一种黑牛肝菌菌种保存方法和保存培养基

摘要

本发明公开了一种黑牛肝菌菌种保存方法和保存培养基，属于真菌菌种保存领域。该黑牛肝菌菌核保存培养基，包括以下重量份原料：小麦粒45‑48份，杂木屑15‑18份、松木屑15‑17份、麸皮18‑19份、石膏1‑2份和白糖1‑2份。本发明还公开一种黑牛肝菌菌种保存方法，包括将黑牛肝菌菌种接种到上述的黑牛肝菌菌核保存培养基中培养产生菌核后，再在15‑18℃条件下进行保存的步骤。本发明保存方法操作简单，保存培养基成分易得，生产成本低，并且采用本发明保存方法能够保存黑牛肝菌菌核活力及优良性能高达四年半之久，解决了黑牛肝菌不易于简便长期保存的难题，为黑牛肝菌的大批量继代和扩繁提供了技术保障。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌菌种保存领域，特别是涉及一种黑牛肝菌菌种保存方法和保存培养基。

背景技术

菌种质量的优劣不但直接关系到食用菌栽培的产量和质量，甚至会影响到生产的成败。黑牛肝菌菌种是其人工栽培和仿生栽培的关键环节之一。黑牛肝菌属于高温担子菌，菌丝对低温很敏感，在低温条件下会发生自溶而死亡，菌丝生长的最适温度是28～30℃，温度低于15℃或超过30℃，菌丝生长速度会急剧下降，这也表明黑牛肝菌难以像其他的菌种一样在0～6℃条件下保藏。虽然现有技术中有低温长期保藏黑牛肝菌菌种的研究，但是其通常需要进行预冷分段处理，或者额外添加多种保护剂成分，存在操作繁琐，成本增加等缺点。而现在生产上常用试管斜面继代培养保藏法将菌种置15～20℃条件下保藏，每隔3～6个月转管1次，这一技术提供了一个简便有效的短期保藏方法，但也增加了菌种产生污染和形态、生理特征发生变异的风险。

另外，目前黑牛肝菌优良菌株大多通过自然选育而获得，即通过广泛的收集不同地域、不同生长环境和不同发育时期的子实体分离菌株，对各菌株的菌丝生长速度、培养性状、栽培环境的适应性、出菇期的早晚、子实体的形状、大小、色泽、质地等各方面进行系统的试验，最终筛选出优良的菌株，这种选育方法程序复杂，工作量大，不易于推广应用。因此，设计一种既能简便有效的保存黑牛肝菌菌种，又能保持其优良性状的方法极为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑牛肝菌菌种保存方法和保存培养基，以解决上述现有技术存在的问题，该保存方法能够保存黑牛肝菌菌核活力及优良性能高达四年半之久，解决了黑牛肝菌不易于简便长期保存的难题，为黑牛肝菌的大批量继代和扩繁提供了技术保障。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种黑牛肝菌菌核保存培养基，包括以下重量份原料：小麦粒45-48份，杂木屑15-18份、松木屑15-17份、麸皮18-19份、石膏1-2份和白糖1-2份。

本发明还提供一种上述的黑牛肝菌菌核保存培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)将小麦粒水煮至吸水饱和而皮不破状态，滤干；

(2)将其余原料混合，再向其中加入柠檬水，最后加入滤干的小麦粒搅拌均匀，获得所述黑牛肝菌菌核保存培养基。

进一步地，步骤(2)所述柠檬水浓度为20mg/L，其与所述其余原料的料水质量比为1:1.4。

本发明还提供一种黑牛肝菌菌种保存方法，包括将黑牛肝菌菌种接种到权利要求1所述的黑牛肝菌菌核保存培养基中培养产生菌核后，再在15-18℃条件下进行保存的步骤。

进一步地，所述黑牛肝菌菌种为黑牛肝菌经母种培养基培养后获得的母种。

进一步地，所述母种培养基包括以下原料：以重量份计，淀粉30份、蛋白胨1份、葡萄糖20份、磷酸二氢钾1份和琼脂16份，余量为水。

进一步地，所述母种培养基按照以下步骤制备：先将淀粉加入水中溶解，之后加入蛋白胨、磷酸二氢钾和葡萄糖溶解，再加入琼脂搅拌均匀，最后调pH为5.0并加水定容至1L。

进一步地，所述培养条件为先在28-30℃下，湿度控制在60％-70％避光培养30d，再将温度调至25-27℃，湿度控制在55％-65％、光照强度为50-100lx继续培养20-30d。

进一步地，所述保存条件为湿度控制在50％-60％下避光保存。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明提供的菌核保存培养基，以小麦粒为主要营养基质，提供碳源，通过水煮滤干操作，让其充分吸水，既有利于高压灭菌彻底，又能充分释放麦粒中营养物质，杂木屑提供木质纤维素，麸皮提供氮源，柠檬酸调节pH值，培养基碳氮比为20-25：1，适宜黑牛肝菌菌丝生长；松木屑中含有芳香物质能诱导黑牛肝菌菌丝形成菌核，黑牛肝菌菌核是贮有营养的一团紧密交织的休眠体，比其菌丝体更能够抵御不良环境，易于菌种的活性维持；杂木屑、松木屑和麸皮为麦粒间孔隙的填充物，能够进一步吸收麦粒表面水分，调节麦粒含水量，防止麦粒粘连在一起，为菌丝正常生长提供空间。

(2)本发明保存方法操作简单，保存培养基成分易得，生产成本低，并且采用本发明保存方法保藏的黑牛肝菌菌核活力和栽培性能与原种菌核无显著差异，能够保存黑牛肝菌菌核活力及优良性能高达四年半之久，解决了黑牛肝菌不易于简便长期保存的难题，为黑牛肝菌的大批量继代和扩繁提供了技术保障。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂。

以下实施例中所用黑牛肝菌是申请人自行采集的暗褐网柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)，其已于2022年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40107，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路一号院三号中国科学院微生物研究所。市面其他常见黑牛肝菌采用本发明保存方法同样适用。

实施例1

1.母种培养

1)母种培养基配方：淀粉30g、蛋白胨1g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、琼脂16g、水定容至1L，pH值5.0。

2)母种培养基配制：按1)配方称取各组分，先将淀粉加入水中溶解，再加入蛋白胨、磷酸二氢钾、葡萄糖溶解，最后加入琼脂边加热边搅拌，再加入水定容至1L，并用1N盐酸调pH值至5.0,用18mm×180mm试管趁热分装，每根试管装10～12ml，塞上硅胶塞。

3)灭菌：将装好培养基的试管竖着放入灭菌锅内，在121℃下，灭菌20～30mim。

4)母种培养基试管斜面制备：灭菌后，打开灭菌锅，趁热将试管按一定的斜度(10℃左右)摆放，以培养基斜面前端离试管口40～50mm为宜，冷却即成试管斜面。

5)组织分离：选择形态发育正常，无病虫害、菌盖边缘尚未展开，重量在60～80g的黑牛肝菌子实体做为分离材料。用75％酒精进行表面消毒，在无菌条件下，用刀片切开菌盖，在菌柄与菌盖交接处切取5mm×5mm组织块接入2)培养基中央，接种后置于28～30℃恒温箱避光培养15～20d,每2～3d检查一次菌丝生长情况，挑选长势好的做为母种。

2.菌核培养

1)菌核培养基配方：以重量份计，小麦粒48％、杂木屑16％、松木屑16％、麸皮18％、石膏1％、白糖1％。

2)菌核培养基配制：按1)配方称取各组分，先用水将小麦粒煮透，让其充分吸水，以皮不破，而内透明不留白为宜，再将其过滤。杂木屑、松木屑、麸皮、石膏和白糖搅拌均匀，将其按料水质量比为1：1.4的比例添加浓度为20mg/L柠檬水，以调节培养料含水量，最后再加入小麦粒搅拌均匀。

3)装管：用32mm×200mm试管，将料装至试管长度的1/2,装料要求下松上紧，擦净管壁，塞紧硅胶塞。

4)灭菌：将装好培养料的试管竖着放入灭菌锅内，在126℃下，灭菌2.5h。

5)接种：待料温降至30℃以下时，在无菌条件下接入经1培养的母种。

6)培养：在28～30℃下，湿度控制在60％～70％避光培养30d后，再将温度调至25～27℃，湿度控制在55％～65％、光照强度为50～100lx继续培养20～30d，在培养料表面及试管壁即可产生大量菌核。

3.菌核保存

经2培养的菌核试管用牛皮纸包紧，在15℃、湿度50％～60％下避光保存42个月。

4.菌核继代培养

在无菌条件下，将上述长期保存的菌核接种至母种培养基试管中，每支试管接一个菌核，在28℃下培养。

实施例2

1.母种培养步骤与实施例1相同，区别在于2.菌核培养、3.菌核保存、4.菌核继代培养步骤，具体如下：

2.菌核培养

1)菌核培养基配方：以重量份计，小麦粒45％、杂木屑18％、松木屑15％、麸皮19％、石膏2％、白糖1％。

2)菌核培养基配制：按1)配方称取各组分，先用水将小麦粒煮透，让其充分吸水，以皮不破，而内透明不留白为宜，再将其滤干，与杂木屑、松木屑、麸皮、石膏和白糖搅拌均匀，将其按料水质量比为1：1.4的比例添加浓度为20mg/L柠檬水，以调节培养料含水量，最后再加入小麦粒搅拌均匀。

3)装管：用32mm×200mm试管，将料装至试管长度的2/3,装料要求下松上紧，擦净管壁，塞紧硅胶塞。

4)灭菌：将装好培养料的试管竖着放入灭菌锅内，在126℃下，灭菌2.5h。

5)接种：待料温降至30℃以下时，在无菌条件下接入经1培养的母种。

6)培养：在28～30℃下，湿度控制在60％～70％避光培养30d后，再将温度调至25～27℃，湿度控制在55％～65％、光照强度为50～100lx继续培养20～30d，在培养料表面及试管壁即可产生大量菌核。

3.菌核保存

经2培养的菌核试管用牛皮纸包紧，在16℃、湿度50％～60％下避光保存45个月。

4.菌核继代培养

在无菌条件下，将上述长期保存的菌核接种至母种培养基试管中，每支试管接一个菌核，在30℃下培养。

实施例3

1.母种培养步骤与实施例1相同，区别在于2.菌核培养、3.菌核保存、4.菌核继代培养步骤，具体如下：

2.菌核培养

1)培养基配方：以重量份计，小麦粒47％、杂木屑15％、松木屑17％、麸皮18％、石膏1％、白糖2％。

2)菌核培养基配制：按1)配方称取各组分，先用水将小麦煮透，让其充分吸水，以皮不破，而内透明不留白为宜，再将其滤干，与杂木屑、松木屑、麸皮、石膏和白糖搅拌均匀，将其按料水质量比为1：1.4的比例添加浓度为20mg/L柠檬水，以调节培养料含水量，最后再加入小麦粒搅拌均匀。

3)装管：用32mm×200mm试管，将料装至试管长度的1/2,装料要求下松上紧，擦净管壁，塞紧硅胶塞。

4)灭菌：将装好培养料的试管竖着放入灭菌锅内，在126℃下，灭菌2.5h。

5)接种：待料温降至30℃以下时，在无菌条件下接入经1培养的母种。

6)培养：在28～30℃下，湿度控制在60％～70％避光培养30d后，再将温度调至25～27℃，湿度控制在55％～65％、光照强度为50～100lx继续培养20～30d，在培养料表面及试管壁即可产生大量菌核。

3.菌核保存

经2培养的菌核试管用牛皮纸包紧，在18℃、湿度50％～60％下避光保存54个月。

4.菌核继代培养

在无菌条件下，将上述长期保存的菌核接种至母种培养基试管中，每支试管接一个菌核，在30℃下培养。

对比例1

与实施例1的区别在于，2.菌核培养2)培养基配制中，松木屑调整为橡木屑。

对比例2

与实施例1的区别在于，2.菌核培养中，培养基配方为：马铃薯200g、蛋白胨1g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、琼脂16g、水1L。

对比例3

与实施例1的区别在于，3.菌核保存中，保存温度为10℃。

效果验证

以2.菌核培养中获得的菌核未经保存，直接接种至母种培养基试管中进行扩繁培养的组别为对照组，将对照组和实施例1-3组、对比例1-3组扩繁后的菌株接种于袋装基质进行人工栽培，分别平行设置100组。每日按时统计对照组、实施例1-3和对比例1-3的菌株生长情况，具体情况见表1。

表1各组菌株生长情况

根据表1可知，实施例1-3保存的菌核经活化培养后，与一代菌核(对照组)相比，菌丝萌发率、生长速度、菌丝长势以及单菇重无显著差异，说明采用本发明的保存方法的菌核与原种菌核的菌丝活力及菌种栽培特性相同。而对比例1-2因保存培养基的调整，获得的菌核活力及菌丝长势不及本发明；对比例3采用低温保存，致使菌核活力下降，不易萌发，且影响后续菌丝生长。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。