基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法

摘要

本发明属于生物分析领域，涉及基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病基因Pax‑5a基因检测试剂盒。在目标基因存在的时候，HP‑HCR的尾部序列与Pax‑5a基因形成平末端。加入λ核酸外切酶后，从5’端开始逐渐消化发夹，将Pax‑5a序列从HP‑HCR上释放出来与下一个发夹探针结合，实现基因的循环利用，达到第一步扩增的目的。同时，HP‑HCR被裂解成单链触发链，引发杂交链式反应。H1链被触发链打开后，与H2链序列杂交。产生的杂交链继续与新的H1和H2链结合，H1和H2上的荧光基团与猝灭基团相互远离，荧光信号恢复以实现Pax‑5a基因的第二次扩增。从而实现对急性白血病Pax‑5a基因的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

急性B淋巴细胞白血病是一种可怕的癌症，尤其是在儿童中。急性白血病的主要特征表现为细胞分化和增殖的遗传变化或染色体异常。Pax-5通常是指Pax-5a，Pax-5基因在调节B细胞的发育和分化中起重要作用，是Pax家族的成员中的一员。Pax-5基因的异常表达与淋巴细胞白血病密切相关。它在其他谱系的肿瘤中很少呈阳性，因此Pax-5被认为是B细胞谱系的标志物。因此，研究和检测Pax-5基因对于急性B淋巴细胞白血病的早期诊断和晚期治疗具有重要意义。

λ核酸外切酶是一种外切酶，可以消化磷酸化的双链DNA和单链DNA。反应机理是沿5’-3’序列逐渐降解磷酸化的单核苷酸5’端。λ核酸外切酶具有高剪切速率，但对非磷酸化DNA和单链DNA的活性较低。鉴于此特性，λ核酸外切酶可用于切割磷酸化双链DNA以获得所需的单链DNA。

为了提高检测核酸时信号的灵敏度，往往需要构建信号放大系统。研究人员提出了许多用于放大生物信号的技术，例如CRISPR-Cas13a放大系统、解旋酶连接的放大系统、聚合酶链式反应(PCR)和杂交链式反应(HCR)。本课题组前期对急性白血病基因Pax5a检测采用了电化学法对信号进行放大，通过DNA聚合酶和限制性内切酶两种酶的相互协同作用，实现了目标基因的循 环利用，放大了检测信号；酶促扩增产生的G-四链体可以与hemin结合形成具有辣根过氧化 物模拟酶性质的G-四链体/hemin复合物，利用其催化双氧水的还原产生的稳定的电流信 号，实现了对目标基因的灵敏检测；然而，电化学生物传感器通常在信号产生方面具有某些限制。一方面，在构建电化 学生物传感器时，需要标记适当的电活性物质，这可能会限制检测灵敏度；第二方面，一般 电化学层层组装反应会在电极表面不断引入干扰物；第三方面，直接在电极界面将适当的 信号放大技术引入电化学生物传感器的构建是存在效率问题。因此，在电极表面上开发新 型信号放大策略、抗干扰及信号放大效率等以提高分析物检测灵敏度为指标方法对于扩大 电化学分析应用和性能具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出一种基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒，包括HP-HCR链、H1链、H2链、缓冲液体系和λ核酸外切酶。

所述HP-HCR链序列为5’-ACTGAGTCTCCCCATGCCTGAGAGATGCGGTGATCCTTGAGACTTCAGATCTCAAGGATCACCGCATCTCTCA-3’、H1链序列为5’-TGAGAGATGCGGT-FAM-GATCCTTGAGACTAAGTTCTCAAGGAT-BHQ-CACCGCAT-3’、H2链为5’-TCTCAAGGAT-FAM-CACCGCATCTCTCAATGCGGT-BHQ-GATCCTTGAGAACTTAG-3’。

所述缓冲液体系为1 × NEB Buffer2(100 mM Tris HCl，100 mM MgCl

上述的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒的使用方法，步骤如下：

（1）配制HP-HCR链溶液，与梯度浓度的Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育1小时；

（2）向经步骤（1）处理的溶液中加入1 μL λ核酸外切酶，37℃孵育15分钟，然后加热使酶失活；

（3）经过步骤（2）处理的溶液冷却至室温，加入H1、H2链溶液，37℃孵育75分钟；

（4）将步骤（3）处理的溶液利用荧光光度计收集荧光信号。

（5）将以单碱基错配序列、三碱基错配序列、五碱基错配序列和完全错配序列分别作为目标物，检测灵敏度。

优选的，所述步骤（1）中HP-HCR链的浓度为10 μM。

优选的，所述步骤（2）中λ核酸外切酶的浓度为500 U/mL。

优选的，所述步骤（3）中H1链溶液和H2链溶液的浓度均为10 μM，H1链溶液和H2链溶液的加入量均为1μL。

优选的，所述步骤（4）中收集荧光信号时采用的激发波长为492 nm，发射波长的检测范围为490 nm-650 nm，扫描速度为1200 nm/min。

优选的，所述步骤（4）中线性方程为分段式方程，当荧光信号为5000-7000 a.u.时，线性方程为y=910.06lg(x)+6674.3，R

本发明具有以下有益效果：

1、本申请检测方法的技术原理是：在目标基因存在的时候，HP-HCR的尾部DNA序列与Pax-5a基因配对形成平末端。加入λ核酸外切酶后，从5’端开始逐渐消化发夹，Pax-5a序列从HP-HCR上释放并与下一个发夹探针结合，以循环利用Pax-5a，达到第一步扩增的目的。同时，HP-HCR被裂解生成单链触发链，从而触发下一步的杂交链式反应。H1链被触发链打开后，可以与H2链序列杂交。产生的杂交链又继续与新的H1和H2链结合，以实现Pax-5a基因的第二次扩增。此时H1和H2上的荧光基团与猝灭基团的比较远距离，因此可以通过测量荧光强度来实现对急性白血病Pax-5a基因的检测。

2、本申请设计的功能性发夹探针含有目的基因Pax-5a的结合位点。发夹探针与目的基因结合后，可以直接通过Lambda Exonuclease切割后产生DNA单链，引发杂交链式反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请的检测原理。

图2为实施例1测得的检测Pax-5a基因的荧光谱图。

图3是按照实施例1对标准样检测结果。A：实施例1荧光强度变化与检测目标物浓度对应的响应曲线，B、C：荧光强度变化与检测目标物浓度对数线性图。

图4是实施例1的选择性考察结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本申请的基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测试剂盒，包括HP-HCR链、H1链、H2链、缓冲液体系和λ核酸外切酶。

所用DNA序列如下：

所述缓冲液体系为1 × NEB Buffer2(100 mM Tris HCl，100 mM MgCl

本申请的试剂盒可构建高灵敏生物传感器：

（1）将2 μL浓度为10μM的发夹探针（HP-HCR）和1 μL浓度分别为250 nM，100 nM，50nM，25 nM，20 nM，15 nM，5 nM，4 nM，2 nM，1 nM，500 pM，100 pM，50 pM，25 pM，0 pM的Pax-5a的标准水溶液在反应管中混合，37℃孵育1小时。

（2）然后将1 μL浓度为500 U/mL的λ核酸外切酶加入，37℃恒温孵育15分钟，然后80℃加热10分钟以使酶失活。

（3）待步骤（2）中的溶液冷却到室温时，分别加入1 μL浓度为10 μM的H1、H2链溶液，37℃孵育75分钟。

（4）将180 μL的超纯水添加至步骤（3）所得的反应混合物中，然后进行荧光测量；在检测荧光信号变化时，激发波长为492 nm，发射波长的检测范围为490nm-650nm，扫描速度为1200nm/min。

（5）相同条件下，以单碱基错配序列（MT1），三碱基错配序列（MT2），五碱基错配序列（MT3）序列和完全错配序列（CMT）分别作为目标物，考察该方法的选择性。

图1是本发明所涉及的一种基于λ核酸外切酶选择性消化实现的急性白血病Pax-5a基因检测过程及原理图。在目标基因存在的时候，HP-HCR的尾部DNA序列与Pax-5a基因配对形成平末端。加入λ核酸外切酶后，从5’端开始逐渐消化发夹，将Pax-5a序列从HP-HCR上释放出来从而与下一个发夹探针结合，实现Pax-5a的循环利用，达到第一步扩增的目的。同时，HP-HCR被裂解生成单链触发链，引发杂交链式反应。H1链被触发链打开后，可以与H2链序列杂交。产生的杂交链又继续与新的H1和H2链结合，H1和H2上的荧光基团与猝灭基团相互远离，荧光信号恢复以实现Pax-5a基因的第二次扩增。然而，在没有靶DNA的情况下，HP-HCR不能被切割产生触发链，也不能触发杂交链式反应。由于H1链和H2链不能被打开，系统的荧光强度较弱。因此可以通过测量荧光强度来实现对急性白血病Pax-5a基因的高灵敏检测。

图2是检测目标基因Pax-5a的荧光谱图。由图2可以看出，当分别没有目标基因和λ核酸外切酶（曲线a）、λ核酸外切酶（曲线b）、目标基因（曲线c）时，荧光强度较弱；曲线d显示了一个完整实验系统的荧光强度，明显高于前三个系统的荧光强度，这验证了本实验方案的可行性。

图3A是按照实施例1对标准样检测得到的荧光强度变化与检测目标物浓度对应的响应曲线。图3B和图3C反映了Pax-5a基因在0 pM-250 nM的浓度范围内，荧光信号分两个阶段增强。两阶段的荧光信号强度与Pax-a基因浓度的对数具有良好的线性关系，当荧光信号为5000-7000 a.u.时，线性方程为y=910.06lg(x)+6674.3，R

图4考虑到实用性的要求，考察该方法对特定目标物的特异性和选择性，选择以单碱基错配序列（MT1），三碱基错配序列（MT2），五碱基错配序列（MT3）和完全错配序列（CMT）作为干扰物对传感系统的影响。实验结果证实该传感系统对不同的干扰组分响应较低或基本没有响应，对特定目标物响应明显，说明其具有良好的选择性和特异性（图4）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。