急性白血病MLL基因重排的检测及临床特点研究以及基因断裂融合检测新方法初探

摘要

目的： 1.研究急性白血病(acute leukemia，AL)中混合谱系白血病(mixed lineage leukemia.MLL)基因重排的多重巢式(multiplex nested)RT-PCR方法检测，并探讨其生物学和临床特点。 2.研究AL中MLL基因重排在监测微小残留病(minimal residual disease，MRD)中的作用和意义。 3.建立一种检测RAR0c、AML1及MLL等基因断裂融合的新的筛选方法。 方法： 1.MLL基因重排的检测 1.1 对171例AML和76例ALL患者用Multiplex Nested RT-PCR方法进行MLL基因重排的检测，选取转录因子E2A作为内对照同步进行转录和扩增。检测的MLL基因重排包括MLUA/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/FL、LMLL/ENL、MLL/AFX1、MLL/IP、MLL/1Q和MLL-PTD等11种。 1.2 流式细胞技术采用活细胞三色荧光标记检测的免疫表型。 1.3 对部分AL患者作染色体核型分析。 2.B/C比值法的建立 2.1 B区和C区引物设计在正常RARα、AML1和MLL的cDNA模板上，分别针对RARer、和MLL基因的断裂点区B区(Breakpoints region)设计引物，上游引物和下游引物分别位于断裂点区两端，并在非断裂位点区C区(Control region)作为内对照，分别设计引物C1和C2。 2.2 最佳线性循环扩增数的确定取正常对照cDNA，分别用RARα、AML1和MLL基因的B区和C区引物，根据各自的反应条件进行扩增，循环数依次为26、28、30、32、34、36。然后取扩增产物电泳，记录条带灰度值，并做出线性扩增曲线，确定最佳线性循环数。 2.3 确定反应所需的骨髓原始细胞最低比例NB4细胞系(PMIURARα阳性)和K562细胞系(PML/RARα阴性)按一定比例混合(NB4细胞占细胞总数的O％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)共形成11组混合细胞，提取RNA后以RARα基因的扩增条件和循环数进行RT-PCR，从细胞系水平确定反应所需的最低原始细胞比例。 选取骨髓原始细胞比例为96.4％的PML/RARct融合基因阳性标本，按15％、30％、45％、60％、75％、90％原始细胞比例与正常对照混合，分别测定B/C值，从病例水平确定B/C比值法要求的入选标本最低原始细胞比例。 2.4 B/C比值法准确性验证选取30例已知PML/RARα阳性标本和正常对照各30例以B/C比值法检测，计算B/C值，进行统计学分析； 常规RT-PCR方法检测PML/RARα、AML1/ETO融合基因和MLL基因重排阳性者，分别作B/C比值法检测，计算B/C值，与正常对照比较。 结论： 1.多重RT-PCR是临床检测MLL基因重排较为精确和灵敏的方法。 2.在AML中MLL基因重排是FAB亚型M4和M5常见的基因改变，多见于WBC增高患者；ALL中MLL基因重排以MLL/AF4为主，多见于pro-B ALL。MLL基因重排的急性白血病AL患者CR率与阴性者无明显差异，但预后较差。 3.MLL基因重排可作为MRD的监测指标，在AL判断复发和治疗方案的个体化选择及预后方面有重要意义。 4.B/C比值法是一种创新性的方法。实质是一种半定量.PCR方法，是一种有效的判断RARα、AML1和MLL基因断裂融合的方法，可作为临床患者常规RARα、AML1和MLL融合基因检测的补充方法，对涉及RARα、AML1和MLL基因的融合断裂进行初筛。断裂位点恒定的其它基因断裂融合也可设计应用该方法进行检测。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

第一部分急性髓性白血病MLL基因重排的检测及其临床和生物学特点研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分应用多重巢式PT-PCR检测急性淋巴细胞白血病MLL基因重排及其临床特点研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分检测RARα、AML1、MLL基因断裂融合的新方法初探

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

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