一种多单元格的微流控平台及其高通量筛选方法

摘要

本发明公开了一种多单元格的微流控平台，包括第一纵向隔板、第二纵向隔板和储液托盘，所述第一纵向隔板和第二纵向隔板均设有第二凹槽，所述第二凹槽的高度低于储液托盘的高度，所述第一纵向隔板和第二纵向隔板安装于储液托盘，所述第一纵向隔板和第二纵向隔板交叉排布形成第一蛇状流向槽，所述第一蛇状流向槽的两端设有进液口和出液口。可以进一步减少样品制备的时间，并增加样品的浓度梯度从而达到提高实验精度的效果；制备不同接枝密度的表面，可以在短时间内获得接枝密度的变化梯度，有效提高样品的制备效率，大大减少工作量。本发明也公开了一种多单元格的微流控平台的高通量筛选方法，解决了传统正交实验法过程繁琐、耗时的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控芯片的技术领域，尤其涉及一种多单元格的微流控平台及其高通量筛选方法。

背景技术

生物材料植入体内后，所有的反应均发生在材料的表面，因此材料表面的性质至关重要。利用各种生物活性多肽对表面进行改性，可以相应的提高材料表面的生物学行为。生物活性多肽的表面接枝密度决定了该表面的作用效果，因此合适的接枝密度不但能够节省人力物力还能够起到相应的效果。筛选具有合理的生物活性多肽的接枝密度的表面具有重要意义。使用传统的样品制备方法中对钛片进行表面改性，需要制备许多平行样，大大增加了实验的工作量。

具有抗菌功能的多肽如KRWWKWWRR、八肽RWWRIWKW、九肽KFKWWRMLI、RGD、YIGSR等。在均匀表面接枝不同浓度的多肽进行正交实验过于费时费力。

发明内容

本发明的目的是为了克服以上现有技术存在的不足，提供了一种多单元格的微流控平台及其高通量筛选方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种多单元格的微流控平台，包括第一蛇状流向槽、第二蛇状流向槽和储液托盘，所述第一蛇状流向槽的两端设有进液口和出液口，所述第一蛇状流向槽包括第一纵向隔板和第二纵向隔板，所述第一纵向隔板和第二纵向隔板均设有第二凹槽，所述第二凹槽的高度低于储液托盘的高度，所述第一纵向隔板和第二纵向隔板交叉排布地安装于储液托盘，所述第二蛇状流向槽安装于第一蛇状流向槽。

更优的选择，所述第二蛇状流向槽包括第一横向隔板和第二横向隔板，所述第一横向隔板和第二横向隔板均设有第一凹槽，所述第一凹槽的高度分别低于第一纵向隔板和第二纵向隔板，所述第一横向隔板和第二横向隔板均安装于第一蛇状流向槽，所述第一横向隔板和第二横向隔板交叉排布。

更优的选择，所述第二蛇状流向槽包括第一横向隔板、第二横向隔板和第三横向隔板，所述第一横向隔板和第二横向隔板均设有第一凹槽，所述第一凹槽的高度分别低于第一纵向隔板和第二纵向隔板，所述第三横向隔板的高度分别低于第一纵向隔板和第二纵向隔板，所述第三横向隔板安装于第一蛇状流向槽的两端，所述第一横向隔板和第二横向隔板交叉排布。

更优的选择，所述第二蛇状流向槽包括依次连接的首段流向槽、多段中段流向槽和末端流向槽，所述首段流向槽设有进液口，所述末端流向槽设有出液口，所述首段流向槽包括依次排列的三块第三横向隔板和第一横向隔板，多段所述中段流向槽包括依次排列的第二横向隔板、两块第三横向隔板和第一横向隔板，所述末端流向槽包括依次排列的第二横向隔板和三块第三横向隔板，所述第一横向隔板和第二横向隔板设有第一凹槽，所述第三横向隔板的高度低于第一纵向隔板和第二纵向隔板，所述第一凹槽的高度低于第一纵向隔板和第二纵向隔板。

一种多单元格的微流控平台的高通量筛选方法，包括以下步骤：

S1、设计并通过3D打印得到微流控制芯片打印件，所述微流控制芯片打印件经去应力退火处理，得到微流控制芯片；

S2、将所述微流控制芯片清洗干净，对所述微流控制芯片进行羟基化处理，得到表面改性微流控制芯片，所述表面改性微流控制芯片为权利要求1-4任意一项所述一种多单元格的微流控平台；

S3、将多肽溶液注入到所述表面改性微流控制芯片内，所述多肽溶液匀速地通过所述表面改性微流控制芯片的区域单元格，所述多肽溶液与所述表面改性微流控制芯片的反应时间为10分钟-20小时，当所述多肽溶液与所有所述区域单元格反应完毕后，对所述微流控制芯片进行清洗，得到多肽接枝微流控制芯片；

S4、在所述多肽接枝微流控制芯片中培养细菌或细胞，确定最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格；

S5、确定所述最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格的多肽接枝密度。

更优的选择，步骤S2中所述对所述微流控制芯片进行羟基化处理，包括以下步骤：

S211、所述微流控制芯片依次使用去离子水、丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声清洗10～20分钟，再采用保护气体将所述微流控制芯片吹干；

S212、将所述微流控制芯片浸泡在质量比为2％～8％的HF酸中处理3～15分钟；

S213、最后将所述微流控制芯片清洗干净，再次采用保护气体将所述微流控制芯片吹干，将所述微流控制芯片浸泡在浓硝酸中静置10～30分钟，得到表面改性微流控制芯片。

更优的选择，步骤S3中所述多肽溶液中的多肽分子结构式为HS-R-Peptide，所述R包括C(PA)

更优的选择，步骤S4中的在所述多肽接枝微流控制芯片中培养细菌，包括以下步骤：

S411、配制一定量的显色培养基，将所述显色培养基放置在灭菌锅中在121℃灭菌2h；

S412、将所述多肽接枝微流控制芯片放置在第一多孔培养板中，向所述多肽接枝微流控制芯片的区域单元格内依次加入浓度为10～10

S413、共孵育结束后，将所述第一多孔培养板放入到干燥箱中让所述菌液蒸发，待所述菌液蒸发完后，将所述多肽接枝微流控制芯片放置在生物全柜内静置10～15min；

S414、将步骤S411的所述显色培养基分成两部分，再将一部分的所述显色培养基加入到所述多肽接枝微流控制芯片内进行静置，直到所述显色培养基凝固为止，再将所述多肽接枝微流控制芯片放置到培养皿中，采用另一部分所述显色培养基将所述多肽接枝微流控制芯片封住，待凝固后将所述多肽接枝微流控制芯片放入恒温培养箱中培养18-48小时；

S415、待所述多肽接枝微流控制芯片静置培养完毕后，所述多肽接枝微流控制芯片在体视显微镜下观察菌落生长情况，确定最佳生物活性多肽接枝密度的区域单元格。

更优的选择，步骤S4中的在所述多肽接枝微流控制芯片中培养细胞包括以下步骤：

S421、将所述多肽接枝微流控制芯片放置在第三多孔培养板中，对所述多肽接枝微流控制芯片进行灭菌，向所述微流控制芯片每个区域单元格内依次加入浓度为10～10

S422、将所述多肽接枝微流控制芯片从所述第三多孔培养板中取出，采用PBS对所述多肽接枝微流控制芯片进行清洗，将所述多肽接枝微流控制芯片放入到第四多孔培养板中，然后向所述第四多孔培养板中加入多聚甲醛，所述多聚甲醛中对所述多肽接枝微流控制芯片进行固定；

S423、向固定有所述多肽接枝微流控制芯片的第四多孔培养板内加入活细胞F-actin微丝蛋白染色试剂进行荧光标记并采用PBS对其清洗，再向所述第四多孔培养板加入DAPI染料，对所述多肽接枝微流控制芯片进行荧光标记，然后将所述多肽接枝微流控制芯片取出并采用PBS对其清洗；

S424、在激光共聚焦显微镜下，利用FITC通道观察步骤423中的所述多肽接枝微流控制芯片表面的细胞分布情况、细胞粘附数量以及细胞分化情况，确定具有生物活性的区域单元格。

步骤S3中的所述的多肽溶液的浓度范围为1μM～5mM。

本发明相对现有技术具有以下优点及有益效果：

1、本发明通过第一蛇状流向槽、第二蛇状流向槽和储液托盘，可以进一步减少样品制备的时间，并增加样品的浓度梯度从而达到提高实验精度的效果；制备不同接枝密度的表面，可以在短时间内获得接枝密度的变化梯度，有效提高样品的制备效率，大大减少工作量。

2、本发明通过一种微流控制芯片的高通量筛选方法，能够快速确定多肽接枝微流控制芯片的制备参数，包括生物活性多肽的最佳接枝密度、制备过程中浸泡钛片所需的时间以及生物活性多肽溶液的浓度；解决了传统正交实验法过程繁琐、耗时的问题；能够直观的对比出不同生物活性多肽性能的差异，避免了使用传统均匀样品接枝实验次数多、组别多、变量复杂的问题；指导钛片的表面功能化改性，即抗菌改性，为后续实验提供制备参数。

附图说明

图1是本发明的微流控制芯片(第一种结构的3×3格式)的示意图；

图2是本发明的微流控制芯片(第一种结构的5×4格式)的示意图；

图3是本发明的微流控制芯片(第一种结构的5×5格式)的示意图；

图4是本发明的微流控制芯片(第二种结构的3×3格式)的示意图；

图5是本发明的微流控制芯片(第二种结构的5×4格式)的示意图；

图6是本发明的微流控制芯片(第二种结构的5×5格式)的示意图；

图7是本发明的微流控制芯片(第二种结构)的使用效果示意图；

图8是本发明的微流控制芯片(第一种结构的5×5格式)的多肽溶液在纵横向上(箭头为流动方向)的流向示意图；

图9是本发明的微流控制芯片(第二种结构的5×5格式)的多肽溶液在纵横向上(箭头为流动方向)的流向示意图；

图10是本发明的微流控制芯片(第一种结构的5×5格式)的多肽溶液在高度方向上(箭头为流动方向)的流向示意图；

图11是本发明中的CPAPAPKFKWWRMLI的结构式示意图；

图12是本发明中的CPAPAPRWWRIWKW的结构式示意图；

图13是本发明中的CPAPAPKRWWKWWRR的结构示意图；

图14是本发明中的CPAPAPRGD多肽的结构式示意图；

图15是本发明中的CPAPAPYIGSR多肽的结构式示意图；

图16是本发明中的接枝有CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的表面的MFI值变化柱状图；

图17是本发明中的接枝有CPAPAPRWWRIWKWK-FITC的表面的MFI值变化柱状图；

图18是本发明中的接枝有CPAPAPKFKWWRMLI-FITC的表面的MFI值变化柱状图；

附图中各部件的标记：1-储液托盘；101-进液口；102-出液口；103-首段流向槽；104-中段流向槽；105-末段流向槽；106-区域单元格；2-第一纵向隔板；201-第二凹槽；3-第二纵向隔板；4-第一横向隔板；401-第一凹槽；5-第二横向隔板；6-第三横向隔板。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的发明目的作进一步详细地描述,实施例不能在此一一赘述,但本发明的实施方式并不因此限定于以下实施例。

实施例1

金黄色葡萄球菌(ATCC 6538P)；大肠杆菌(ATCC 8739)；绿脓杆菌(ATCC15442)小鼠骨髓间充质干细胞(ATCC CRL-12424)；血管内皮细胞(

本申请实施例中所用CPAPAPKRWWKWWRR、CPAPAPKRWWKWWRRK-FITC、CPAPAPRGD、CPAPAPYIGSR多肽购买于上海强耀生物科技有限公司，CPAPAPRWWRIWKW、CPAPAPRWWRIWKWK-FITC、CPAPAPKFKWWRMLI和CPAPAPKFKWWRMLIK-FITC购买于吉尔生化(上海)有限公司。

如图1-6所示，一种多单元格的微流控平台，包括第一蛇状流向槽和第二蛇状流向槽和储液托盘1，其中第一蛇状流向槽包括第一纵向隔板2和第二纵向隔板3，第一纵向隔板2和第二纵向隔板3均设有第二凹槽201，第一纵向隔板2和第二纵向隔板3互为镜像结构；第二凹槽201的高度低于储液托盘1的边框高度，第一纵向隔板2和第二纵向隔板3均匀地安装在储液托盘1内，第一纵向隔板2和第二纵向隔板3交叉排布在储液托盘1的内腔形成第一蛇状流向槽，第一蛇状流向槽的两端分别设有进液口101和出液口102。

第一纵向隔板2和第二纵向隔板3可以改变多肽溶液的横向流动方向，从而形成蛇状流向，第二凹槽201的高度低于储液托盘1的高度，第二凹槽201的高度为第一纵向隔板2和第二纵向隔板3的1％～99％，第二凹槽201的高度为0.1～20mm，第二凹槽201的长度为第一纵向隔板2和第二纵向隔板3长度的1％～99％；多肽溶液当高于第二凹槽201的高度时，则从该第二凹槽201流出形成蛇状流向；储液托盘1起到储液的作用；进液口101用于注入多肽溶液，出液口102用于完成反应的多肽溶液流出。

如图1所示，第一种结构的微流控平台包括9个区域单元格10，即是第一蛇状流向槽内包括了9个区域单元格106，该微流控制芯片规格为3×3；第一蛇状流向槽内包括3块第一横向隔板4和3块第二横向隔板5，第一横向隔板4和第二横向隔板5安装在第一蛇状流向槽内形成第二蛇状流向槽，组成9个区域单元格106。区域单元格106的边长为0.05～100mm。

如图2所示，第一种结构的微流控平台的规格为5×4(即是一共20个区域单元格106)，第一蛇状流向槽内包括8个第一横向隔板4和8个第二横向隔板5，第一横向隔板4和第二横向隔板5交叉排布在第一蛇状流向槽内形成第二蛇状流向槽，组成20个区域单元格。

如图3所示，第一种结构的微流控平台的规格为5×5(即是一共25个区域单元格106)，第一蛇状流向槽包括10个第一横向隔板4和10个第二横向隔板5，第一横向隔板4和第二横向隔板5交叉排布在第一蛇状流向槽内形成第二蛇状流向槽，组成25个区域单元格。

如图1-3所示，上述的第一横向隔板4、第二横向隔板5均设有第一凹槽401，第一横向隔板4和第二横向隔板5互为镜像结构；第二凹槽201的高度与第一凹槽401的尺寸相同，并且低于第一纵向隔板2、第二纵向隔板3和储液托盘1的高度。

如图4所示，第二种结构的微流控平台，其规格包括3×3、5×4和5×5。其中，规格为3×3的微流控制芯片的第一蛇状流向槽包括1段首段流向槽103、1段中段流向槽104和1段末段流向槽105，一共有9个区域单元格106。首段流向槽103设有进液口101，其包括1块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4，第一横向隔板4设有第一凹槽401，第一凹槽401的高度与第三横向隔板6的高度相同。第三横向隔板6和第一横向隔板4依照多肽溶液流向方向安装在首段流向槽103；中段流向槽104包括1块第一横向隔板4和1块第二横向隔板5，第二横向隔板5和第一横向隔板4沿着多肽溶液流向设置在中段流向槽104内；末段流向槽105包括1块第二横向隔板5和1块第三横向隔板6，第二横向隔板5和第三横向隔板6按照多肽溶液流向方向依次排列在末段流向槽内。第三横向隔板6的高度为储液托盘1高度的1％～99％。

如图5所示，规格为5×4的微流控平台，一共包括20个区域单元格106，第一蛇状流向槽包括1段首段流向槽、2段中段流向槽104和1段末段流向槽105，按照多肽溶液的流向方向依次连接。首段流向槽103设有进液口101，末段流向槽105设有出液口102，进液口101和出液口均设置在储液托盘1的一侧；首段流向槽103包括3块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4，3块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4按照多肽溶液流向方向设置在首段流向槽内；中段流向槽104包括1块第二横向隔板5、2块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4，1块第二横向隔板5、2块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4按照多肽溶液流向方向依次设置在中段流向槽104内；末段流向槽105包括1块第二横向隔板5、3块第三横向隔板6，1块第二横向隔板5和3块第三横向隔板6按照多肽溶液流向方向依次设置在末段流向槽105内。

如图6所示，第二种结构的规格为5×5的微流控平台，第一蛇状流向槽一共有25个区域单元格106，第一蛇状流向槽包括按照多肽溶液流向方向依次连接的1段首段流向槽103、3段中段流向槽104和1段末段流向槽105，首段流向槽103设有进液口101，末段流向槽105设有出液口。首段流向槽103包括按照多肽溶液流动方向依次设置的3块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4。中段流向槽104包括按照多肽溶液流动方向依次设置的1块第二横向隔板5、2块第三横向隔板6和1块第一横向隔板4；末段流向槽105包括按照多肽溶液流动方向依次设置的1块第二横向隔板5和3块第三横向隔板6。

如图4-6所示，上述的第三横向隔板6的高度与第一横向隔板4的第一凹槽401的高度相同，而且第三横向隔板6低于第一纵向隔板2、第二横向隔板3和储液托盘1的最高高度。第一横向隔板4和第二横向隔板5可以让多肽溶液横向流动方向从而形成横向蛇状流向；第三横向隔板6可以让多肽溶液在高度方向上呈蛇状流向。

一种多单元格的微流控平台的高通量筛选方法，包括以下步骤：

S1、通过设计得到微流控制芯片图纸，根据微流控制芯片图纸，以Ti

微流控制芯片打印件采用去应力退火处理包括以下步骤：

S101、微流控制芯片打印件以升温速度为3～10℃/min升温到300℃～700℃，然后微流控制芯片打印件在该温度下恒温1～3h，停止加热后在炉内自然冷却至室温；

S102、将步骤S101中的微流控制芯片打印件，采用喷砂机对其表面的氧化皮进行清除。

S2、将步骤S1中的微流控制芯片清洗干净，对微流控制芯片进行羟基化处理，得到表面改性微流控制芯片；

S21、步骤S2中的对微流控制芯片进行羟基化处理，包括以下步骤：

S211、微流控制芯片依次使用去离子水、丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声清洗10～20min，再采用保护气体(包括氮气、氩气或氦气)将微流控制芯片吹干；

S212、再将微流控制芯片浸泡在质量比为2％～8％的HF中处理3～15min；

S213、最后将微流控制芯片清洗干净，再次采用保护气体将微流控制芯片吹干，将微流控制芯片浸泡在浓硝酸中10～30min，得到表面改性微流控制芯片。

S3、将多肽溶液注入到步骤S2中的表面改性微流控制芯片内，多肽溶液通过注射器均速地注入到表面改性微流控制芯片，多肽溶液流经表面改性微流控制芯片的所有区域单元格106；当多肽溶液流经于表面改性微流控制芯片的所有区域单元格106(接枝反应时间为10min～20h)后，采用去离子水或无水乙醇对微流控制芯片进行清洗，得到多肽接枝微流控制芯片。

步骤S3中用到的多肽溶液中的多肽的分子结构式为HS-R-Peptide，其中，R包括但不限于C(PA)

S4、在多肽接枝微流控制芯片中培养细菌或细胞，确定最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格106。

S41、步骤S4中的在多肽接枝微流控制芯片中培养细菌，居然后确定抗菌性能达标的区域单元格106，具体包括以下步骤：

S411、配制一定量的显色培养基，将显色培养基放置在灭菌锅中在121℃下灭菌2h；该显色培养基是在培养基上培养18-48h后能够长出红色的菌落，便于进行计数观察。

S412、将多肽接枝微流控制芯片放置在第一多孔培养板中，在多肽接枝微流控制芯片的每个格子内依次加入浓度为10～10

S413、共孵育结束后，将第一多孔培养板放入到干燥箱中让菌液蒸发，待菌液蒸发完后，将多肽接枝微流控制芯片放置在生物全柜内静置10～15min，至多肽接枝微流控制芯片的表面润湿，仅保留粘附在多肽接枝微流控制芯片上的细菌；

S414、在生物安全柜内，将步骤S411的显色培养基分成两部分，再将一部分的显色培养基加入到多肽接枝微流控制芯片内进行静置，直到显色培养基凝固为止，再将多肽接枝微流控制芯片放置到培养皿中，采用另一部分的显色培养基将多肽接枝微流控制芯片封住，显色培养基应高于多肽接枝微流控制芯片3～5mm，保证显色培养基不会干燥，待凝固后将所述多肽接枝微流控制芯片放入恒温培养箱中培养18-48小时；

S415、待多肽接枝微流控制芯片静置培养完毕后，多肽接枝微流控制芯片在体视显微镜下观察菌落生长情况(多肽接枝微流控制芯片的每个区域单元格106内的菌落个数)，确定最佳生物活性多肽接枝密度的区域单元格106。

S42、步骤S4中的在多肽接枝微流控制芯片中培养细胞，该细胞包括骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞或神经细胞，利用FITC荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察细胞的生产情况，具体包括以下步骤：

S421、将多肽接枝微流控制芯片放置在第三多孔培养板中，该第三多孔培养板为12孔培养板，利用乙醇(为体积浓度75％的乙醇溶液)对多肽接枝微流控制芯片进行灭菌，灭菌时间为2.5小时，再向第三多孔培养板中加入浓度为10个/mL～10

S422、将多肽接枝微流控制芯片从第三多孔培养板中取出，采用PBS清洗对多肽接枝微流控制芯片进行清洗3次，将多肽接枝微流控制芯片放入到第四多孔培养板中，该第四多孔培养板为12孔培养板，然后向第四多孔培养板中加入多聚甲醛，多聚甲醛对多肽接枝微流控制芯片进行固定，多聚甲醛的固定条件为温度4℃下固定12h；

S423、向固定有所述多肽接枝微流控制芯片的第四多孔培养板内加入活细胞F-actin微丝蛋白染色试剂进行荧光标记，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)清洗后加入DAPI染料(DAPI，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测)进行荧光标记，然后将所述多肽接枝微流控制芯片取出并采用PBS对其清洗3次；

S424、在激光共聚焦显微镜下，利用FITC通道观察步骤423中的多肽接枝微流控制芯片表面的细胞分布情况、细胞粘附数量以及细胞分化情况，确定具有生物活性的区域单元格106。

S5、确定最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格106的多肽接枝密度。

步骤S5中的确定多肽接枝密度的方法：在多肽接枝微流控制芯片的表面接枝CPAPAPKRWWKWWRR-FITC或者CPAPAPRWWRIWKWK-FITC或者CPAPAPKFKWWRMLIK-FITC等荧光多肽进行接枝，测定多肽接枝微流控制芯片的荧光值并绘制MFI值变化柱状图，通过MFI值变化柱状图来确定接枝时间与接枝密度的关系，确定多肽接枝微流控制芯片的每个区域单元格106的接枝密度。

将表面改性微流控制芯片浸泡在HS-R-Peptide溶液中，制备得到目标生物活性多肽接枝密度的表面改性微流控制芯片，确定浸泡参数，生物活性多肽溶液的浓度A、浸泡时间B的方法为：

将步骤S3中的生物活性多肽接枝密度梯度化的表面改性微流控制芯片沿多肽溶液的流动方向划分为n区域，对于N×L芯片，则需要划分为N×L个区域单元格106，区域单元格106标号为1～n，则1≤n≤N×L，步骤S3中的多肽溶液的浓度为aμM，步骤S3中多肽溶液流经所有区域单元格106的时间为bmin；则A/μM＝a，B/min＝nb/N×L，N≥3，L≥3，N和L均为整数；

其中，目标生物活性多肽接枝密度与步骤S4中的最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格106中生物活性多肽的接枝密度相同。

本实施例中的一种多单元格的微流控平台的高通量筛选方法，包括以下步骤：

S1、经过设计和3D打印得到尺寸为1.5cm×1.5cm的方形5×5微流控制芯片打印件，利用质量比为4％HF酸对微流控制芯片处理5min，再用去离子水对微流控制芯片清洗5min，去除表面残留的氟离子，得到微流控制芯片；

S2、再将微流控制芯片放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用去离子水对其冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面改性微流控制芯片；

S3、多肽溶液为以无水乙醇作为溶剂配制出CPAPAPKRWWKWWRRK-FITC多肽的无水乙醇溶液，其浓度为150μM；采用1ml注射器吸取的多肽溶液的体积为400μl，多肽溶液的流经速度为100μl/h，接枝反应时间为4h，注射过程如图7所示；反应后，取出多肽接枝的表面改性微流控制芯片，用无水乙醇对其清洗干净，再用氮气吹干，得到多肽接枝微流控制芯片；

S4、在多肽接枝微流控制芯片表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察；

S5、统计荧光值绘制MFI(Mean fluorescence intensity，平均荧光强度)值变化柱状图，如图16所示，表明该装置能够成功的构建出接枝密度梯度。

实施例2

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的步骤S3中的多肽溶液采用CPAPAPRWWRIWKWK-FITC多肽的无水乙醇溶液代替CPAPAPKRWWKWWRRK-FITC多肽的无水乙醇溶液。本实施例中的MFI值变化柱状图，如图17所示。

实施例3

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的步骤S3中的多肽溶液采用CPAPAPKFKWWRMLIK-FITC多肽的无水乙醇溶液代替CPAPAPKRWWKWWRRK-FITC多肽的无水乙醇溶液，本实施例中的MFI值变化柱状图，如图18所示。

实施例4

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的步骤S3中的多肽溶液采用CPAPAPKRWWKWWRR多肽的无水乙醇溶液代替CPAPAPKRWWKWWRR-FITC多肽的无水乙醇溶液。

2、本实施例中的步骤S4中多肽接枝微流控制芯片使用琼脂封片法进行抗菌性能的表征，观察每个区域单元格106的细菌生长情况，以及每一个区域单元格106的抗菌效果，确定具有最佳抗菌性能的区域单元格106。经确定其有效抗金黄色葡萄球菌的区域单元格106自第5区域单元格106开始，抗绿脓杆菌区域单元格106自第6区域单元格106开始以及抗大肠杆菌的区域单元格106自第5区域开始，至浓度最高的第25区域单元格106；因此，筛选第5区域为抗菌起始区域单元格106。计算得该区域的多肽分子接枝密度为28.01ng/cm

3、放大实验：取羟基化处理的同样制备参数的3D打印的Ti

4、在CPAPAPKRWWKWWRR多肽均匀接枝Ti

实施例5

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的步骤S3中的多肽溶液采用CPAPAPRWWRIWKW多肽的无水乙醇溶液代替CPAPAPKRWWKWWRRK-FITC多肽的无水乙醇溶液。

2、本实施例中将步骤S4的多肽接枝微流控制芯片使用琼脂封片法进行抗菌性能的表征，观察每个区域的细菌生长情况，以及每一个区域单元格106的抗菌效果，确定具有最佳抗菌性能的区域单元格106。经确定其有效抗金黄色葡萄球菌的区域单元格106自第12区域单元格106开始，抗绿脓杆菌区域自第13区域单元格106开始以及抗大肠杆菌的区域单元格106自第12区域单元格106开始，至浓度最高的第25区域单元格106；因此，筛选第12区域单元格106为抗菌起始区域单元格106。计算得该区域单元格106的多肽分子接枝密度为31.72ng/cm

3、放大实验：取羟基化处理同样制备参数的3D打印的Ti

4、在CPAPAPRWWRIWKW多肽均匀接枝的Ti

实施例6

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的步骤S3中的多肽溶液采用CPAPAPKFKWWRMLI多肽的无水乙醇溶液代替CPAPAPKRWWKWWRR-FITC多肽的无水乙醇溶液。

2、本实施例中将步骤S4的多肽接枝微流控制芯片使用琼脂封片法进行抗菌性能的表征，观察每个区域单元格106的细菌生长情况，以及每一个区域单元格106的抗菌效果，确定具有最佳抗菌性能的区域单元格106。经确定其有效抗金黄色葡萄球菌的区域单元格106自第23区域开始，抗绿脓杆菌区域单元格106自第24区域单元格106开始以及抗大肠杆菌的区域单元格106自第23区域单元格106开始，至浓度最高的第25区域单元格106；因此，筛选第23区域单元格106为抗菌起始区域单元格106。通过计算得到该区域单元格106的多肽分子接枝密度为46.93ng/cm

3、放大实验：取羟基化处理的同样制备参数的3D打印的Ti

4、在CPAPAPKFKWWRMLI多肽均匀接枝的Ti

实施例7

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的多肽溶液采用浓度为150μM的RGD的无水乙醇溶液代替150μM的CPAPAPKRWWKWWRR-FITC多肽的无水乙醇溶液。

2、将步骤S3的多肽接枝微流控制芯片划分为25个区域单元格106，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在步骤S3的多肽接枝微流控制芯片表面的分布情况，确定最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格106。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第7个区域单元格106开始以及有效促血管内皮细胞粘附的区域单元格106自第7个区域单元格106开始，至浓度最高的第25区域单元格106；因此，筛选第7区域单元格106为最佳促细胞黏附起始区域单元格106。经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为30.85ng/cm

3、放大实验：取羟基化处理的同样制备参数的3D打印的Ti

4、在CPAPAPRGD多肽均匀接枝Ti

实施例8

本实施例中除以下技术特征外，其他技术特征与实施例1相同：

1、本实施例中的多肽溶液采用浓度为150μM的CPAPAPYIGSR多肽的无水乙醇溶液代替150μM的CPAPAPKRWWKWWRR-FITC多肽的无水乙醇溶液。

2、将步骤S3的多肽接枝微流控制芯片划分为25个区域单元格106，并在其表面神经细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在多肽接枝微流控制芯片表面的分化情况，确定最佳生物活性多肽接枝密度区域单元格106。经确定，其有效促神经细胞分化的区域单元格106自第6个区域单元格106开始至浓度最高的第25区域单元格106；因此，筛选第6区域单元格106为最佳促细胞黏附起始区域单元格106。经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为29.84ng/cm

3、放大实验：取羟基化处理的同样制备参数的3D打印的Ti

4、在YIGSR多肽均匀接枝Ti

对比例1

传统用于钛片表面改性的生物活性多肽接枝密度的方法，步骤如下：

(1)取75块形状为方形的钛片，尺寸为1cm×1cm，利用4％HF酸对钛片进行处理5min，用去离子水对钛片清洗5min，为了去除表面残留的氟离子；再用去离子水对钛片超声清洗3min；最后采用浓硝酸对钛片浸泡15min，浸泡后浓硝酸的钛片采用去离子水超声清洗3min，采用氮气将钛片吹干。

(2)将步骤(1)的钛片平铺固定于容器中，加入300μl的生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的无水乙醇溶液，浓度150μM，使其没过钛片的底部。75块钛片分为25个组别，每个组别为3块钛片，25个组别的钛片在生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC溶液中浸泡时间分别为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min、130min、140min、150min、160min、170min、180min、190min、200min、210min、220min、230min和240min。

(3)取出步骤(2)的钛片，利用无水乙醇和去离子水分别对钛片清洗3次，得到不同生物活性多肽接枝密度的钛片。

(4)使用荧光显微镜的FITC通道表征表面荧光值的变化情况。

对比例2

本对比例中除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPRWWRIWKW-FITC的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的无水乙醇溶液。

对比例3

本对比例中除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPKFKWWRMLI-FITC的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的无水乙醇溶液。

对比例4

本对比例中除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

1、本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的无水乙醇溶液。

2、本对比例中将步骤(3)钛片在其表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，利用琼脂封片方法，观察细菌在钛生物材料表面的分布情况，以及每一条件下的抗菌效果，通过以上实验确定钛基底确定促进最佳抗菌效果，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为150μM，浸泡时间为40min。通过计算得到该区域的多肽分子接枝密度为28.01ng/cm2；同时，以未处理的钛基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面抗金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌分别为99.43％，98.82％和99.59％。因此最佳制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为150μM，浸泡时间为40分钟。

对比例5

本对比例中除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

1、本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPRWWRIWKW的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的无水乙醇溶液。

2、本对比例中将步骤(3)钛片在其表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，利用琼脂封片方法，观察细菌在钛片的表面的分布情况，以及每一条件下的抗菌效果，通过以上实验确定钛片底确定促进最佳抗菌效果，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为150μM，浸泡时间为110min。通过计算得到该区域的多肽分子接枝密度为31.72ng/cm

对比例6

本对比例中除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

1、本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPKFKWWRMLI的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR-FITC的无水乙醇溶液。

2、将步骤(3)钛片在其表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，利用琼脂封片方法，观察细菌在钛片表面的分布情况，以及每一条件下的抗菌效果，通过以上实验确定钛片底确定促进最佳抗菌效果，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为150μM，浸泡时间为220min。计算得该区域的多肽分子接枝密度为46.93ng/cm

对比例7

本对比例除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

1、本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPRGD的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR的无水乙醇溶液。

2、将步骤(3)的钛片在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在钛片表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为150μM，浸泡时间为60min。计算得该区域的多肽分子接枝密度为30.85ng/cm

对比例8

本对比例除以下技术特征外，其他技术特征与对比例1相同：

1、本对比例中的多肽溶液采用生物活性多肽CPAPAPYIGSR的无水乙醇溶液代替生物活性多肽CPAPAPKRWWKWWRR的无水乙醇溶液。

2、将步骤(3)的钛片在其表面培养神经细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在表面的分化情况，确定细胞分化最佳区域范围，根据表面细胞的长宽比衡量细胞分化程度，统计和比较表面不同位置促进细胞分化的生物学性能。经确定，其最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为150μM，浸泡时间为50min。通过计算得到该区域的多肽分子接枝密度为29.84ng/cm

综上实施例和对比例可以看出，相比于传统的正交实验方法，本发明方法可以快速确定制备物活性多肽接枝改性功能化表面的制备参数，包括生物活性多肽的最佳接枝密度、制备过程中材料所需的时间以及生物活性多肽溶液的浓度。

上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。