基于微流控芯片技术的肺癌循环肿瘤细胞的检测及其临床意义

摘要

目的:
　　肺癌的发病率、死亡率逐年增加，已跃居全球恶性肿瘤之首，严重威胁着人类的健康。肺癌具有高侵袭、高转移的特性，大部分患者在就诊时已经发生肺、脑、骨等远处器官的转移，肿瘤转移是影响患者预后的主要因素，也是导致患者死亡的重要原因。研究发现，肿瘤患者血液中存在一种自发或因诊疗操作，从实体瘤原发灶脱离进入外周血循环的一类肿瘤细胞，称之为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)。CTC的存在与肿瘤转移有关，通过对CTC的动态监测，可获得肿瘤不同阶段的信息，对肿瘤的诊断、监测患者术后肿瘤的复发与转移、评估患者预后有重要意义，也可为患者提供更为精准的治疗提供依据。前期已经构建了一种基于微流控芯片检测CTC的便携式装置（以下称为CTC检测装置），该装置分为三部分，第一部分是DLD芯片，是一种基于细胞尺寸大小不同而进行的CTC分选平台;第二部分是免疫磁珠装置，是一种基于磁场的负性分选而构建的CTC纯化平台;第三部分是基于免疫亲和反应构建的CTC检测平台。并通过对肺癌细胞系进行分选效率的效能检测，以及与Cellsearch系统进行效能验证，证实CTC检测装置的可靠性及实用性。本研究的目的在于利用现有的CTC检测装置，对肺癌患者进行CTC的检测，并分析CTC与相关临床资料之间的关系，进而为临床工作中监测患者病情变化及治疗提供新的方法与技术手段。
　　方法:
　　收集大连医科大学附属第二医院2016年7月至2018年1月收治的100例肺癌患者，且均经过病理学诊断为肺癌，分别记录患者性别、年龄、肿瘤类型、肿瘤分期、血清标志物及有无转移等临床资料;同时选择同期15例健康人员和15例肺部良性疾病患者，将其分别作为对照1组和2组。分别采集受试者肘静脉4ml外周血，利用CTC检测装置进行CTC的检测。数据采用SPSS22.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差((x)±s)表示，计量资料应用t检验;计数资料应用x2检验，P＜0.05时表示差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.实验中一共纳入受试者130例，经CTC检测装置进行CTC的分选检测，并进行统计分析:健康对照组CTC检测阳性率0％、良性病变组检测阳性率6.67％、肺癌组CTC检测阳性率61.0％，肺癌组CTC阳性率明显高于健康对照组和肺部良性病变对照组，且通过统计学比较可知:肺癌组与健康、良性对照组相比，x2=30.896，P＜005，不同组间CTC检测结果差异有统计学意义;而健康和良性对照组相比，x2=0.967，P＞0.05，不同组间CTC检测结果差异没有统计学意义。提示CTC的存在在某种程度上可作为辅助诊断肺癌的检测手段。
　　2.不同性别和年龄的肺癌患者外周血中CTC比较:男性患者中CTC阳性率为69.5％，女性为53.7％;肺癌患者年龄为60.66±11.21岁，中位年龄为60岁，其中≤60岁肺癌患者中CTC阳性率为60％，＞60岁的肺癌患者为62％，通过统计学比较可知，肺癌患者CTC阳性率与患者性别(x2=2.62，P=0.105)以及年龄(x2=0.042，P=0.838)之间无显著性差异。由此可以发现CTC的存在与患者性别、年龄无关。
　　3.肺癌患者的病理类型以及TNM分期与CTC的关系:肺腺癌患者CTC阳性率为60％，鳞癌CTC阳性率为61.5％，小细胞肺癌CTC阳性率为57.9％，肺癌患者的不同病理类型之间的CTC阳性率比较无显著性差异(x2=2.024，P=0.567);而在TNM分期为Ⅰ期、Ⅱ期的患者CTC阳性率41.5％，Ⅲ期、Ⅳ期的患者CTC阳性率82.9％,Ⅲ期、Ⅳ期肺癌患者CTC的阳性率明显高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，不同临床分期患者之间的CTC阳性率(x2=18.01，P=0001)比较具有显著性差异。同时比较患者的转移情况:未见转移的患者CTC阳性率39.5％，转移的患者CTC阳性率76.8％，出现转移的肺癌患者CTC阳性率要高于未见明显转移灶的患者，二者之间比较有统计学意义(P＜0.05)。这一结果提示:CTC的存在与肿瘤分期、转移有关，检测CTC有助于辅助临床肺癌分期以及预测肺癌患者肿瘤的转移情况。
　　4.肺癌患者的肿瘤标志物与CTC的关系:CTC阳性的肺癌患者中癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)值为68.59±105.38ng/ml，癌类抗原125(Cancer antigen125，CA125)值为134.07±410.14ng/ml，鳞状细胞癌相关抗原(Squamous cell carcinomaassociated antigen，SCC)值为4.49±10.81ng/ml，神经元特异烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)值为22.65±21.81ng/ml，细胞角蛋白21-1(Cytokeratin fragment21-1，CYFRA21-1)值为21.61±70.21ng/ml，CTC阴性的肺癌患者中CEA值为0.83±0.711ng/ml，CA125值为8.12±10.99ng/ml，SCC值为0.84±0.56ng/ml，NSE值为15.83±3.22ng/ml，CYFRA21-1值为1.89±0.74ng/ml，通过统计学比较可知，肺癌患者CTC阳性率与患者肿瘤标志物CEA(t=-4768，P=0.001)、CA125(t=-2.081,P=0.043)、SCC(t=-2.287,P=0027)、NSE(t=-2.223,P=0.030)以及CYFRA21-1（t=-2.101，P=0.041）有显著的统计学差异。这一结果表明检测CTC可作为传统肿瘤标志物检测的辅助手段，提高肺癌的检出率。
　　5.肺癌患者治疗前后CTC比较:继续对上述肺癌患者进行随访，收集30位治疗前后的外周血并进行CTC的检测。治疗包括手术治疗、化疗等，并记录临床病情变化，包括病情进展（Progressive disease，PD），病情部分缓解(Partial response，PR)，全部缓解(Complete response，CR)以及病情稳定（Stable disease，SD），结果表明:检测患者治疗前后CTC的变化，临床病情进展的患者，治疗后CTC数目显著增加，病情缓解或是稳定患者的治疗后CTC数目明显减少，统计结果为x2=6.554，p=0.038，结果具有统计学意义。这一结果证实动态监测CTC可以监测患者病情变化并为患者个体化治疗提供依据。
　　结论:
　　通过检测肺癌患者CTC并进行统计分析，结果表明CTC数目与肿瘤分期、是否发生转移有关，可与血清肿瘤标志物辅助检测肺癌的发病及复发转移情况;通过对肺癌患者CTC进行动态监测，有助于临床诊断、病情监测和指导治疗等，CTC的深入研究也可为解决肺癌高发、高致死率提供了可能。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一．实验材料

3．实验试剂

4．试剂配制

二．实验方法

1．细胞培养

2．基于微流控芯片的CTC检测装置的构建

3．CTC检测装置的效能验证

4．CTC检测平台

三．临床患者CTC检测及统计分析

结果

一．肺癌组与健康、良性对照组的CTC检测比较

二．肺癌患者外周血CTC与临床资料的相关性分析

三 肺癌患者的血清学肿瘤标志物与CTC的关系

四 肺癌患者治疗前后CTC检测比较

讨论

结论

参考文献

综述 微流控芯片技术在肺癌CTC检测及临床应用研究

攻读学位期间发表文章情况

致谢