一种多糖化合物在预防和治疗呼吸道病毒感染药物中的应用

摘要

本发明公开了一种多糖化合物在预防和治疗呼吸道病毒感染药物中的应用，通过构建MDCK、A549两种流感病毒感染细胞模型及MDCK犬冠状病毒感染模型，使用五味子多糖对细胞模型进行治疗处理，结果显示五味子多糖在细胞水平上可显著抑制流感病毒、犬冠状病毒对细胞的损伤。其次，小鼠的体内实验证明，对小鼠接种流感病毒后，采用五味子多糖对小鼠进行连续治疗处理，结果显示五味子多糖可降低小鼠肺部病毒载量，对小鼠肺部具有一定保护作用，且可以延长小鼠存活时间。表明五味子多糖可用于流感病毒等呼吸道感染的预防和治疗，拓展了五味子多糖的功效范围，为预防或治疗呼吸道病毒感染的药物研发提供了新的方向。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多糖化合物，尤其涉及一种多糖化合物在预防和治疗呼吸道病毒感染药物中的应用。

背景技术

流感病毒(Influenza Avian virus，IAV)属正粘病毒科，是单股负链分段的RNA病毒，是一种人畜共患病原体，宿主范围广，能够突破种间屏障，感染多种禽类及哺乳动物。流感病毒可分为甲乙丙丁四个亚型，其中甲型流感病毒致病性最强，变异程度最高，可感染多种动物，包括人类、鸟类、猪、马、猫和许多其他动物，并与季节性流行病和大流行有关，最难防控，例如1918年秋季在全球大量爆发的西班牙流感(H1N1)，至1920年春季，在全世界造成约10亿人感染，导致了全球2000万至4000万人死亡； 1957-1958年间由流感病毒(H2N2)引起的流感引起全球约100万人丧生。

从2017年12月份以来，我国各地流感大爆发，我国南北方都进入了流感高发期，流感病例高于过去3年同期水平，呈持续上升趋势。主要易感人群是婴幼儿、免疫力低下的人群。因此，如何有效的防控流感已成为人类健康及世界各国政府现阶段所面临的首要全球公共卫生问题。

近年来，病毒在物种之间频繁的跨种传播给人类社会公共卫生安全带来了巨大威胁。其中最为典型的是2019年的SARS-COV-2与2020年的 H5N8。目前流感病毒的防控以疫苗和药物治疗为主，然而疫苗对流感病毒的高变异性防控能力有限，因此药物治疗成为防控流感病毒的有力手段。现有有效的抗流感病毒药物主要以M2离子通道阻断剂金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)及病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir，又称奥赛米韦，商品名为Tamiflu即达菲)、扎纳米韦(zanamivir，商品名为Relenza即瑞乐砂)，为主，金刚烷通过阻断离子通道，抑制子代病毒释放来抑制流感病毒，达到抗病毒作用，但是其毒副作用较大，会引起严重胃肠道不良反应，且大部分流感病毒分离株均已产生了耐药性。神经氨酸酶抑制剂类药物可通过抑制病毒RNA聚合酶活性，阻止病毒RNA的合成，来抵抗流感病毒对宿主的感染，其副作用较小，但近年流行病学调查结果显示，不同国家和地区流感病毒分离株对奥赛米韦等神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药率也高达12.8％～75.0％。因此，对于新型抗流感病毒药物的筛选与鉴定显得极为重要。

五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，是中国传统医学中的一种特效药，现代药理学研究表明，五味子及其化学成分具有多种生物活性，包括止咳、抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗抑郁、抗高泌乳素血症、降血脂、抑制血管病变、保护血管内皮、改善糖尿病及其并发症、保肝等作用。在临床上五味子还常用于治疗肝肾虚损或阳虚。此外其还被开发成为治疗头晕、失眠、盗汗等神经衰弱性疾病的保健品或中药复方制剂。

五味子主要活性成分包括多糖类、木脂素类、多酚类、有机酸类和挥发油类等多种化学成分，其中多糖类、木脂素类、多酚类成分含量较高，这三类物质在五味子发挥抗炎、抗氧化等功效中承担重要作用。特别是五味子中糖含量最高可达67.6％，周卫东等研究发现五味子多糖治疗后小鼠的肠道黏膜炎症有所恢复，可以对抗肠道炎症，影响多种炎症因子水平。五味子多糖还可促进小鼠肠道内分泌型免疫球蛋白A的分泌，促进免疫细胞的活性。另有研究证明在免疫功能低下的小鼠模型中，五味子中总木脂素及粗多糖能够调节免疫因子γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)的水平，增强巨噬细胞的吞噬功能，进而增强机体的免疫功能。五味子多糖在抗炎、增强机体免疫功能等药理作用方面的研究已经较为广泛，而对于其抗病毒作用一直以来少有研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一是提供了五味子多糖的一种新用途。具体为多糖化合物在预防和治疗呼吸道病毒感染药物中的应用，其中，所述多糖化合物为五味子多糖提取物或其衍生物。

进一步的，所述药物为五味子多糖提取物或其衍生物的药学上可接受的盐或溶剂化物或水合物。

进一步地，所述五味子多糖提取物的提取方法为：将五味子利用沸水煮提2次，提取液经75％乙醇沉淀得到总多糖；将总多糖利用DEAE-纤维素离子交换柱层析分级，得到中性糖和酸性糖组分；将酸性糖进一步利用DEAE- 纤维素离子交换柱层析分级，依次经0.1M氯化钠、0.2M氯化钠和0.3M氯化钠洗脱，得到三个组分WSCPA-1、WSCPA-2和WSCPA-3；将WSCPA-2利用凝胶柱层析分级，得到WSCPA-2a级分多糖即为五味子多糖提取物。

进一步地，所述呼吸道病毒为流感病毒或冠状病毒。

进一步地，所述流感病毒包括H1N1、H3N2亚型流感病毒。

进一步地，所述冠状病毒为犬冠状病毒。

本发明的目的之二是提供一种预防和治疗呼吸道病毒感染的药物，包括五味子多糖提取物或其衍生物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物或其水合物。

进一步地，所述呼吸道病毒为流感病毒或冠状病毒。

进一步地，所述呼吸道病毒为H1N1、H3N2亚型流感病毒或犬冠状病毒。

进一步地，所述五味子多糖提取物的提取方法为：将五味子利用沸水煮提2次，提取液经75％乙醇沉淀得到总多糖；将总多糖利用DEAE-纤维素离子交换柱层析分级，得到中性糖和酸性糖组分；将酸性糖进一步利用DEAE- 纤维素离子交换柱层析分级，依次经0.1M氯化钠、0.2M氯化钠和0.3M氯化钠洗脱，得到三个组分WSCPA-1、WSCPA-2和WSCPA-3；将WSCPA-2利用凝胶柱层析分级，得到WSCPA-2a级分多糖即为五味子多糖提取物。

与现有技术相比，本发明的技术效果：

本发明提供了五味子多糖的一种新用途，具体是在抗呼吸道病毒感染药物方面的应用，拓宽了五味子多糖的功效范围，证实其在细胞水平上能够抑制流感病毒与冠状病毒的复制；数据显示，五味子多糖对流感病毒、冠状病毒具有一定的抑制作用。此外，五味子多糖作为一种中药提取物，天然、高效并且毒副作用小；通过小鼠的体内实验证明，对小鼠接种流感病毒后，采用五味子多糖对小鼠进行连续治疗处理，结果显示五味子多糖可降低小鼠肺部病毒载量，对小鼠肺部具有一定保护作用，且可以延长小鼠存活时间。表明五味子多糖可用于流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒感染的预防和治疗。拓展了五味子多糖的功效范围，为预防或治疗流感病毒等呼吸道感染的药物研发提供了新的方向。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的五味子多糖对MDCK的细胞毒性图。

图2为本发明实施例1提供的五味子多糖对A549的细胞毒性图。

图3为本发明实施例1提供的五味子多糖对F81的细胞毒性图。

图4为本发明实施例2提供的五味子多糖在MDCK细胞上对H1N1-UI182 亚型流感病毒的抑制作用图。

图5为本发明实施例2提供的五味子多糖在A549细胞上对H3N2亚型流感病毒的抑制作用图。

图6为本发明实施例3提供的五味子多糖在MDCK细胞上对犬冠状病毒的抑制作用图。

图7为本发明实施例4提供的五味子多糖在F81细胞上对伪狂犬病毒的抑制作用图。

图8为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠后，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，在接毒后3天测定不同组别的小鼠肺部病毒滴度并作图。

图9为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠后，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，在接毒后5天测定不同组别的小鼠肺部病毒滴度并作图。

图10为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠后，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，对治疗期间小鼠的存活率进行记录并作图。

图11为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠后，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，对治疗期间小鼠的体重变化进行记录并作图。

图12为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠后，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，对治疗后5d小鼠的肺部形态进行记录并作图。

图13为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，治疗后3d取不同组别的小鼠，对其肺部切片后进行HE染色。

图14为本发明实施例5提供的五味子多糖在体内对H1N1-UI182的抑制作用，用流感病毒H1N1-UI182接种于小鼠，分别采用腹腔注射和灌胃两种方式对小鼠进行给药治疗，治疗后5d取不同组别的小鼠，对其肺部切片处理后进行HE染色。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1五味子多糖的提取及其对细胞安全性的影响

五味子多糖的提取方法如下：将五味子利用沸水煮提2次，提取液经 75％乙醇沉淀得到总多糖(WSCP)。将总多糖利用DEAE-纤维素离子交换柱层析分级，得到中性糖(WSCPN)和酸性糖(WSCPA)组分，将酸性糖进一步利用DEAE-纤维素离子交换柱层析分级，依次经0.1M氯化钠、 0.2M氯化钠和0.3M氯化钠洗脱，得到三个组分WSCPA-1、WSCPA-2 和WSCPA-3。将WSCPA-2利用凝胶柱层析分级，得到WSCPA-2a级分多糖用于后续实验研究。其单糖成分及含量见表1。

表1WSCPA-2a级分SPJ多糖成分及含量

将储存于液氮中的MDCK、A549、F81细胞取出复苏，连续传三代后细胞状态良好，进行后续实验研究。分别对三两种细胞进行计数后接种于 96孔板，每孔数量为1×10

使用Graphpad Prism 8.0对所测数据进行分析，分别计算五味子多糖对三两种细胞的半数抑制浓度IC

实施例2五味子多糖对流感病毒的抑制作用

将生长状态良好的A549、MDCK细胞进行细胞计数，按每孔1×10

使用Graphpad Prism 8.0对数据进行分析，分别计算五味子多糖对两种流感病毒的半数抑制浓度EC

检测结果如图4、图5所示，五味子多糖在MDCK细胞上对H1N1-UI182 的半数抑制浓度IC

实施例3五味子多糖对犬冠状病毒的抑制作用

将生长状态良好的MDCK细胞进行细胞计数，按每孔1×10

使用Graphpad Prism 8.0对数据进行分析，计算五味子多糖对犬冠状病毒的半数抑制浓度EC

检测结果如图6所示，五味子多糖在MDCK细胞上对CCV的半数抑制浓度IC

实施例4五味子多糖对伪狂犬病毒的抑制作用

将生长状态良好的F81细胞进行细胞计数，按每孔1×10

使用Graphpad Prism 8.0对数据进行分析，计算五味子多糖对伪狂犬病毒的半数抑制浓度EC

检测结果如图7所示，五味子多糖在F81细胞上对PRV无明显抑制作用。

实施例5五味子多糖对小鼠预后的影响

将流感病毒H1N1-UI182采用滴鼻方式接种于病毒对照组和药物处理组小鼠(50μL/只)，每只小鼠接种100个MLD

计算公式为：肺指数＝(小鼠肺组织的重量÷小鼠体重)×100％

结果显示(图8-图14)，经五味子多糖处理后，小鼠肺部病毒滴度显著降低，肺指数明显回调(表2)，肺部病理损伤减少，虽然药物处理未对小鼠的体重减轻起到保护作用，但小鼠的存活时间延长，表明五味子多糖对感染流感病毒的小鼠具有一定的保护作用，可用于流感病毒的预防和治疗。

表2 SPJ治疗后对流感病毒感染小鼠肺指数的影响

术语定义

在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词为本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

在本文中，所用术语“药学上可接受的盐”包括五味子多糖的无机或有机酸盐，以及无机或有机碱盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、锂盐、葡甲胺盐、盐酸盐，氢澳酸盐，氢腆酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐或双羟萘酸盐等。

在本文中，“衍生物”是指五味子多糖中的氢原子或其它原子团被取代而衍生出的多糖类化合物，其具有相当于五味子多糖10％以上生物学活性。

在本文中，“前药”是指根据五味子多糖结构成分加以改造获得的具有新的物理、化学和生物学性质的衍生物，其本身不显示原药(即五味子多糖)的药理作用，在体内转化为原药而发挥作用。

五味子多糖可以溶剂合物(优选水合物)的形式存在，其包含作为五味子多糖晶格的结构要素的极性溶剂，特别是水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。应理解的是，在治疗本申请所述的疾病或感染中使用的五味子多糖的任何溶剂合物尽管可能提供不同的性质(包括药代动力学性质)，但是一旦吸收至受试者中，会得到五味子多糖，使得五味子多糖的使用分别涵盖五味子多糖的任何溶剂合物的使用。

在本文中，术语“治疗有效量”或“预防有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物 (例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期)、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。

另外，针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，药物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。

本发明提供了五味子多糖在抗上呼吸道病毒感染方面的应用，通过构建MDCK、A549两种流感病毒感染细胞模型以及MDCK犬冠状病毒感染模型，使用五味子多糖对细胞模型进行治疗处理，结果显示五味子多糖在细胞水平上可显著抑制流感病毒(例，H1N1和H3N2)、犬冠状病毒对细胞的损伤。其次，小鼠的体内实验证明，对小鼠接种流感病毒后，采用五味子多糖对小鼠进行连续治疗处理，结果显示五味子多糖可降低小鼠肺部病毒载量，对小鼠肺部具有一定保护作用，且可以延长小鼠存活时间。表明五味子多糖可用于流感病毒感染的预防和治疗。综上，本发明拓展了五味子多糖的功效范围，为预防或治疗流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒感染的药物研发提供了新的方向。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。