一种核酸提取纯化系统及利用其提取纯化核酸的方法

摘要

本发明涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种核酸提取纯化系统及利用其提取纯化核酸的方法。本发明的核酸提取纯化系统包括：试剂储存袋P1～P4、控制转动阀V1～V2、样品混合槽，装有硅胶膜的核酸分离室，预装干燥试剂的PCR室、加热器和低温加热器。第一阶段硅胶微粒子与DNA第一次结合，第二阶段硅胶膜二次吸付，增加低浓度核酸检测率，也提高样品纯化核酸浓度。以微流道装置取代离心机，与磁力系统，以压力动力使流动达成冲洗杂质，之后结合快速温度干燥，最后再一次压力冲提达成纯化，直接一机完成不需要多机操作。本发明提供一种易于使用、自动化、便携式的核酸萃取系统，无需离心机与磁力系统，可以直接使用人体样本。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种核酸提取纯化系统及利用其提取纯化核酸的方法。

背景技术

核酸(NA)分子诊断是高度特异和灵敏的检测方法，可检测生物样品中靶标特异性DNA或RNA序列的存在与否。然而，为了获得快速准确的结果，这些检测通常需要不含污染物的纯DNA样品。因此，核酸提取(NAE)是分子生物学中最关键的步骤之一，是任何分子诊断学的起点。有许多基于溶液和固相的核酸提取方法，苯酚-氯彷和碱提取(Phenol-Chloroformand alkaline extraction)是两种常用的实验室酿造方法，分别用于从真核细胞中提取基因组DNA和从大肠杆菌中提取质粒。商业试剂盒倾向于采用固相萃取(solid-phaseextraction)，通过应用使用二氧化硅、硼硅玻璃(silica，borosilicate glass)或特定表面化学物质等材料，固相萃取法中基于离心柱的核酸萃取纯化(Spin column-basednucleic acid purification)与磁珠萃取(magnetic bead extraction)是现在诊断市场中最被使用的两大方法。

两大方法学具体概念相似，以离心柱的核酸萃取纯化为例，该方法的阶段是裂解、结合、洗涤和洗脱。需要裂解靶细胞以释放核酸，选择性地将核酸结合到硅胶膜上，洗掉未结合到硅胶膜上的微粒和抑制剂，并洗脱核酸，最终结果是在水溶液中纯化的核酸。

但离心柱的核酸纯化需要有离心机，而磁珠萃取也需要配合的磁力机台流程，所以目前现在技术所存在的第一个缺点是：商业化即时诊断(POC)试剂盒通常采用单独的上游核酸纯化系统，也就是必须于医学中心实验室中单独进行。仍然需要在核酸萃取技术上有所进展，才有可能将实验室环境可达成的固相萃取核酸方法带入即时诊断(POC-Dx)的“现实世界”。第二个缺点是：使用固相萃取柱从溶液中分离核酸，使用洗脱缓冲液进行回收，并通过分子测试进行定量以进行诊断。这种方法有两个固有的损失机制。首先，DNA吸附到柱上可能造成效率低下，其次，纯化的DNA可能无法有效地从柱上洗脱。所以目前固相萃取常用的二氧化硅在控制低浓度NA吸附和洗脱的机制效率尚不好。其中使用硅胶制成的固相萃取柱从粗样品中提取和纯化DNA和RNA为了提高用于小体积生物样本的微型POC装置的核酸灵敏度和特异性，必须设计一套试剂和提取方案，以最大限度地提高核酸保留和从硅胶柱中的洗脱。第三个缺点是：现行试着将萃取连接到微流道系统装置都会遇到在样本输入设备中后，在微流道进行时，洗脱流速可能会有很大差异，取决于微通道截面和基体组成，从更高的速率500μL/min到1μL/min的较慢速度洗脱数量是一个关键问题；虽然体积减小是一个优势，但流速不稳少量NA可能很麻烦。为了克服这个问题，最终洗脱液的过度稀释步骤需要配方考虑调整。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种核酸提取纯化系统及利用其提取纯化核酸的方法。

本发明提供一种微流道卡匣的装制系统结合一套试剂和萃取流程，且以压力气体动力纯化方法，达成高效率低浓度样品萃取，且无需连接额外系統装制。

目前，核酸提取是使用离心管柱或磁力完成的，基于苯酚-氯彷的方法和基于过滤的方法。在这些方法中，商业离心柱套件含硅胶膜已广泛应用于临床应用。在硅胶基固相萃取中方法，核酸可以在高压下结合到二氧化硅表面离液盐条件，可以在低盐下分离，尽管离心柱方法提供了DNA的高产量和高纯度，它需要一个台式离心机以极高的离心力运行，并且工作流程不一致，使用各种溶剂或干燥残留在硅胶内的洗涤试剂需要膜。此外，该方法涉及手动处理，例如频繁将样品转移到其他管和移除和更换离心柱。这些步骤增加了程序的复杂性和风险交叉污染，需要熟练的操作员，价格昂贵，并延长时间。

硅胶基质的纯化原理基于带负电的DNA分子对带正电的硅胶颗粒的高亲和力。在高盐条件下，DNA紧密结合，大量洗涤可去除所有污染物，纯化的DNA分子可在低离子强度下洗脱。本发明将第一步初步萃取于拭子放置同时完成，将液体滴入萃取槽后就开始自动化卡匣的运作，萃取槽的微量涂层使用微型硅胶微粒子己开始做第一次结合，当开始阀门流动后，第二次结合将在硅胶膜再次结合，之后的洗脱杂质皆以压力流动通过，且用加热器做干燥取代离心机。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种核酸提取纯化系统，所述核酸提取纯化系统包括：试剂储存袋P1～P4、控制转动阀V1～V2、样品混合槽，装有硅胶膜的核酸分离室，预装干燥试剂的PCR室、加热器和低温加热器。

本发明同时提供一种利用所述核酸提取纯化系统提取纯化核酸的方法。

作为本发明所述提取纯化核酸的方法的优选实施方式，所述方法包括以下步骤：

S1.将待测样本置于萃取溶液中在pH 8、室温下孵育；

S2.将裂解完成的萃取溶液滴入样品混合槽中，所述样品混合槽底部含有微量微硅胶微粒子；

S3.初始状态下，阀门V1处于关闭状态，试剂储存袋P1压缩使结合缓冲液进入样品混合槽，与样本混合；

S4.在样品混合槽中孵育，在高盐与低pH环境下，微量核酸与硅胶膜粒子结合，阀门V1打开，阀门V2转向回收槽，使裂解液借助微型真空泵强制流过硅胶膜，同时核酸与硅胶膜第二次结合，而其他裂解物成分流动通过硅胶膜到达回收槽；

S5.试剂储存袋P2压缩，将去除抑制剂苯酚-氯彷通过硅胶膜，将其他裂解物成分流动通过硅胶膜到达回收槽；

S6.试剂储存袋P3压缩，将75％乙醇清洗溶液通过硅胶膜到达回收槽；

S7.打开加热器，用加热空气干燥膜真空泵去除残留的挥发性污染物，然后阀门V2转向PCR反应槽流道，试剂储存袋P4压缩，排出洗脱缓冲液通过硅胶膜解吸结合的核酸，洗脱的核酸被转移到PCR室。

本发明利用第一次萃取液配方达成快速降解，进入样品混合槽后再与第二次缓冲液配方混合及中和，达到降低pH值，且停留在高盐状态下，让与微量涂层在第一反应槽的硅胶微粒子可以高效率结合。第一硅胶微粒子结合再经过第二段硅胶薄膜过滤，达成降低核酸浓度的检体应用。

作为本发明所述提取纯化核酸的方法的优选实施方式，步骤S1所述萃取溶液包括5M硫氰酸胍、40mM二硫苏糖醇、20mg/mL糖原、1％Triton X-100和25mM柠檬酸钠。

本发明样本在此缓冲溶液pH 8中室温下孵育到裂解完成只需要1分钟，可达到快速裂解的目的。

作为本发明所述提取纯化核酸的方法的优选实施方式，步骤S3所述结合缓冲液pH5.2，包含225mM醋酸钠及5M硫氰酸胍。

本发明再结合第二阶段混合体系pH 5.2，含225mM醋酸钠及5M硫氰酸胍，因为将酸碱度降低且维持高盐量，此比例提高与硅胶膜结合效率。第一阶段硅胶微粒子与DNA第一次结合，第二阶段硅胶膜二次吸付，增加低浓度核酸检测率，也提高样品纯化核酸浓度。以微流道装置取代离心机，与磁力系统，以压力动力使流动达成冲洗杂质，之后结合快速温度干燥，最后再一次压力冲提达成纯化，直接一机完成不需要多机操作。

作为本发明所述提取纯化核酸的方法的优选实施方式，步骤S1所述待测样品为鼻咽拭子或病毒培养液。

作为本发明所述提取纯化核酸的方法的优选实施方式，步骤S7所述洗脱缓冲液包括低摩尔浓度Tris缓冲液或无核酸酶水。

本发明搭配3次预装入每个试剂室洗脱冲洗液(600μL ACW1、750μLACW2、750μL乙醇)，并且在最后阶段本发明加入100μL矿物油(330760；Sigma-Aldrich，美国)，提高硅胶膜结合核酸的冲提效能。从硅胶基质上洗脱DNA通过低渗溶液进行，通常是低盐缓冲液或洗脱缓冲液，一般呈碱性。常见的NA洗脱包括流动的pH＝8TE缓冲液(Tris EDTA)。壳聚糖具有阳离子电荷，在pH＝8.5/9时很容易被中和，所以，本发明使用pH＝9TrisKCl从该基质中洗脱NA。较高的pH值会产生更浓缩的提取物。

作为本发明所述提取纯化核酸的方法的优选实施方式，步骤S7所述加热空气的温度为60～70℃，优选地，为65℃。

本发明以微流道装置配合预先注入的3重试剂，以压力动力使流动达成冲洗杂质，最后改以65℃烘干硅胶膜，达成取代离心机的操作，以较高的pH值产生更浓缩的提取物取代传统使用水的沖提。

本发明的有益效果：

本发明提供一种易于使用、自动化、便携式的核酸萃取系统，无需离心机与磁力系统，可以直接使用人体样本。预先涂层的微硅胶微粒子提高核酸接合效率，且终成纯化的核酸产物可以直接入pcr反应槽。

附图说明

图1为用于核酸提取纯化的卡匣设计图。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

即时诊断(POC)试剂盒通常采用单独的上游NA纯化系统，也就是必须于医学中心实验室中单独进行的NA纯化系统，简化成可以于检测卡匣中成一体系的完成，克服传统需要使用离心机或真空帮浦或磁力系统来达成，改以流道设计达成目标，本发明提供一种新型快速萃取分离NA，效率、性价比高的、适用于不同来源的检体。

目前固相萃取常用的二氧化硅在控制低浓度NA吸附和洗脱的机制效率尚不好，为了提高用于小体积生物样本的微型POC装置的NA灵敏度和特异性，本发明设计了一套试剂和提取方案，以最大限度地提高NA保留和从硅胶柱中的洗脱。本发明还包括提供此NA萃取与高回收率的产品配方。

实施例1用于核酸提取纯化的卡匣设计

图1示意性地描绘了卡匣。本实施例只单纯描述萃取核酸与纯化动作，卡匣由多种功能部件组成，包括试剂储存袋(P1～P4)、控制转动阀(V1～V2)、样品混合室，装有硅胶膜的核酸分离室，预装干燥试剂的PCR室和用于检测(RT-)PCR产物。另外还包括加热器与低温加热器。

实施例2核酸提取纯化方法

1、将鼻咽拭子(或取200μl样品如病毒培养液等)于2ml萃取管中，管中己含有本发明设计的400μl萃取溶液(5M硫氰酸胍、40mM二硫苏糖醇、20mg/mL糖原、1％Triton X-100，25mM柠檬酸钠)，拭子在此缓冲溶液pH 8中室温下孵育到裂解完成只需要1分钟。

2、将拭子去除后，将萃取管盖上滴管头，然后将卡匣样品混合槽密封膜撕开，此萃取溶液滴入8滴于样品混合槽中。此样品混合槽己含有微量微硅胶微粒子(silica beads)于底部(Davisil 643，Sigma-Aldrich，USA)。

3、初始状态下，阀门V1(图1)是关闭的。试剂储存袋P1的压缩，将含有结合缓冲液pH 5.2，含225mM醋酸钠及5M硫氰酸胍进入样品混合反应槽，在那里它与样本混合。

4、在样品混合槽孵育步骤之后，此时因为高盐与低pH环境下，微量核酸与硅胶膜粒子结合，阀门V1打开，阀门V2转向回收槽。裂解液是强制流过硅胶膜(Roche AppliedScience，德国)借助微型真空泵(Hargraves Technology Corp.，Mooresville，NC 28117美国)。而同时第二次核酸与硅胶膜结合，而其他裂解物成分流动通过膜到达盒的回收槽。

5、试剂储存袋P2的压缩，将去除抑制剂苯酚-氯彷通过硅胶膜，将其他裂解物成分流动通过膜到达盒的回收槽。

6、接着试剂储存袋P3的压缩，将75％乙醇清洗溶液通过硅胶膜，通过膜到达盒的回收槽，溶液从膜上冲走任何不需要的矿物盐、酶、蛋白质和其他小分子。

7、接下来，打开加热器(图1)，并用由驱动器驱动的加热空气干燥膜真空泵去除残留的挥发性污染物，这些污染物可能会抑制后续扩增反应。然后阀门V2转向PCR反应槽流道，试剂储存袋P4的压缩，排出洗脱缓冲液(低摩尔浓度Tris缓冲液或无核酸酶水)通过膜解吸结合的核酸。洗脱的核酸被转移到PCR室并填满房间，完成纯化微量核酸。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。