细丝蛋白-A-IgG抗体在制备检测血管内皮损伤试剂盒中的应用

摘要

本发明提供细丝蛋白‑A‑IgG抗体在制备检测血管内皮损伤试剂盒中的应用。本发明试剂盒利用人抗标签肽的IgG抗体作为标准品以及结合生物素‑亲和素放大系统、磁微粒化学发光免疫分析大大提高了检测的准确性、灵敏度、特异性及检测速度。本发明以人抗标签肽的IgG抗体作为标准品，大大提高了检测准确性。同时固相膜免疫定性检测操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍。将固相膜免疫定性检测人血清中抗细丝蛋白‑A‑IgG抗体的试剂盒引入生物素‑亲和素放大系统，大大提高了检测灵敏度，能够实现血管内皮损伤的高效检测，检测到抗细丝蛋白‑A‑IgG自身抗体，则判定存在血管内皮损伤。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及细丝蛋白-A-IgG抗体在制备检测血管内皮损伤试剂盒中的应用，具体是一种检测抗细丝蛋白-A-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。

背景技术

血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着有血管内皮细胞，血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶(eNOs)作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的发生。血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。

微小病变病(MCD)是儿童肾病综合征的主要原因，占成人肾病综合征的10-15％。微小病变病患者肾小球在光学显微镜下看起来基本正常，在电子显微镜下可见的唯一组织病理学异常是弥漫性足细胞足突融合消失。因此，MCD被认为是一种原发性足细胞疾病。皮质类固醇治疗后蛋白尿完全缓解是MCD的标志，一般而言进行性肾功能衰竭很少见。然而，MCD会导致严重的并发症。在成人中观察到的与疾病相关的并发症主要包括静脉血栓形成和需要临时透析的严重急性肾损伤。此外，由于MCD的特点是慢性、复发性病程，因此通常需要延长免疫抑制治疗以维持蛋白尿缓解。然而，长期免疫抑制治疗会增加严重感染的风险，并带来恶性肿瘤的长期风险。目前，对MCD的潜在发病机制仍然知之甚少。其中一个观点认为是由免疫细胞产生的循环通透性因子引发了该病。由于原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的发病机制与MCD非常相似，因此许多学者认为MCD和FSGS是同一个疾病在不同阶段的表型。基于MCD与非霍奇金淋巴瘤之间的关联、麻疹感染诱导的缓解以及环磷酰胺治疗后的延长缓解，T细胞最早被怀疑是循环通透性因子的来源。然而，近些年利妥昔单抗和其他特异性B细胞消除药物的治疗效果对T细胞来源提出了挑战。值得注意的是，皮质类固醇和利妥昔单抗对足细胞的直接作用也被认为具有治疗效果。我们团队在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了许多足细胞自身抗体，从而提供了足细胞损伤、自身免疫和蛋白尿对抗B细胞治疗的反应之间的潜在联系，并据此在国际上首次提出了“自身免疫性足细胞病”(Autoimmune podocytopathies)的概念，并逐步得到了国内外同行的认可。最近，哈佛医学院团队Watts等人发现，儿童及成人微小病变肾病综合征患者血清中还存在抗Nephrin自身抗体，这为我们的创新理论提供了有力佐证。

尽管观察到的足细胞损伤是MCD的主要经典特征，但疾病机制可能还涉及肾小球血管内皮细胞。早在2000年Futrakul N等报道特发性肾病综合征(INS)病人常伴有肾脏灌流不足。他们使用人内皮细胞株ECV 304，与INS病人血清共孵育，进行内皮细胞毒性试验，结果发现，FSGS病人血清造成的内皮细胞损伤最明显。因此，他们推测肾小球血管内皮细胞损伤可能是造成INS病人肾脏灌流不足的原因。Purohit S等人发现在MCD病人循环系统中有内皮细胞损伤标志物syndecan 1升高，但是不清是否同时存在肾小球内皮细胞的损伤。Trachtman H等人在FSGS和MCD病人的肾组织中观察到了IgM与补体成分共沉积，且证实IgM是针对GEC和心磷脂表位的抗体。2022年Bauer C等人发现，MCD病人血清中内皮细胞标志物有升高，同时肾组织病理证实肾小球内皮细胞caveolin-1表达明显上升，进一步将病人血清与体外培养的人肾小球内皮细胞共孵育会显著增加肾小球血管内皮细胞损伤的标志物thrombomodulin的表达，由此证明MCD病人存在肾小球血管内皮细胞的损伤。

尽管如此，至今大家并不清楚造成肾小球内皮细胞损伤的致病因子到底是什么。我们的研究团队通过前期的研究在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了一系列的肾小球血管内皮细胞自身抗体。动物实验证实这些肾小球血管内皮细胞自身抗体会引起小鼠肾小球血管内皮细胞严重损伤。体外细胞培养实验也表明这些自身抗体会影响血管内皮细胞的形态和功能。临床研究更是表明这些肾小球血管内皮细胞自身抗体与患者的高凝状态以及不良预后有关。此外，我们的研究结果还提示肾小球血管内皮细胞自身抗体引起的肾小球血管内皮细胞损伤可能是MCD中的特征性足细胞损伤的始动因素，是该病的重要病因之一。由此，我们在国际上首次提出了MCD和FSGS肾病综合征发病的二次打击理论：即，包括自身抗体在内的致病因子首先损伤肾小球血管内皮细胞，之后这些致病因子进一步损伤足细胞，最终引起患者发病。因为从足细胞特殊的解剖位置来看，血液循环系统中的致病因子不可能与之接触，除非肾小球血管内皮细胞的完整性已经受到了损伤。由此可见，我们关于肾小球血管内皮细胞自身抗体的研究成果是一次在肾病综合征发病机制的理论研究方面的突破。但目前仍缺乏高效的对血管内皮损伤进行检测的试剂盒。

细丝蛋白-A(Filamin-A)是在非肌性细胞中发现的第一个肌动蛋白交联蛋白。其可与90多种配体结合，包括通路蛋白、细胞内信号分子及转录因子等，具有整合细胞力学和信号转导的作用。关于Filamin-A在肿瘤领域研究很多，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等。例如在一些研究中发现，Filamin-A在乳腺癌细胞中可能通过调控黏着斑动力学变化而一直乳腺癌的迁移及浸润，Filamin-A有望作为分选转移性乳腺癌患者特异且灵敏的检测指标应用于预后评估。Filamin-A在良性前列腺疾病、前列腺上皮瘤及临床局限性癌组织中表达高于转移性前列腺癌。另外有研究指出Filamin-A可参与一些自身免疫性疾病发生。在重症肌无力患者血清中及患有导致肾小球肾炎的慢性移植物抗宿主病的老鼠血清中发现大量抗Filamin-A抗体。但目前关于Filamin-A的表达情况和Filamin-A的自身抗体的存在情况在肾病综合征中未见报道。另外现有技术中，没有涉及基于靶点Filamin-A或其自身抗体作为一种血清学标志物在肾病综合征中的应用。Filamin-A-IgG是其中一种重要的肾小球血管内皮细胞自身抗体，与MCD和FSGS肾病综合征的发生发展密切相关，且能指导临床的诊疗。然而，目前市场上缺乏相应的临床检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供细丝蛋白-A-IgG抗体在制备检测血管内皮损伤试剂盒中的应用，具体是一种检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。抗Filamin-A-IgG自身抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的有效检测。

优选的是，所述检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂包括Filamin-A蛋白或含标签的Filamin-A重组蛋白或多肽，所述Filamin-A蛋白的NCBI蛋白登录号为BC014654。

优选的是，所述标签包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。

优选的是，当所述标签为His标签时，所述含标签的Filamin-A重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述血管内皮损伤包括肾小球血管内皮细胞损伤。

本发明还提供了一种检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述应用中的检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

优选的是，所述标记抗体包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。

优选的是，所述酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

本发明提供了检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。本发明首次在部分肾病综合征患者的体内检测到了一种抗Filamin-A-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球血管内皮细胞上Filamin-A。本发明发现Filamin-A蛋白抗体是一种重要的肾小球血管内皮细胞自身抗体，与MCD和FSGS肾病综合征的发生发展密切相关，且能指导临床的诊疗。抗Filamin-A-IgG自身抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的检测，具体为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。本发明提供的检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂盒既可以定性也可以定量检测肾病综合征患者血清中抗Filamin-A-IgG抗体，且本发明试剂盒利用人抗标签肽的IgG抗体作为标准品以及结合生物素-亲和素放大系统、磁微粒化学发光免疫分析大大提高了检测的准确性、灵敏度、特异性及检测速度。具体的，与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：

1、本发明试剂盒能够实现血管内皮损伤的高效检测，检测到抗Filamin-A-IgG自身抗体，则判定存在血管内皮损伤。

2、目前国内外关于肾脏疾病患者有关Filamin-A、抗Filamin-A-IgG抗体仅限于分子机制研究，并没有定量检测其在患者血清中水平。本发明首次鉴定了针对Filamin-A的IgG自身抗体，并针对该Filamin-A-IgG自身抗体发明了检测试剂盒，填补了国内外空白。利用本发明试剂盒检测298例肾病综合征患者血清中抗Filamin-A-IgG抗体，结果显示有144例患者抗Filamin-A-IgG抗体阳性，即抗Filamin-A-IgG抗体阳性检出率为48.32％。本发明对抗Filamin-A-IgG抗体进行检测后续可以为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。

3、本发明试剂盒涉及固相膜免疫定性分析人血清中抗Filamin-A-IgG抗体，以人抗标签肽的IgG抗体作为标准品，大大提高了检测准确性。固相膜免疫定性检测操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍；另外NC膜吸附能力极强接近100％，微量抗原能够完全吸附固定在NC膜上；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性；另外本发明固相膜免疫定性检测人血清中抗Filamin-A-IgG抗体的试剂盒引入生物素-亲和素放大系统，大大提高了检测灵敏度。

4、本发明涉及的磁微粒化学发光免疫分析定量检测人血清中抗Filamin-A-IgG抗体试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过起动发光试剂(H

附图说明

图1：肾小球血管内皮细胞上的Filamin-A蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。图1A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；图1B：一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；图1C：靶抗原Filamin-A蛋白的质谱鉴定。

图2是重组蛋白Filamin-A的表达及鉴定，图2A：不同诱导条件下表达的重组蛋白Filamin-A的SDS-PAGE鉴定图；图2B：不同纯化方案得到的重组蛋白Filamin-A的SDS-PAGE鉴定图。

图3：固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗Filamin-A-IgG抗体。

图4：磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗Filamin-A-IgG抗体的原理示意图。

图5：蛋白抗原Filamin-A包被羧基磁微粒示意图。

图6：各类肾病病人中抗Filamin-A-IgG抗体的检测情况，其中NS：肾病综合征，HP：过敏性紫癜，HPN：紫癜性肾炎，KD：川崎病，IgAN：IgA肾病，NC：健康儿童。

图7：抗Filamin-A-IgG抗体水平与肾小球血管内皮细胞损伤标志物Plvap进行线性相关性分析结果图。

具体实施方式

本发明提供了检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。细丝蛋白-A(Filamin-A)是在非肌性细胞中发现的第一个肌动蛋白交联蛋白。其可与90多种配体结合，包括通路蛋白、细胞内信号分子及转录因子等，具有整合细胞力学和信号转导的作用。血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着着血管内皮细胞，血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。因此，在血液循环系统中检测出血管内皮细胞自身抗体，临床上可以用于提示血管内皮细胞损伤的存在。因为不同脏器的血管内皮细胞都是一样的，因此本发明首次发现血管内皮细胞自身抗体——抗Filamin-A-IgG自身抗体，本发明应用能够实现包括肾小球血管内皮在内的全身所有血管内皮损伤的检测。

本发明检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂以Filamin-A蛋白为靶点，进行Filamin-A自身抗体的检测(即抗Filamin-A-IgG自身抗体为检测血管内皮细胞损伤的生物标志物)，所述试剂能够实现血管内皮损伤的高效检测。在本发明中，所述试剂能够与来自组织(肾活检组织)或体液(特别是血液、血浆、血清)中的Filamin-A蛋白自身抗体进行免疫反应。在本发明中，所述检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂优选包括Filamin-A蛋白或含标签的Filamin-A重组蛋白或多肽；所述Filamin-A蛋白的NCBI蛋白登录号为BC042923。在本发明中，所述标签优选为具有某些生物学或物理功能的标签，特别是N-末端或C-末端；这些标签的存在有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀；所述标签更优选是能够特异性结合配体的序列或结构域，如标签肽，所述标签肽优选选自：His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。在本发明中，当所述标签为His标签时，所述含标签的Filamin-A重组蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：

MNQPASFAVSLNGAKGAIDAKVHSPSGALEECYVTEIDQDKYAVRFIPRENGVYLIDVKFNGTHIPGSPFKIRVGEPGHGGDPGLVSAYGAGLEGGVTGNPAEFVVNTSNAGAGALSVTIDGPSKVKMDCQECPEGYRVTYTPMAPGSYLISIKYGGPYHIGGSPFKAKVTGPRLVSNHSLHETSSVFVDSLTKATCAPQHGAPGPGPADASKVVAKGLGLSKAYVGQKSSFTVDCSKAGNNMLLVGVHGPRTPCEEILVKHVGSRLYSVSYLLKDKGEYTLVVKWGDEHIPGSPYRVVVPHHHHHH。

在本发明中，所述血管内皮损伤优选包括肾小球血管内皮细胞损伤。更具体的，本发明所述血管内皮损伤优选包括肾病综合征的血管内皮损伤。在本发明中，所述肾病综合征优选包括微小病变病或原发性局灶节段性肾小球硬化。

本发明还提供了一种检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案所述应用中的检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

在本发明中，所述检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂(Filamin-A蛋白或含标签的Filamin-A重组蛋白)优选固定于固相载体上。本发明所述“固定”是指与Filamin-A抗原蛋白不溶于水的固相载体结合，该固相载体或支持物不溶于水，更优选地通过共价键合，静电相互作用，疏水相互作用、或通过二硫键相互作用，最优选通过一个或多个共价键。固定可以是直接固定方式，例如通过过滤，离心或层析，将固定化的分子与不溶性载体一起从水溶液中分离出来。还包括可逆或不可逆的方式固定Filamin-A抗原蛋白。例如，抗原蛋白通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂解的二硫键)固定于载体，这种固定是可逆的。另外，如抗原蛋白通过在水性溶液中不会裂解的共价键(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式：如固定对所述抗原蛋白具有特异性亲和力的抗体，然后形成抗原蛋白-抗体复合物以达到固定的效目的。本发明所述的抗原蛋白Filamin-A固定方法优选为直接包被法：(1)抗原蛋白Filamin-A通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)带有羧基功能团的磁微粒与抗原蛋白Filamin-A的氨基结合，抗原蛋白Filamin-A通过化学偶联方式结合在磁微粒上。在本发明中，所述固相载体优选包括硝酸纤维素膜、磁微粒或酶标微孔板。

本发明优选采用基因重组原核表达方法成功表达并纯化出重组蛋白Filamin-A，以此作为试剂盒中抗原蛋白，研发出一套适合于检测肾病综合征患者肾小球血管内皮细胞自身抗体抗Filamin-A-IgG抗体的试剂盒，包括一种定性或定量分析检测人血清中抗Filamin-A-IgG抗体的检测试剂盒。

在本发明中，所述Filamin-A蛋白优选表达于细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中。表达得到Filamin-A蛋白后，本发明优选利用镍柱亲和层析、分子筛层析、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、疏水柱纯化等方法对Filamin-A蛋白进行纯化。

在本发明中，所述标记抗体优选包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。

在本发明中，所述酶标记的二抗优选包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。

在本发明中，所述试剂盒的类型优选包括固相膜免疫试剂盒或磁微粒化学发光免疫分析试剂盒；当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒优选还包括抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色液、洗涤液、酶工作液、标准品、阳性质控品和阴性质控品；当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒优选还包括化学发光预激发液A、化学发光激发液B、标准品和清洁溶液。在本发明中，标准品和阳性质控品优选均为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗Filamin-A-IgG自身抗体；所述阴性质控品优选为健康体检者血清。

具体的，当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒中，所述检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂，即抗原优选为重组蛋白Filamin-A(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)；固相载体优选为Satourius CN140硝酸纤维素膜；阳性质控品(标准品)优选为人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)；阴性质控品优选为健康体检者血清；标记抗体优选为生物素标记抗人IgG抗体；酶工作液优选为碱性磷酸酶-链霉亲和素；底物显色剂、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、洗涤液。所述抗原稀释液为含有163mM NaCl、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4；所述样品稀释缓冲液为含有5％BSA的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液为含有1M D-glucose、2％甘油、0.5％Tween20的0.01M PBS pH7.4；所述洗涤液为：含有163mM NaCl、5％甘油、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4；所述底物显色剂为过氧化氢、TMB、4-MUP、AMPPD或BCIP。

当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒中，抗原优选为重组蛋白Filamin-A(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；固相载体优选为羧基磁珠；标记抗体优选为吖啶酯标记抗人IgG抗体；化学发光预激发液A和化学发光激发液B优选为常规市售产品、标准品优选为不同浓度的抗Filamin-A-IgG自身抗体；清洁溶液优选为含有0.15mol/LNaCL和0.05％Tween-20的pH 7.2、25mmol/L Tris-HCL溶液。

在本发明中，所述试剂盒的待测样品优选来自全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、胸腹水；更优选为哺乳动物(人类)血清。

在本发明中，检测血清中抗Filamin-A-IgG抗体试剂盒的原理优选为：利用间接法反应原理，首先将Filamin-A抗原吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，再加入标记抗体(标记二抗)反应后，若待检血清中含有抗Filamin-A-IgG抗体，则形成包被抗原Filamin-A-待检血清抗Filamin-A-IgG抗体-标记抗人IgG抗体三元复合物，最后利用光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析人血清中抗Filamin-A-IgG抗体的目的。

下面结合具体实施例对本发明所述的检测抗Filamin-A-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1肾小球血管内皮细胞上的Filamin-A蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原

本发明通过前期大量临床和分子机制研究，首次发现肾病综合征患者血清IgG水平较高，并证实血管内皮细胞上的Filamin-A是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。因此检测血清中抗Filamin-A-IgG抗体的存在及其定量水平有助于肾病综合征的早期鉴别、尤其对有相关症状的患者进行筛查是有利的。具体实施如下(1)血管内皮细胞总蛋白的提取：培养血管内皮细胞株(EAhy926)，用PBS洗涤2-3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220,Gene)在含有30mm Tris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的血管内皮细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的血管内皮细胞总蛋白浓度。(2)二维电泳：提取血管内皮细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用健康人和肾病综合征病人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，见图1A，1B，(1A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；图1B：一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点)。(3)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上取下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μl)进行消化，然后向反应混合物中加入10μl的25mM碳酸氢铵，37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为Filamin-A蛋白，见图1C。

实施例2重组蛋白抗原Filamin-A表达及纯化

利用基因工程的方法以编码Filamin-A蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体pET-30a进行蛋白表达。为了表达高浓度的重组蛋白，本发明分别对目的蛋白表达条件进行了优化，包括诱导剂不同的诱导时间，重组菌培养温度，诱导表达重组菌的破菌上清和破菌沉淀。分别收集在37℃诱导4小时和在15℃诱导16小时重组菌的破菌上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，结果表明重组蛋白Filamin-A在15℃诱导16小时收集到的重组菌的细胞裂解液上清中表达量最多(条带2)，表达量占菌体总蛋白量的30％，见图2A。本发明表达的蛋白抗原上含有His标签的标签肽，接着对将收集到的破军上清液中表达的重组蛋白纯化方案进行优化，方案1是经镍柱亲和层析、分子筛、疏水柱、离子亲和层析法进行纯化，方案2是经镍柱亲和层析、分子筛层析、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、疏水柱纯化进行纯化，本发明表达的蛋白抗原上含有His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析、分子筛、疏水柱、离子亲和层析法等进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白Filamin-A的分子量为32.34KDa，结果显示方案1(本发明纯化方案)纯化得到的重组蛋白浓度最高(条带1)，见图2B。

实施例3本发明采用正交试验设计对试剂盒反应条件进行优化

根据抗原Filamin-A包被浓度(100μg、150μg、250μg、300ug四个包被浓度)、各反应时间(15min、30min、45min)和温度(25℃、37℃)、酶标二抗最佳稀释度(1:100、1:500、1:750、1:1000四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清，选择阳性血清的最高光信号值(P)和阴性血清的最低光信号值(N)的比值(P/N)。通过正交设计我们得到了本试剂盒最佳抗原Filamin-A包被浓度为250μg/ml、固相膜免疫检测抗Filamin-A-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间30min及最佳生物素标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：750；磁微粒化学发光免疫分析检测抗Filamin-A-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为37℃、最佳抗原抗体反应时间15min及最佳吖啶酯标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：750。

实施例4用于检测抗Filamin-A-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备

4.1用于检测抗Filamin-A-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的组成：

1.抗原：重组蛋白Filamin-A，

2.固相载体：Satourius CN140硝酸纤维素膜，

3.阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，

4.阴性质控品：健康体检者血清，

5.标记抗体：生物素标记抗人IgG抗体，

6.抗原稀释液，

7.样品稀释缓冲液，

8.抗体稀释液，

9.洗涤液，

10.酶工作液：碱性磷酸酶-链霉亲和素，

11.底物显色液：BCIP显色液。

4.2用于检测抗Filamin-A-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的检测步骤如下：

4.2.1包被、封闭：将8μl浓度为250μg/ml的Filamin-A抗原直接点于硝酸纤维素膜上置37℃孵育箱中干燥30min，将硝酸纤维素膜置于检测板中，加入200μl 5％BSA于37℃温盒中封闭30min，弃去封闭液后用洗涤液洗2次；

4.2.2抗原孵育：向检测板内加入10μl用稀释液稀释的抗体标准品或待检血清，同时做阴性对照、阳性对照，25℃孵育30min，每个样品设置3个平行孔；

4.2.3二抗孵育：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加入20μl 1:500生物素标记抗人IgG抗体，25℃孵育30min；

4.2.4显色：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加500μl碱性磷酸酶-链霉亲和素，室温孵育20min，弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，然后加入BCIP显色液，室温反应20min，用流水冲洗检测板，终止酶反应。取出测试硝酸纤维素膜条用吹风机吹干膜条，用比色卡肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性见图3，或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗Filamin-A-IgG抗体水平进行半定量分析。

实施例5用于检测抗Filamin-A-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的制备

5.1用于检测抗Filamin-A-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒组成：

1.抗原：重组蛋白Filamin-A，

2.固相载体：羧基功能团的磁微粒，

3.阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，

4.阴性质控品：健康体检者血清，

5.标记抗体：吖啶酯标记抗人IgG抗体，

6.抗原稀释液，

7.样品稀释缓冲液，

8.抗体稀释液，

9.洗涤液，

10.预激发液：H

11.激发液：NaOH。

5.2用于检测抗Filamin-A-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的检测原理

本发明化学发光免疫分析试剂盒是将磁性分离技术、免疫分析技术、化学发光技术三者结合起来的一种分析方法。本发明试剂盒采用间接法定量分析检测人血清中抗Filamin-A-IgG抗体：首先将Filamin-A抗原包被磁微粒溶液与稀释样本混合，特异性抗Filamin-A-IgG抗体结合到Filamin-A抗原包被的磁微粒上，洗涤后，加入吖啶酯标记抗人IgG抗体，形成Filamin-A抗原包被磁微粒-抗Filamin-A-IgG抗体-吖啶酯标记抗人IgG抗体复合物，在外加磁场作用下，将未结合的物质与免疫反应形成的复合物进行分离，弃上清后清洗沉淀的复合物，加入预激发液(H

5.3Filamin-A抗原包被磁微粒的制备

5.3.1Filamin-A抗原包被磁微粒的原理：基于磁微粒表面所含的羧基功能团与EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)溶液发生反应而生成不稳定的氨基活性O-酰基脲中间体，该中间体与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)发生反应生成半稳定的氨基反应活性NHS酯，半稳定的氨基反应活性NHS酯再与蛋白抗原Filamin-A上的氨基发生反应，形成Filamin-A抗原包被磁微粒，见图5。

5.3.2EDC/NHS活化羧基磁微粒，具体步骤如下：

a)称取10mg磁微粒，用20mM MES清洗磁微粒3次后，磁铁分离，弃去上清；

b)将清洗过的磁微粒重悬于100μl的20mM MES中，使磁微粒终浓度为100mg/ml；

c)向清洗后的磁微粒依次加入磷酸盐缓冲液配制的50μl 20mg/ml的EDC和50μl24mg/ml的Sμlfo-NHS，充分混匀，室温静置活化30min；

d)在外加磁场作用后，弃去上清，取400μl 0.05M磷酸盐缓冲液洗涤磁微粒，加入400μl保存液定容保存备用。

5.3.3活化磁微粒与蛋白抗原Filamin-A交联向上述活化好的磁微粒溶液中加入预冷的1ml 20mM MES继续清洗磁微粒2次；取200μl 2mg/ml的蛋白抗原Filamin-A加入到活化好的磁微粒中，充分混匀，室温静置反应16小时；反应结束后，加入含有0.2％Tween20的pH 7.4PBS缓冲液，重复清洗磁微粒2次；然后再加入含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH7.4PBS缓冲液，至磁微粒终浓度为10mg/ml，充分混匀，室温静置反应30min；反应结束后，弃上清，并用含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液重悬磁微粒，这样活化的磁微粒与蛋白抗原Filamin-A交联完成。

5.4吖啶酯标记抗人IgG抗体的制备，具体步骤如下：

a)利用二甲基甲酰胺配制2mg/mL吖啶酯溶液；

b)利用0.2M(pH8.0)碳酸盐缓冲液配制1mg/mL抗人IgG抗体；

c)取摩尔比为4:1的吖啶酯与抗人IgG抗体充分混匀，反应40min；

d)加入20μl含有5％赖氨酸的碳酸盐缓冲液终止反应；

e)通过脱盐除杂，得到纯度较高的吖啶酯标记抗人IgG抗体溶液。

5.5磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测血清中抗Filamin-A-IgG抗体的步骤

5.5.1待检血清加入取100μl稀释后的待检血清或抗His标签的IgG标准品，加入100μl Filamin-A抗原包被磁微粒溶液中，37℃反应15min，同时做阴阳性对照；

5.5.2标记抗体的加入400μl洗涤液洗涤3次x1 min，加入100μl 1:500稀释的吖啶酯标记抗人IgG抗体，37℃反应15min；

5.5.3信号检测400μl洗涤液洗涤3次x1 min，加入100μl预激发液(H

实施例6检测血清抗Filamin-A-IgG抗体试剂盒的临床应用

6.1受试者纳入从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者，包括298例肾病综合征(NS)、100例过敏性紫癜(HP)、100例紫癜性肾炎(HPN)、100例川崎病(KD)，同时期100例健康儿童(NC)。血清样本取自各类肾病患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。

6.2各类肾病病人中抗Filamin-A-IgG抗体的检测情况利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出各类肾病的患者血清中抗Filamin-A-IgG抗体水平，包括298例肾病综合征、100例过敏性紫癜、100例紫癜性肾炎、100例川崎病及同时期100例健康儿童，结果显示144例肾病综合征病人中抗Filamin-A-IgG抗阳性，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病以及健康儿童中抗Filamin-A-IgG抗体为阴性，见图6。

6.3抗Filamin-A-IgG抗体与肾小球血管内皮细胞损伤标志物Plvap水平相关性分析利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出肾病综合征患者血清中抗Filamin-A-IgG抗体表达量，并检测患者血清中血管内皮损伤标志物Plvap的表达量，结果显示肾病综合征病人中抗Filamin-A-IgG抗体表达量与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关，肾病综合征与血管内皮损伤有关，Y＝0.442+0.02z70x,r＝0.49,P＜0.001，见图7。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 细丝蛋白-A-IgG抗体在制备检测血管内皮损伤试剂盒中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 307

<212> PRT

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 1

Met Asn Gln Pro Ala Ser Phe Ala Val Ser Leu Asn Gly Ala Lys Gly

1 5 10 15

Ala Ile Asp Ala Lys Val His Ser Pro Ser Gly Ala Leu Glu Glu Cys

20 25 30

Tyr Val Thr Glu Ile Asp Gln Asp Lys Tyr Ala Val Arg Phe Ile Pro

35 40 45

Arg Glu Asn Gly Val Tyr Leu Ile Asp Val Lys Phe Asn Gly Thr His

50 55 60

Ile Pro Gly Ser Pro Phe Lys Ile Arg Val Gly Glu Pro Gly His Gly

65 70 75 80

Gly Asp Pro Gly Leu Val Ser Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Glu Gly Gly

85 90 95

Val Thr Gly Asn Pro Ala Glu Phe Val Val Asn Thr Ser Asn Ala Gly

100 105 110

Ala Gly Ala Leu Ser Val Thr Ile Asp Gly Pro Ser Lys Val Lys Met

115 120 125

Asp Cys Gln Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg Val Thr Tyr Thr Pro Met

130 135 140

Ala Pro Gly Ser Tyr Leu Ile Ser Ile Lys Tyr Gly Gly Pro Tyr His

145 150 155 160

Ile Gly Gly Ser Pro Phe Lys Ala Lys Val Thr Gly Pro Arg Leu Val

165 170 175

Ser Asn His Ser Leu His Glu Thr Ser Ser Val Phe Val Asp Ser Leu

180 185 190

Thr Lys Ala Thr Cys Ala Pro Gln His Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro

195 200 205

Ala Asp Ala Ser Lys Val Val Ala Lys Gly Leu Gly Leu Ser Lys Ala

210 215 220

Tyr Val Gly Gln Lys Ser Ser Phe Thr Val Asp Cys Ser Lys Ala Gly

225 230 235 240

Asn Asn Met Leu Leu Val Gly Val His Gly Pro Arg Thr Pro Cys Glu

245 250 255

Glu Ile Leu Val Lys His Val Gly Ser Arg Leu Tyr Ser Val Ser Tyr

260 265 270

Leu Leu Lys Asp Lys Gly Glu Tyr Thr Leu Val Val Lys Trp Gly Asp

275 280 285

Glu His Ile Pro Gly Ser Pro Tyr Arg Val Val Val Pro His His His

290 295 300

His His His

305