一种广州管圆线虫病诊断生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于广州管圆线虫病诊断的生物标志物。本发明基于代谢组学，通过构建小鼠广州管圆线虫病模型，利用超高效液相色谱‑串联质谱技术对小鼠血清和/或粪便上清液中进行定量，发现并分析正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异胆汁酸，所述胆汁酸为脱氧胆酸和/或牛磺熊脱氧胆酸。其中，脱氧胆酸标志物的灵敏度为0.9，特异度为1，曲线下面积(AUC)为0.99；牛磺熊脱氧胆酸标志物的灵敏度和特异度均为0.9，曲线下面积(AUC)为0.96，这些指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病的诊断。可以通过检测受试者血清中脱氧胆酸和/或粪便上清液中牛磺熊脱氧胆酸的浓度来判断受试者是否感染广州管圆线虫病。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及一种广州管圆线虫病诊断生物标志物及其应用。

背景技术

广州管圆线虫病是人畜共患的寄生虫病，因生食或半生食含广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)Ⅲ期幼虫的中间宿主、转续宿主或被Ⅲ期幼虫污染的食物而感染。广州管圆线虫是严重危害人体健康的食源性寄生虫，其中间宿主包括褐云玛瑙螺、福寿螺、蜗牛和蛞蝓等软体动物，转续宿主包括蟾蜍、蛙、鱼、虾和蟹等，大鼠是其适宜宿主，而小鼠和人类均为非适宜宿主。广州管圆线虫Ⅲ期幼虫主要侵犯人体中枢神经系统，表现为嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎，以脑脊液中嗜酸性粒细胞显著升高为特征。在诊断治疗及时的情况下，绝大多数病人愈后良好，极个别感染虫体数量多者，病情严重可致死亡，或留有后遗症。

目前对于广州管圆线虫病的预防，主要是不吃生或半生的螺类或鱼类，不吃生菜，不喝生水；还应防止在加工螺类的过程中受感染。而对于广州管圆线虫病的诊断有以下几种方式：(1)血象检查：嗜酸性粒细胞增多，占0.08～0.37，常多于0.15。白细胞总数可无异常，但以轻度升高为多，常超过10×10

如现有技术CN 113376288A公开了一种广州管圆线虫病早期诊断血清生物标志物及筛选方法和应用，基于代谢组学对感染广州管圆线虫病血清进行分析，筛选出脂酰胆碱和/或溶血磷脂酰胆碱可作为广州管圆线虫病早期诊断生物标志物；但是，目前仅有脂酰胆碱和/或溶血磷脂酰胆碱可用于广州管圆线虫病的早期诊断，还是缺乏能用于广州管圆线虫病早期诊断和检测的新方法或手段，还需要研究和开发出更多的能用于广州管圆线虫病相关或类似疾病诊断的生物标志物，能够及时诊断广州管圆线虫病并用于生产应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种用于广州管圆线虫病诊断的生物标志物。

本发明的第一个目的是提供一种用于广州管圆线虫病诊断生物标志物。

本发明的第二个目的是所述生物标志物的应用。

本发明的第三个目的是提供一种广州管圆线虫病诊断产品。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明基于代谢组学，研究分析正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异胆汁酸，最终获得基于代谢组学的广州管圆线虫病诊断血清生物标志物-脱氧胆酸和/或粪便上清液生物标志物-牛磺熊脱氧胆酸；通过分析评估生物标志物的诊断能力，脱氧胆酸标志物的灵敏度为0.9，特异度为1，曲线下面积(AUC)为0.99；牛磺熊脱氧胆酸标志物的灵敏度和特异度均为0.9，曲线下面积(AUC)为0.96，表明这些指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病的诊断。

本发明提供一种用于广州管圆线虫病诊断的生物标志物，所述生物标志物为胆汁酸。

优选地，所述胆汁酸为脱氧胆酸和/或牛磺熊脱氧胆酸。

本发明提供所述生物标志物脱氧胆酸和/或牛磺熊脱氧胆酸在制备广州管圆线虫病诊断产品、在制备和/或筛选防治广州管圆线虫病药物中的应用。

本发明提供一种广州管圆线虫病诊断产品，包含检测受试者血清中脱氧胆酸和/或粪便上清液中牛磺熊脱氧胆酸浓度的试剂。

进一步地，通过检测受试者血清中脱氧胆酸和/或粪便上清液中牛磺熊脱氧胆酸的浓度来判断受试者是否感染广州管圆线虫病。

优选地，还包含对受试者血清和/或粪便进行前处理的试剂。

优选地，还包含广州管圆线虫病的阳性对照品。

优选地，还包含对脱氧胆酸和/或牛磺熊脱氧胆酸进行超高效液相色谱-串联质谱法分析的试剂。

本发明提供用于广州管圆线虫病诊断的生物标志物的定量方法，先构建小鼠广州管圆线虫病模型，利用超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠血清和/或粪便上清液中的胆汁酸进行定量，发现并分析正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异胆汁酸，即为广州管圆线虫病诊断生物标志物。

优选地，所述超高效液相色谱-串联质谱技术采用色谱柱为：ACQUITY UPLC BEHC18(150×2.1mm，1.7μm)；液相色谱条件：流动相：A相为1mmol/L的乙酸铵和0.1％的乙酸水溶液，B相为乙腈；柱温：50℃；进样量：1.000μL。

优选地，所述质谱条件为：使用Q Exactive HFX高分辨质谱仪，以平行反应监测模式进行质谱分析。

优选地，离子源参数如下：喷雾电压为+3500/-3100V，鞘气流量为40L/min，辅助气流量为15L/min，吹扫气流量为0L/min，辅助气温度为350℃，毛细管温度为320℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种用于广州管圆线虫病诊断的生物标志物。本发明基于代谢组学，通过构建小鼠广州管圆线虫病模型，利用超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠血清和/或粪便上清液中的胆汁酸进行定量，发现并分析正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异胆汁酸，即为广州管圆线虫病诊断生物标志物脱氧胆酸和/或牛磺熊脱氧胆酸。通过分析评估生物标志物的诊断能力，脱氧胆酸标志物的灵敏度为0.9，特异度为1，曲线下面积(AUC)为0.99；牛磺熊脱氧胆酸标志物的灵敏度和特异度均为0.9，曲线下面积(AUC)为0.96，表明这些指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病的诊断。

本发明可以通过检测受试者血清中脱氧胆酸和/或粪便上清液中牛磺熊脱氧胆酸的浓度来判断受试者是否感染广州管圆线虫病，能够将脱氧胆酸和/或牛磺熊脱氧胆酸开发成为防治广州管圆线虫病药物或广州管圆线虫病诊断产品应用于生产。

附图说明

图1为两个实验组血清胆汁酸代谢谱的PCA得分图(A)及OPLS-DA得分图(B)；

图2为脱氧胆酸在两个实验组血清样本中的浓度(A)及对应的ROC曲线(B)；

图3为两个实验组粪便上清液胆汁酸代谢谱的PCA得分图(A)及OPLS-DA得分图(B)；

图4为牛磺熊脱氧胆酸在两个实验组粪便上清液样本中的浓度(A)及对应的ROC曲线(B)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

健康SPF级6-8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，含广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的光滑双脐螺来自本实验室。

实施例1广州管圆线虫感染小鼠的代谢组学样本制备

1.广州管圆线虫感染小鼠模型建立

将健康SPF级6-8周龄BALB/c的小鼠随机分为两组，每组10只小鼠，分为广州管圆线虫感染21天组(感染组)和正常对照21天组，其中，正常对照组不做任何处理，感染组小鼠按以下方法进行感染：将含广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的光滑双脐螺压碎，剥离外壳，将螺肉置于加有消化液的EP管内剪碎，于37℃培养箱内消化40min，消化完毕后将消化液倒入培养皿内，加入适量PBS终止消化，在体视镜下用移液枪吸取并计数广州管圆线虫Ⅲ期幼虫，通过人工灌胃方法感染小鼠，每只感染30条。

2.样本收集及前处理

(1)粪便样本：使用代谢笼收集两个实验组小鼠粪便样本，于-80℃分装冻存。采用超高效液相色谱-串联质谱法分析粪便样本前，将25mg粪便样本于4℃解冻，加入1mL提取液(甲醇：乙腈：水＝2：2：1，含0.1％甲酸)，涡旋混匀后加入钢珠，研磨处理4min后冰水浴超声5min，如此重复3次后-40℃静置1h，然后在4℃下12000rpm离心15min，取上清液加入内衬管，用于胆汁酸高通量靶标定量分析。同时，准确称取相应量的标准品(41种胆汁酸)于10mL容量瓶中，分别配制成10mmol/L的标准品储备液。取相应量的各种标准品储备液于10mL容量瓶中，配制成混合标准溶液。依次稀释该标准溶液得到一系列校准溶液，加入内衬管，用于胆汁酸高通量靶标定量分析。

(2)血清样本：对两个实验组小鼠分别进行麻醉，颈椎脱臼处死，眼底静脉丛取血，待血液凝固后，3000g离心10min收集上清液为血清样本，-80℃分装冻存。采用超高效液相色谱-串联质谱法分析血清样本前，将50μL血清样本于4℃解冻，加入200μL提取液(甲醇：乙腈＝1：1，含0.1％甲酸)，涡旋混匀后于冰水浴超声10min，-40℃静置1h，然后4℃下12000rpm离心15min，取上清液加入内衬管，用于胆汁酸高通量靶标定量分析。标准溶液的配制同粪便样本。

实施例2广州管圆线虫感染小鼠血清或粪便中胆汁酸高通量靶标定量分析

对上述实施例1中所得的20个血清样本及20个粪便样本进行胆汁酸高通量靶标定量分析，采用仪器设备为：液相色谱：Vanquish，质谱：Q Exactive HFX，色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18(150×2.1mm，1.7μm)，具体分析条件如下：

(1)液相色谱条件：

流动相：A相为1mmol/L的乙酸铵和0.1％的乙酸水溶液，B相为乙腈；

柱温：50℃；进样量：1.000μL；

(2)质谱条件：

使用Q Exactive HFX高分辨质谱仪，以平行反应监测模式进行质谱分析。离子源参数如下：喷雾电压为+3500/-3100V，鞘气流量为40L/min，辅助气流量为15L/min，吹扫气流量为0L/min，辅助气温度为350℃，毛细管温度为320℃。

使用超高效液相色谱-串联质谱法检测供试品溶液及校准溶液，获得两个实验组小鼠各样本中各目标化合物的浓度。

实施例3广州管圆线虫感染小鼠血清或粪便中特征性差异胆汁酸分析

对上述实施例2中所得的小鼠血清与粪便中胆汁酸高通量靶标定量结果进行分析。

1.原始数据预处理

为了更好地分析数据，对原始数据进行一系列的准备和整理，主要包括：对单个峰进行过滤，对原始数据中的缺失值进行模拟，经过预处理后40个峰被保留。

2.多元统计分析

在获得整理好的数据之后，对其进行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。

具体结果显示，图1A为感染组小鼠与对照组小鼠在21天时血清胆汁酸代谢谱的PCA得分图；图1B表示感染组小鼠与对照组小鼠在21天时血清胆汁酸代谢谱的OPLS-DA得分图。由图1A和图1B的得分图可以看出，感染组与对照组的血清样本均可完全区分，提示感染小鼠与对照小鼠的胆汁酸含量存在明显差异，模型的稳定性和预测能力均良好。

图3A为感染组小鼠与对照组小鼠在21天时粪便上清液胆汁酸代谢谱的PCA得分图；图3B为感染组小鼠与对照组小鼠在21天时粪便上清液胆汁酸代谢谱的OPLS-DA得分图。由图3A和图3B的得分图可以看出，感染组与对照组的粪便上清液样本均可完全区分，提示感染小鼠与对照小鼠的胆汁酸含量存在明显差异，模型的稳定性和预测能力均良好。

3.单变量统计分析

通过t检验对两组间的胆汁酸水平进行统计学分析，p<0.05表明差异有统计学意义。当投影中的变量重要性(VIP)>1，p<0.05时，被认为是差异胆汁酸。最后，使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析评估生物标志物的诊断能力。

结果如图2A所示，感染组小鼠血清中脱氧胆酸的浓度(384.01±81.58nmol/L)显著高于对照组小鼠(88.51±5.56nmol/L，p<0.01)。使用脱氧胆酸作为区分小鼠感染与未感染广州管圆线虫的指标时，其灵敏度为0.9，特异度为1，曲线下面积(AUC)为0.99，如图2B所示，表明这个指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病的诊断。

结果如图4A所示，感染组小鼠粪便上清液中牛磺熊脱氧胆酸的浓度(388.18±62.08nmol/kg)与对照组小鼠(1555.01±282.05nmol/kg)相比明显下降(p<0.001)。使用牛磺熊脱氧胆酸作为区分小鼠感染与未感染广州管圆线虫的指标时，其灵敏度和特异度均为0.9，曲线下面积(AUC)为0.96，如图4B所示，表明这个指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病的诊断。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。