微流控芯片技术检测肺癌外周血循环肿瘤细胞的应用研究

摘要

外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）直接来源于肿瘤组织，具有肿瘤组织特性，与肿瘤的发生和发展、尤其是肿瘤的转移复发密切相关，肿瘤患者外周血CTCs数目及基因特征的变化都可以用来诊断和监测肿瘤的预后及发展状况。但外周血中CTCs数量稀少，1mL（含109个红细胞、106个白细胞）血液里可能只含有几个CTCs，研究灵敏度高、特异性好的检测方法具有重要临床应用意义。微流控芯片因其尺寸较小，且高集成度，低试剂消耗和快速响应而成为最有应用前景的CTCs检测技术。本论文就针对CTCs的特点及检测需求，设计了一种基于细胞尺寸的CTCs富集芯片及集CTCs富集、裂解和核酸检测于一体的多功能微流控芯片。研究内容主要包括以下两部分: 1.设计了一种用于CTCs富集的微流控芯片，此款芯片是基于细胞的尺寸大小设计的，用于CTCs富集及检测，并通过检测临床肺癌病人样本外周血CTCs，验证其临床实用性。该芯片结构包括进样口，细胞团块过滤区，单细胞过滤通道和出样口。细胞团块过滤区是一排排六边形柱子，用于细胞团的阻拦，以防单细胞过滤阵列堵塞，而单细胞过滤区由主管道、过滤管道和侧管道依次平行排列。该芯片对癌细胞的捕获率可达80％以上，对100例肺癌病人和100例健康体检者外周血血液样本进行CTCs检测，并用肿瘤细胞上皮标记物CK8+18、CK19、间质标志物Vimentin和免疫作用分子PD-L1染色表征鉴别CTCs，结果发现肺癌患者的CTCs数目显著高于健康体检者(P＜0.001)，接受者操作特征曲线(ROC)分析显示，此微流控装置具有较高的灵敏度和特异性（92％的灵敏度和91％的特异性），且该芯片还可以鉴别不同免疫表型的CTCs，在肿瘤诊断及预后监测方面具有重要的参考价值和临床应用意义。 2.在CTCs富集芯片的基础上设计了一种多功能微流控芯片，芯片由三部分组成，包括CTCs捕获区域，单层膜阀区域和基于数字聚合酶链式反应(dPCR)的微腔式核酸检测分析区域。通过一个控制阀门，将CTCs捕获芯片与核酸检测芯片连接在一起，使得CTCs捕获、细胞裂解及基因检测在一块芯片上完成。应用该芯片对肺癌细胞系H1975(EGFR-L858R突变)和A549细胞（EGFR野生型）gDNA进行检测，在H1975细胞中检测到了EGFR-L858R突变，而在A549细胞中未检测到突变，进一步验证了该芯片可以成功实现CTC细胞内基因突变的检测，以用于肿瘤靶向药物及精准诊疗的参考依据。 综上所述，基于细胞尺寸差异，我们设计了一种由过滤细胞团块的六边形柱子和过滤单细胞的过滤通道阵列组成的CTCs富集微流控芯片，并联合上皮标志物CK8+18、CK19、间质标志物Vimentin和免疫作用分子PD-L1对CTCs进行鉴定分析。在临床样本中得到验证，证明其具有较高的灵敏度和特异性，可为临床应用提供重要的参考价值。另外，针对CTCs基因检测的需求，我们在CTCs捕获芯片的基础上开发了一种集CTCs捕获、裂解和基因检测于一体的多功能微流控芯片，该芯片可以实现循环肿瘤细胞的富集及突变基因检测，并在肺癌细胞系H1975细胞中得到验证，以用于肿瘤靶向药物及精准诊疗的参考依据。

目录

摘要

1．1引言

1．2循环肿瘤细胞

1．2．1循环肿瘤细胞的形成

1．2．2循环肿瘤细胞的特性

1．2．3循环肿瘤细胞的富集及鉴定分析方法

1．3循环肿瘤细胞在肺癌检测中的临床意义

1．4微流控芯片

1．4．1微流控芯片简介

1．4．2微流控芯片在循环肿瘤细胞研究中的应用

1．5本章总结

1．6本论文研究的主要内容

第2章基于细胞尺寸的微流控芯片在肺癌循环肿瘤细胞检测中的应用

2．1引言

2．2实验部分

2．2．1芯片的制作

2．2．2实验试剂及仪器

2．2．3实验方法

2．3结果与讨论

2．3．1 CTC微流控芯片的细胞回收率

2．3．2肺癌患者循环肿瘤细胞的检测

2．3．3肺癌患者不同免疫表型循环肿瘤细胞的检测

2．4本章小结

第3章可用于CTCs捕获、裂解和核酸检测的多功能微流控芯片的研究

3．1引言

3．2芯片的制备

3．2．1实验试剂及仪器

3．2．2芯片的设计

3．2．3芯片的制作

3．3芯片参数和反应条件优化

3．3．1 PDMS比例优化

3．3．2离心转速优化

3．3．3芯片封装方式优化

3．4本章小结

第4章多功能芯片在肺癌循环肿瘤细胞基因检测中的应用

4．1引言

4．2实验部分

4．2．1实验试剂及仪器

4．2．2细胞培养及获取

4．2．3 PCR试剂的配制及反应条件

4．3结果与讨论

4．3．1多功能芯片用于核酸检测

4．3．2细胞EGFR突变基因检测

4．4本章小结

5．1工作总结

5．2论文创新点

5．3未来展望

参考文献

攻读硕士期间取得的研究成果

致谢

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