在于提供针对体内脑缺血模型的原代外周血中性粒细胞的细胞电学特性的检测方法，以解决上述的至少一项技术问题，本研究应用微流控技术构建了可以高通量检测脑缺血模型外周血中性粒细胞电学特性的动态变化的方法。

本发明提供一种脑缺血模型外周血中性粒细胞电学特性的动态变化的检测方法，采用双频交流信号作为检测信号检测获自脑缺血模型的外周血中性粒细胞的电学特性的动态变化。

其中，所述双频信号的频率分别为100kHz和180kHz。

进一步，所述中性粒细胞电学特性包括中性粒细胞的细胞膜比电容和细胞质电导率。

上述的检测方法在制备筛选缺血性卒中靶向中性粒细胞的药物的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

上述的检测方法在制备评价缺血性卒中患者预后效果的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

上述的检测方法在制备评价缺血性卒中患者药物治疗反应的产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

其中，所述药物治疗反应包括溶栓药物r-tPA对缺血性卒中患者电学特性的影响或者靶向免疫细胞的神经保护药物对患者电学特性的影响。

上述的检测方法在中性粒细胞的电学特性的分子机制的研究中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果在于：

本发明构建了大鼠脑缺血-再灌注模型，在脑缺血2小时-再灌注24小时，取脑组织，进行TTC染色，表明脑缺血模型成功。同时，我们分离静脉血，用梯度密度离心法分离外周血中性粒细胞，用微流控芯片检测中性粒细胞的细胞膜比电容和细胞质电导率。为了分析离体以后，中性粒细胞的电学是否发生了动态的变化，将程序设定为5分钟一个周期，连续分析了4个周期。这说明脑缺血后的中性粒细胞，即使离体以后，细胞膜仍然处于一种动态变化，因此可能将此应用于多种研究当中，如是否可以判断缺血性卒中预后、或者药物治疗反应如溶栓药物r-tPA对缺血性卒中患者电学特性的影响、或者靶向免疫细胞的神经保护药物对患者电学特性的影响。

现有的的检测方法，都是针对体外培养的细胞模型的，没有应用于体内模型的免疫细胞电学特性的研究。本发明的检测方法免标记、快速、高通量，有效提高了细胞膜比电容检测通量，同时无需光学检测和图像分析，有效降低成本，简化操作，可以实时计算得到细胞的电生理特性结果，不需要后处理数据。所用的导电溶液配制简单：所述细胞流入通道，细胞穿行压缩通道，导电通道，导电压缩通道和细胞回收通道均充满导电溶液，且所述两个电极均与所述导电通道的导电溶液接触，所述导电溶液包括与细胞等渗透压的磷酸盐缓冲液。

本发明首次将单细胞电学的方法应用于疾病模型体内中性粒细胞特性的检测。不同于以往的免疫细胞电学检测方法，本方法的特点在于免标记、高通量、可以实时计算得到细胞的电生理特性结果，具有高效率的优势。该系统将来可用于临床缺血性卒中后的中性粒细胞的电学特性，具有广阔的应用前景，可以推动缺血性卒中中性粒细胞分子机制的研究，以及临床上可以应用于缺血性卒中的预后和治疗药物的选择。

附图说明

图1为本发明实施例的大鼠脑缺血-再灌注的示意图；

图2为本发明实施例的梯度密度离心法制备大鼠外周血中性粒细胞的步骤示意图；

图3为本发明实施例的检测大鼠外周血中性粒细胞的细胞膜比电容、细胞质电导率的所有时间点的二维数据图；

图4为本发明实施例的检测大鼠外周血中性粒细胞的细胞膜比电容、细胞质电导率的所有时间点的统计图

图5为本发明实施例的检测大鼠外周血中性粒细胞的不同时间点的细胞膜比电容、细胞质电导率的二维数据图；

图6为本发明实施例的检测大鼠外周血中性粒细胞的不同时间点的细胞膜比电容、细胞质电导率的统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、大鼠脑缺血再灌注模型的制备：

本实验采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的方法制作急性脑缺血大鼠模型(SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，大鼠称体质量后5％恩氟烷混合70％N

假手术对照组模型：将缺血型脑卒中大鼠模型的制备步骤中的插入尼龙线的步骤去除，其余步骤不变，得到假手术对照组模型。

从图1中可以看出成功构建了大鼠脑缺血-再灌注模型，在脑缺血2小时-再灌注24小时，取脑组织，进行TTC染色，统计结果显示脑梗死体积大约40％，表明缺血型脑卒中大鼠模型成功。

2、大鼠外周血中性粒细胞的制备：

以步骤1中制备的脑缺血模型大鼠为脑缺血组，以假手术组大鼠作为对照，每组取3只大鼠进行重复实验，实验结果取平均值。将脑缺血组和假手术组的大鼠分别通过右旋糖酐沉淀法结合Ficoll密度梯度离心法从大鼠血液中获得中性粒细胞(如图2所示)，使用无内毒素溶液和4℃无菌条件，以防止细胞过早激活，具体包括如下步骤：

2.1制备抗凝血：将抗凝剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，TBDTM-0050)与全血按照体积比为1：1混合，得到抗凝血液。

2.2取一只离心管，先计入分离液I(Ficoll，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)3ml，后加入80％浓度分离液I溶液(即分离液I：样本稀释液(2010C1119)＝4：1的混合液)1.5ml，形成分离液梯度界面。

2.3制备血液样本：抗凝血液与红细胞沉降液(6％羟乙基淀粉，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，HBS-TBD550-80)按1：1比例混匀后，小心加于分离液梯度界面之上，800g离心20分钟。

2.4清洗中性粒细胞：离心后，血浆层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状中性粒细胞层，加3-5倍体积清洗液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，2010X1118)混匀，400g离心10分钟。

2.5裂解红细胞：取白色环状细胞层，加5倍体积的红细胞裂解液(NH4CL2009)，离心10分钟。

2.6清洗中性粒细胞：弃上清，加清洗液，离心5分钟。弃上清，将剩余的中性粒细胞用300μl的磷酸缓冲液混匀，并用40μm的无菌滤膜进行过滤，细胞浓度调节到6*10

3、中性粒细胞电学特性的检测

分别将步骤2中得到的脑缺血模型组和假手术对照组的外周血中性粒细胞进行电学特性检测，在检测过程中，使用100kHz和180kHz的双频交流信号作为检测信号，气动控制器提供负3kPa的压力以连续驱动单细胞通过压缩通道(横截面小于细胞尺寸)。当单细胞挤过压缩通道时，其双频信号下的阻抗变化被记录，结合所提出的等效电学模型，可以高通量、实时得到细胞固有电学特性参数(细胞膜比电容和细胞质电导率)。每个测试周期为5min，可检测几百-1000个细胞，并计算出细胞膜比电容与细胞质电导率。本发明中所涉及到的细胞膜比电容的检测，均采用公开号为CN106959391A的中国专利中所记载的细胞膜比电容检测方法。以细胞质电导率作为横坐标，细胞膜比电容作为纵坐标，绘制二维数据图，如图3-6所示。其中，图3中的M1、M2、M3分别表示脑缺血模型组的第一只、第二只、第三只大鼠，S1、S2、S3分别表示假手术组的第一只、第二只、第三只大鼠，图4从每只大鼠散点图3最集中(红色区域)的50％提取数据，计算平均值和方差，以显示每只大鼠电特性的差异。(a)为中性粒细胞细胞膜比电容和细胞质电导率的二维柱状图；(b)为中性粒细胞细胞细胞膜比电容的柱状图图(c)为中性粒细胞细胞细胞质电导率的柱状图；S-csm表示假手术组的细胞膜比电容，M-csm表示脑缺血模型组的细胞膜比电容，S-cyto表示假手术组的细胞质电导率，M-cyto表示脑缺血模型组的细胞质电导率。图5中的M表示脑缺血模型组，S表示假手术组，cycle1-4分别表示测试第1-4个测试周期；图6中t1-t4表示第一、第二、第三、第四个测试周期，M1、M2、M3分别表示脑缺血模型组的第一只、第二只、第三只大鼠，S1、S2、S3分别表示假手术组的第一只、第二只、第三只大鼠。

从图3-6可以看出，用微流控芯片检测中性粒细胞的细胞膜比电容和细胞质电导率(图3-4)。脑缺血组的中性粒细胞的细胞膜比电容(1105-M1＝1.412±0.643μF/cm

统计结果显示，脑缺血组的中性粒细胞的细胞膜比电容(如图3-4所示)要高于假手术组，脑缺血组的中性粒细胞的细胞质电导率要高于假手术组。为了分析离体以后，中性粒细胞的电学是否发生了动态的变化，将程序设定为5分钟一个周期，连续分析了4个周期，中性粒细胞电学的改变，发现随着离体时间的延长，脑缺血组的中性粒细胞细胞膜比电容逐渐上移，而假手术组的细胞膜比电容则相对是稳定的(如图5-6所示)；而细胞质电导率没有随着时间发生显著的变化(如图4-6所示)。这说明脑缺血后的中性粒细胞，即使离体以后，细胞膜仍然处于一种动态变化，因此，该方法一方面可以应用于中性粒细胞的电学特性的分子机制的研究，也可以应用于靶向中性粒细胞的治疗药物的筛选；此外，也可能将此应用于缺血性卒中预后、或者药物治疗反应如溶栓药物r-tPA对缺血性卒中患者电学特性的影响、或者靶向免疫细胞的神经保护药物对患者电学特性的影响。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。