用于亲和层析的新的清洗缓冲溶液

摘要

本公开提供了一种在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的方法，所述方法包括1)将蛋白质样品装载到亲和层析柱上，2)用包含组氨酸或咪唑和pH调节剂的清洗缓冲溶液清洗所述柱。

说明书

技术领域

本公开总的来说涉及一种在纯化蛋白质样品时去除杂质的组合物和方法。

背景技术

由于蛋白A配体与单克隆抗体之间的特异性相互作用，蛋白A层析通常被认为是一种高效的纯化步骤。出于这个原因，它通常用于直接捕获步骤和随后的精制柱，以满足生物制药产品的纯度要求。在这个初始步骤中，蛋白A树脂的高选择性使大部分非靶蛋白留在了穿流液中。然而，包括高分子量(HMW)和低分子量(LMW)，宿主细胞蛋白(HCP)在内的某些杂质可能与靶蛋白一起保留在柱内。作为下游工艺中杂质去除的最有效的单元操作，蛋白A层析可以去除澄清化介质中>90％的HCP。因此，它对于在亲和层析步骤中优化杂质的去除尤为重要。

在杂质中，HCP是由生物体产生或编码并且与目标重组产物无关的杂质。HCP形成了一大类与工艺相关的杂质，并且即使水平低，它们也可能损害生物制药的安全性和效力。除了安全性顾虑之外，已知HCP的存在对产品质量也有影响。由于HCP导致安全性和效力两种问题，因此希望通过下游工艺尽可能完全地除去它们。

已经描述了用于从蛋白A柱去除杂质的各种不同的清洗溶液，包括含有下述一者的清洗溶液：疏水电解质(例如四甲基氯化铵、四乙基氯化铵、四丙基氯化铵或四丁基氯化铵，pH 5.0-7.0)，溶剂(例如5-20％异丙醇或聚丙二醇/己二醇)、脲(例如浓度为1-4M)，去污剂(例如0.1-1％PS 20或PS 80)，聚合物(例如5-15％聚乙二醇例如PEG400或PEG8000)，或高浓度缓冲溶液例如浓度为0.8-2.0M并且pH在5.0至7.0之间的Tris-HCl、乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液。

发明内容

一方面，本公开提供了一种在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的方法，所述方法包括下述步骤：

1)将蛋白质样品装载到亲和层析柱上，

2)用包含式I的化合物和pH调节剂的清洗缓冲溶液清洗所述柱，

其中R

在一个实施方式中，所述化合物是组氨酸或咪唑。

本公开还提供了一种在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的方法，所述方法包括下述步骤：

1)将蛋白质样品装载到亲和层析柱上，

2)用包含丝氨酸和/或半胱氨酸和pH调节剂的清洗缓冲溶液清洗所述柱。

在一个实施方式中，所述亲和层析选自蛋白A层析、Capto Blue(High Sub)层析、蛋白G层析、蛋白L层析、Lambda Fab Select层析、Kappa Select层析、lg Select层析、BlueSepharose层析、Capto肝素层析、VII Select层析、VIII Select层析、XSelect层析和CaptoL层析。

在一个实施方式中，所述pH调节剂包括乙酸盐缓冲剂例如NaAc和/或HAc、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或Tris-HCl。

在一个特定实施方式中，所述化合物的摩尔质量在所述清洗缓冲溶液的体积中的百分率为约100mM和更高，优选为约100mM至约1M，更优选为约300mM至约700mM，例如约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM或约1M。

在一个特定实施方式中，所述清洗缓冲溶液的pH为约pH5.5或更低，例如约pH5.0、约pH4.5、约pH4.0、约pH3.5。

在另一个实施方式中，上述方法在步骤2)之后不包括洗脱步骤。

在一个特定实施方式中，所述蛋白质样品是抗体例如单克隆抗体或融合蛋白。所述融合蛋白是含有可以被蛋白A识别的Fc结构域的Fc-融合蛋白。所述Fc-融合蛋白由连接到感兴趣的肽或蛋白质的IgG的Fc结构域组成。在另一个特定实施方式中，所述融合蛋白是HAS(人血清白蛋白)-融合蛋白。所述HAS-融合蛋白由连接到感兴趣的肽或蛋白质的HAS组成。

在一个特定实施方式中，所述杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)。

另一方面，本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的组合物，其中所述组合物包含至少一种式I的化合物：

其中R

在一个实施方式中，R

在一个实施方式中，R

在一个实施方式中，所述化合物是组氨酸或咪唑。

本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的组合物，其中所述组合物包含丝氨酸和/或半胱氨酸。

在一个实施方式中，所述亲和层析选自蛋白A层析、Capto Blue(High Sub)层析、蛋白G层析、蛋白L层析、Lambda Fab Select层析、Kappa Select层析、lg Select层析、BlueSepharose层析、Capto肝素层析、VII Select层析、VIII Select层析、XSelect层析和CaptoL层析。

在一个实施方式中，所述pH调节剂包括乙酸盐缓冲剂例如NaAc和/或HAc、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或Tris-HCl。

另一方面，本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有式I的化合物、丝氨酸或半胱氨酸的组合物：

其中R

在一个实施方式中，R

在一个实施方式中，R

在一个实施方式中，所述化合物包含组氨酸或咪唑。

在一个实施方式中，所述亲和层析是蛋白A层析、Capto Blue(High Sub)层析、蛋白G层析、蛋白L层析、Lambda Fab Select层析、Kappa Select层析、lg Select层析、BlueSepharose层析、Capto肝素层析、VII Select层析、VIII Select层析、XSelect层析和CaptoL层析。

在一个实施方式中，所述试剂盒还包含pH调节剂。

在一个实施方式中，所述pH调节剂包括乙酸盐缓冲剂例如NaAc和/或HAc、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或Tris-HCl。

本公开提供了上述组合物的用途，其用于制备在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的清洗溶液。

特点和优点

本公开提供了一种用于亲和层析的高效且稳健的清洗溶液。所述清洗溶液的特征在于存在组氨酸或咪唑(一种芳香族杂环，是组氨酸的官能团)，应用于洗脱步骤之前的清洗步骤中，并且不损害产物回收。

发明详述

为了可以更容易地理解本公开，首先定义了某些术语。另外的定义被阐述在在整个详细描述中。应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并不打算进行限制。

当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，除非内容明确另有所指，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称物。因此，例如，对“多肽”的指称包括两个或更多个多肽的组合等。

本文中使用的“约”在指称可测量的值例如量、持续时间等时，意味着涵盖偏离指定值±20％或±10％、包括±5％、±1％和±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的相似或等效的任何方法和材料可用于实践以测试本公开，但本文中描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本公开时，将使用下述术语。

本公开中使用的术语“蛋白质样品”是指含有可以被蛋白A识别的Fc结构域的蛋白质。此类蛋白质包括抗体和Fc-融合蛋白。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的。所述抗体可以是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述抗体可以是天然抗体或重组抗体。Fc-融合蛋白由抗体的Fc结构域和遗传连接的活性蛋白质组成。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。多肽可以是天然(组织衍生的)起源的，从原核或真核细胞制备物重组或天然表达的，或通过合成方法化学生产。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。非天然残基在科学和专利文献中已被充分描述。可用作天然氨基酸残基的模拟物的几种示例性非天然组合物和指导方针在下文描述。芳香族氨基酸的模拟物可以通过用例如D-或L-萘基丙氨酸、D-或L-苯甘氨酸、D-或L-2-噻吩基丙氨酸、D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸、D-或L-3-噻吩基丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯丙氨酸、D-对氟-苯丙氨酸、D-或L-对联苯基苯丙氨酸、K-或L-对甲氧基-联苯基苯丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸和D-或L-烷基丙氨酸代替来产生，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括例如噻唑基、噻吩基(thiophenyl)、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。

当在本文中使用时，“肽”包括作为本文中具体示例的肽的保守变体的肽。当在本文中使用时，“保守变体”是指将氨基酸残基用另一个生物学上相似的残基代替。保守变体的实例包括但不限于用一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸替换另一个疏水性残基，或用一个极性残基替换另一个极性残基，例如用精氨酸替换赖氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸或用谷氨酰胺替换天冬酰胺等。可以彼此替换的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变体”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸，只要针对所述取代的多肽产生的抗体也与所述未取代的多肽发生免疫反应即可。此类保守替换在本公开的肽类别的定义之内。当在本文中使用时，“阳离子性”是指在pH 7.4下具有净正电荷的任何肽。肽的生物学活性可以通过本领域技术人员已知和本文描述的标准方法来确定。

本公开中使用的术语“Fc结构域”是指抗体的可结晶片段区。Fc结构域源自于抗体重链的恒定结构域。所述“Fc结构域”可以被蛋白A识别并结合。

在一个实施方式中，所述蛋白质是抗原结合蛋白。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是抗体。在一个实施方式中，所述抗体是IgG类别。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是免疫球蛋白单一可变结构域。

可用于本公开的示例性抗体包括阿达木单抗、贝洛托舒单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、度匹鲁单抗、度伐利尤单抗(Durvalumab)、奥瑞珠单抗、布达鲁单抗(Brodalumab)、瑞利珠单抗、奥拉单抗(Olaratumab)、达雷木单抗、埃罗妥珠单抗、耐昔妥珠单抗、英夫利昔单抗(Infliximab)、奥托萨昔单抗(Obiltoxaximab)、阿特珠单抗、苏金单抗、美泊利单抗(Mepolizumab)、纳武单抗、阿莫罗布单抗(Alirocumab)、依洛尤单抗(Evolocumab)、地努妥昔单抗(Dinutuximab)、贝伐单抗、帕博利珠单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗(Infliximab)、奥滨尤妥珠单抗、本妥昔单抗、瑞西巴库单抗、贝利木单抗、伊匹单抗、地诺单抗、奥法木单抗、贝索单抗、托珠单抗、卡那奴单抗(Canakinumab)、戈利木单抗、乌司奴单抗(Ustekinumab)、赛妥珠单抗、卡妥索单抗、依库珠单抗、雷珠单抗(Ranibizumab)、帕尼单抗、那他珠单抗、卡妥索单抗、贝伐单抗、奥马珠单抗、西妥昔单抗、依法利珠单抗、替伊莫单抗、法索单抗、托西莫单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、耐昔妥珠单抗、巴利昔单抗、利妥昔单抗、卡罗单抗、沙妥莫单抗、莫罗莫那等。

可用于本公开的示例性Fc-融合蛋白包括依那西普、阿法赛特、阿巴西普、利纳西普、罗米司亭、贝拉西普、阿柏西普等。

术语“层析”是指将感兴趣的分析物(例如含有Fc结构域的蛋白质例如免疫球蛋白)与混合物中存在的其他分子分离开的任何种类的技术。通常，所述感兴趣的分析物与其他分子分离开是作为混合物的各个分子在移动相的影响下或在结合和洗脱过程中通过固定介质迁移的速率不同的结果。

本公开中使用的术语“蛋白A”涵盖了从天然来源回收的蛋白A、合成(例如通过肽合成或通过重组技术)生产的蛋白A及其功能性变体。蛋白A对Fc结构域表现出高亲和性。蛋白A可以从Repligen、Pharmacia和Fermatech商购。蛋白A通常被固定在固相支持材料上。术语“蛋白A”也指含有共价附连有蛋白A的层析固体支持基质的亲和层析树脂或柱。

“缓冲液”是一种通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗pH变化的溶液。取决于例如所需的缓冲液pH，可以使用的各种不同缓冲液描述在《缓冲液，生物系统中的缓冲液的制备和使用指南》(Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers inBiological Systems，Gueffroy,D.主编，Calbiochem Corporation,1975)中。在要求保护的公开内容的方法的某些步骤中，缓冲液具有2.0至4.0或2.8至3.8范围内的pH。在要求保护的公开内容的其他步骤中，缓冲液具有5.0至9.0范围内的pH。在要求保护的公开内容的其他步骤中，缓冲液具有4.0至6.5范围内的pH。在要求保护的公开内容的方法的又一些其他步骤中，缓冲液具有低于4.0的pH。将pH控制在这个范围内的缓冲剂的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲剂以及它们的组合物。术语“pH调节剂”是能够在水性溶液中产生约1.0至约14.0之间的所选pH的缓冲溶液。pH调节剂可以是乙酸盐缓冲剂例如NaAc和/或HAc、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或Tris-HCl。

术语“清洗缓冲液”是指在载样后和洗脱前用于清洗层析柱的缓冲液。

术语“洗脱缓冲液”是指用于从固相上洗脱靶蛋白的缓冲液。洗脱缓冲液的电导率和/或pH通常使所述靶蛋白从层析树脂上洗脱。

材料

三水合乙酸钠、氯化钠、氢氧化钠、三(羟甲基)氨基甲烷、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自Merck(Darmstadt,Germany)。乙酸、L-组氨酸、L-组氨酸单盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸和盐酸(6.0N溶液)购自J.T.Baker,Millipore(Bedford,MA,America)。咪唑购自Sigma(Saint Louis,America)。

设备

将安装有Unicorn软件6.3版的AKTA pure 150系统(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)用于所有层析运行。pH和电导率使用SevenExcellence S470 pH/电导率计(Mettler-Toledo,Columbus,OH,USA)测量。蛋白质浓度使用NanoDrop One分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)测量。将Agilent 1260液相色谱仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)用于SEC-HPLC分析。

方法

蛋白A/Capto Blue层析

将Eshmuno A(蛋白A亲和介质)/Capto Blue(high-sub)装填在0.5cm直径的柱中，床高度为15cm。柱体积(CV)约为3ml。载样物是澄清过的培养收获物。对于所有运行来说，将柱载样并以结合-洗脱模式运行。用洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。对于所有运行来说，在载样后，在洗脱之前将柱用不同缓冲液清洗3CV。对于所有层析运行来说，系统以180cm/hr的流速运行(停留时间：5min)。所有层析图通过在280nm处监测UV吸收来记录。将来自于所选运行的洗脱液分部收集，并通过获得单体纯度的SEC-HPLC、HCP和/或PLBL2测定进行分析。体积排阻色谱法-高效液相色谱(SEC-HPLC)

所有样品使用Tosoh TSKgel G3000SWxl不锈钢柱(7.8x300mm)进行分析。每次运行进样100μg样品。流动相由50mM磷酸钠、300mM氯化钠组成，pH 6.8。每个样品以1.0mL/min的流速等度洗脱20min。通过280nm处的UV吸收监测蛋白质洗脱。将对应于单体和聚集体的峰积分，以计算每种物质的百分率。

宿主细胞蛋白(HCP)测定

残留CHO宿主细胞蛋白的确定使用来自于Cygnus Technologies的CHO宿主细胞蛋白F550试剂盒来实现。将含有CHO HCP的样品同时与HRP标记的抗CHO抗体和包被在微量滴定条板中的抗CHO捕获抗体反应。免疫反应导致形成固相抗体-HCP-酶标抗体的夹心复合物。然后将底物TMB与HRP反应。终止反应并在450nm和650nm读取OD值。确定的OD值与样品中存在的CHO HCP的浓度成正比，以确定样品中存在的残留CHO宿主细胞蛋白的水平。

仓鼠磷脂酶B样蛋白2(PLBL2)测定

使用来自于MyBioSource的仓鼠磷脂酶B样蛋白2(PLBL2)ELISA试剂盒分析样品。在这个测定法中，样品中存在的PLBL2与吸附到聚苯乙烯微量滴定板孔表面的抗PLBL2抗体反应。在通过清洗除去未结合的蛋白后，添加检测抗体生物素偶联的抗PLBL2抗体并形成复合物。在清洗步骤后，添加辣根过氧化物酶(HRP)偶联的链亲合素并形成复合物。在另一个清洗步骤后，通过添加TMB来测定所述复合物。从标准品构建标准曲线，测试样品中PLBL2的量可以从所述标准曲线内推并针对样品稀释度进行校正。

本公开提供了一种在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的方法，所述方法包括下述步骤：

1)将蛋白质样品装载到亲和层析柱上，

2)用包含至少一种式I的化合物和pH调节剂的清洗缓冲溶液清洗所述柱，

其中R

在一个实施方式中，所述组合物包含组氨酸和/或咪唑。

本公开还公开了一种在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的方法，所述方法包括下述步骤：

1)将蛋白质样品装载到亲和层析柱上，

2)用包含丝氨酸和/或半胱氨酸和pH调节剂的清洗缓冲溶液清洗所述柱。

在一个实施方式中，所述亲和层析选自蛋白A层析、Capto Blue(High Sub)层析、蛋白G层析、蛋白L层析、Lambda Fab Select层析、Kappa Select层析、lg Select层析、BlueSepharose层析、Capto肝素层析、VII Select层析、VIII Select层析、XSelect层析和CaptoL层析。

在一个实施方式中，所述pH调节剂包含乙酸盐缓冲剂例如NaAc和/或HAc、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或Tris-HCl。

在一个特定实施方式中，所述化合物的摩尔质量在所述清洗缓冲溶液的体积中的百分率为约100mM和更高，优选为约100mM至约1M，更优选为约100mM至约900mM、100mM至约800mM、100mM至约700mM、100mM至约600mM、100mM至约500mM、100mM至约400mM、100mM至约300mM、100mM至约200mM、200mM至约1M、300mM至约1M、400mM至约1M、500mM至约1M、600mM至约1M、700mM至约1M、800mM至约1M、900mM至约1M、250mM至约750mM或500mM。

在一个特定实施方式中，所述清洗缓冲溶液的pH为约pH5.5或更低、pH5或更低、pH4.5或更低、pH4或更低、pH3.5或更低、pH3或更低。

在另一个实施方式中，上述方法在步骤2)之后不包括洗脱步骤。

在一个特定实施方式中，所述蛋白质样品是抗体例如单克隆抗体或融合蛋白。所述融合蛋白是含有可以被蛋白A识别的Fc结构域的Fc-融合蛋白。所述Fc-融合蛋白由连接到感兴趣的肽或蛋白质的IgG的Fc结构域组成。在另一个特定实施方式中，所述融合蛋白是HAS(人血清白蛋白)-融合蛋白。所述HAS-融合蛋白由连接到感兴趣的肽或蛋白质的HAS组成。

在一个特定实施方式中，所述杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)。

一方面，本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的组合物，其中所述组合物包含至少一种式I的化合物：

其中R

本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的组合物，其中所述组合物包含丝氨酸和/或半胱氨酸。

在一个实施方式中，所述亲和层析选自蛋白A层析、Capto Blue(High Sub)层析、蛋白G层析、蛋白L层析、Lambda Fab Select层析、Kappa Select层析、lg Select层析、BlueSepharose层析、Capto肝素层析、VII Select层析、VIII Select层析、XSelect层析和CaptoL层析。

本公开提供了所述组合物的用途，其用于制备在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的清洗溶液。

另一方面，本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有式I的化合物的组合物：

其中R

本公开提供了一种用于在蛋白质纯化中通过亲和层析来提高杂质去除的试剂盒，其中所述试剂盒包含丝氨酸和/或半胱氨酸。

实施例

实施例1：组氨酸清洗溶液与其他清洗溶液的比较

将美国专利号6,090,382中所公开的用于表达抗hTNFα抗体的cDNA序列克隆到分别含有杀稻瘟菌素和博来霉素(Zeocin)抗性标记的两个载体中。使用脂质体进行稳定转染。在转染后，将细胞在选择培养基(含有9μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博来霉素的CD CHO培养基)中传代，用于合并物选择。在合并物选择约2周后，通过FACS分拣克隆所述合并物。通过旋转管中的分批补料培养来筛选克隆。将选出的细胞克隆培养，并从含有抗hTNFαIgG4的细胞培养物中澄清收获物。

在本实施例中，评估了在亲和层析期间含有组氨酸的清洗溶液对从来自于含IgG4(抗hTNFα)细胞培养物的澄清收获物中去除杂质的影响。具体来说，比较了三种清洗溶液：一种含有1M NaCl，pH 5.5，第二种含有0.5M组氨酸，pH 5.5，第三种含有0.5M精氨酸，pH5.5。

通过离心从含有IgG4的细胞培养上清液收获澄清收获物，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照下面表1中描述的条件将其纯化。载样容量为30g/L。

表1.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用表2中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液示出在表2中。

表2.用于第二次清洗的具有不同组分的清洗溶液

使用三种不同清洗溶液进行的单克隆抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在表3中。

表3.组氨酸清洗溶液与其他清洗溶液的比较

如表3中所示，结果证实不同的清洗2溶液对步骤得率和聚集体水平没有影响，并在同时维持较高的产物回收率。此外还应该注意到，与对照相比，NaCl清洗没有显示出HCP的显著减少。然而，组氨酸和精氨酸清洗溶液与NaCl清洗和对照相比显示出显著的HCP和PLBL2去除。此外，组氨酸在HCP去除方面显示出与精氨酸溶液相近的能力，而组氨酸清洗尚未被报道过。具体来说，组氨酸清洗产生>95％的可接受的回收率，同时与对照相比，HCP减少了2.5倍。

实施例2：清洗溶液中不同组氨酸浓度的比较

在本实施例中，研究了在亲和层析期间含有组氨酸的清洗溶液对从含有IgG4的细胞培养物中去除杂质的影响。比较了清洗2溶液中四种不同的组氨酸浓度。

通过离心收获含有IgG4的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照表2中描述的条件将其纯化。

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用下面的表5中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液阐述在下面的表4中。

表4.用于清洗2的具有不同组氨酸浓度的清洗溶液

使用含有四种不同浓度的组氨酸的清洗溶液进行的单克隆抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在表5中。

表5.用于清洗2的不同组氨酸浓度的比较

如表5中所示，结果证实，与不含组氨酸的缓冲液相比，含有组氨酸的清洗溶液对得率没有影响。此外，显然组氨酸溶液高效地除去HCP和PLBL2。清洗溶液的组氨酸浓度越高，洗出液合并物中的HCP和PLBL2浓度越低。具体来说，在pH5.5下，与不含组氨酸的缓冲液相比，使用700mM高浓度的含组氨酸清洗溶液可导致HCP减少3倍和PLBL2减少至少4倍。

实施例3：清洗溶液中不同咪唑浓度的比较

在本实施例中，研究了在亲和层析期间含有咪唑的清洗溶液对从含有IgG4的细胞培养物中去除杂质的影响。具体来说，比较了四种不同浓度的清洗溶液。

通过离心收获含有IgG4的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照表6中描述的条件将其纯化。

表6.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用下面的表7中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过在同一细胞系上开发的酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液阐述在表8中。

表7.用于清洗2的具有不同咪唑浓度的清洗溶液

使用含有4种不同浓度咪唑的清洗溶液进行的单克隆抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在表8中。

表8.清洗溶液中不同咪唑浓度的比较

如表8中所示，结果证实，与不含咪唑的缓冲液相比，含有咪唑的清洗溶液对步骤得率没有影响。此外，显然含有咪唑的溶液高效地除去HCP和PLBL2。清洗溶液的咪唑浓度越高，会导致洗出液合并物中的HCP浓度越低。具体来说，在pH5.5下，与不含咪唑的缓冲液相比，使用700mM高浓度的含咪唑清洗溶液导致HCP减少3倍和至少PLBL2减少4倍。比较在最后一个表中示出的数据，显然咪唑(一种芳香族杂环，组氨酸的官能团)与组氨酸相比在除去HCP方面更加高效。

实施例4：在含组氨酸清洗溶液中酸性与碱性和生理pH的比较

在本实施例中，研究了在亲和层析期间含有咪唑的清洗缓冲液的pH对从含有IgG4的细胞培养物中去除杂质的影响。具体来说，比较了四种不同pH的清洗溶液。

通过离心收获含有IgG4的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照下面表9中描述的条件将其纯化。

表9.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用下面的表10中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液阐述在下面的表10中。

表10.具有不同pH值的含有组氨酸的清洗溶液

使用三种不同pH的含有组氨酸的清洗溶液进行的单克隆抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在表11中。

表11.在含有组氨酸的清洗溶液中酸性与碱性和生理pH的比较

如表11中所示，与不含组氨酸的清洗溶液相比，将pH从酸性(pH5.0)改变到碱性(pH 9.0)对得率和聚集体水平没有影响。显然所述基于组氨酸的溶液在低pH下显著高效地除去HCP，强调了含有组氨酸的清洗溶液在酸性pH下对亲和层析的功效。此外，在这种情况下，显然单独的组氨酸即可导致所需的HCP去除，并且它只在与低pH组合时有效。

实施例5：在含有咪唑的清洗缓冲液中酸性与碱性和生理pH的比较

在本实施例中，研究了在亲和层析期间含有咪唑的清洗缓冲液的pH对从含有IgG4的细胞培养物中去除杂质的影响。具体来说，比较了四种不同pH的清洗溶液。

通过离心收获含有IgG4的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照表12中描述的条件将其纯化。

表12.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用下面的表14中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液阐述在下面的表13中。

表13.具有不同pH值的含有咪唑的清洗溶液

使用三种不同pH的含有组氨酸的清洗溶液进行的单克隆抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在表14中。

表14.在含有咪唑的清洗溶液中酸性与碱性和生理pH的比较

如表14中所示，与不含咪唑的清洗溶液相比，将pH从酸性(pH5.0)改变到碱性(pH9.0)对得率和聚集体水平没有影响。显然所述基于咪唑的溶液在低pH下显著高效地除去HCP，强调了含有咪唑的清洗溶液在酸性pH下对亲和层析的功效。此外，在这种情况下，显然单独的咪唑即可导致所需的HCP去除，并且它只在与低pH组合时有效。

实施例6：组氨酸清洗溶液与其他氨基酸清洗的比较

在本实施例中，评估了在亲和层析期间含有组氨酸的清洗溶液对从含有IgG4的细胞培养物中去除杂质的影响。具体来说，比较了七种清洗溶液。

通过离心收获含有IgG4的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照下面表15中描述的条件将其纯化。

表15.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用表16中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液示出在表17中。

表16.用于第二次清洗的具有不同组分的清洗溶液

使用七种不同清洗溶液进行的单克隆抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在下面的表17中。

表17.用于IgG4抗体的不同清洗溶液的比较

如表17中所示，结果证实与对照相比组氨酸和精氨酸显示出显著的HCP去除。此外，与对照相比半胱氨酸和丝氨酸也显示出HCP去除。

实施例7：用于双特异性抗体的不同清洗溶液的比较

将WO 2019/057124A1中所公开的用于表达双特异性抗CD3×CD19抗体的cDNA序列克隆到分别含有杀稻瘟菌素和博来霉素抗性标记的两个载体中。使用脂质体进行稳定转染。在转染后，将细胞在96孔板中在选择培养基(含有9μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博来霉素(Zeocin)的CD CHO培养基)中铺板，用于微量合并物选择。在微量合并物选择约2周后，将高产的微量合并物单独扩增。通过一轮FACS克隆所述微量合并物，并通过旋转管中的分批补料培养来筛选克隆。将选出的细胞克隆培养，并从含有双特异性抗CD3×CD19抗体的细胞培养物中澄清收获物。

在本实施例中，评估了在亲和层析期间含有组氨酸/咪唑的清洗缓冲液对从含有双特异性抗体的细胞培养物中去除杂质的影响。

通过过滤收获含有双特异性抗体的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照下面表18中描述的条件将其纯化。

表18.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用表19中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液示出在下面的表19中。

表19.用于第二次清洗的具有不同组分的清洗溶液

使用不同清洗溶液进行的双特异性抗体的蛋白A纯化的过程性能示出在下面的表20中。

表20.清洗溶液组分对纯化过程性能的影响的比较

如表20中所示，结果证实不同的清洗2溶液对步骤得率和聚集体水平没有影响，并在同时维持较高的产物回收率。此外，使用浓度为500mM的含有组氨酸的清洗溶液导致与对照相比HCP减少2.5倍和PLBL2减少2倍。

实施例8：组氨酸/咪唑清洗溶液与其他清洗溶液的比较

用于表达靶向PD1的单克隆抗体(派姆单抗)的cDNA序列公开在专利申请号WO2008/156712A中。用于表达靶向VEGF的融合蛋白(Eylea)的cDNA序列公开在美国专利号7,070,959B1中。将所述cDNA序列克隆到分别含有杀稻瘟菌素和博来霉素抗性标记的两个载体中。使用脂质体进行稳定转染。在转染后，将细胞在选择培养基(含有9μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博来霉素的CD CHO培养基)中传代，用于合并物选择。在合并物选择约2周后，通过FACS分拣克隆所述合并物。通过旋转管中的分批补料培养来筛选克隆。将选出的细胞克隆培养，并从含有抗PD1 IgG4或抗VEGF融合蛋白的细胞培养物中澄清收获物。

在本实施例中，评估了在亲和层析期间含有咪唑的清洗缓冲液对从来自于含有抗PD1 IgG4或抗VEGF融合蛋白的细胞培养物的澄清收获物中去除杂质的影响。具体来说，比较了四种清洗溶液：一种含有1M NaCl，pH 5.5，第二种含有0.5M组氨酸，pH 5.5，第三种含有0.5M精氨酸，pH 5.5，第四种含有0.5M咪唑，pH 5.5。

通过离心从含有抗PD1 IgG4或抗VEGF融合蛋白的细胞培养上清液收获澄清收获物，并使用AC柱、特别是蛋白A柱(Millipore，Eshmuno A，1CV：3mL)，按照下面表21中描述的条件将其纯化。载样容量对于抗PD1 IgG4来说是30g/L，对于抗VEGF融合蛋白来说是19g/L。

表21.用于蛋白A柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用表22或23中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，然后在低pH下洗脱。通过UV 280分析洗出液的抗体或融合蛋白浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液示出在表22或23中。

表22.用于第二次清洗的具有不同组分的清洗溶液(抗PD1 IgG4)

表23.用于第二次清洗的具有不同组分的清洗溶液(抗VEGF融合蛋白)

使用四种不同清洗溶液进行的抗PD1 IgG4和抗VEGF融合蛋白的蛋白A纯化的过程性能分别示出在表24和25中。

表24.组氨酸清洗溶液与其他清洗溶液的比较(抗PD1 IgG4)

表25.组氨酸清洗溶液与其他清洗溶液的比较(抗VEGF融合蛋白)

如表24和25中所示，结果证实不同的清洗2溶液对步骤得率和聚集体水平没有影响，并在同时维持较高的产物回收率。此外，应该注意到与对照相比，NaCl清洗未显示出HCP的显著减少。然而，与NaCl清洗和对照相比，组氨酸和咪唑清洗溶液显示出显著的HCP去除。此外，组氨酸和咪唑在HCP去除方面显示出与精氨酸溶液相近的能力。

实施例9：用于HAS(人血清白蛋白)融合蛋白的不同清洗溶液的比较

使用本领域技术人员熟知的技术，将美国专利申请号15/557358中公开的用于表达抗CD40 HSA融合蛋白的cDNA序列(参见SEQ ID NO：145)克隆并在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。

在本实施例中，研究了在亲和层析期间含有组氨酸或咪唑的清洗缓冲液的浓度和pH对从含有HSA融合蛋白的细胞培养物中去除杂质的影响。具体来说，比较了具有不同pH的四种不同浓度的清洗溶液(0.1M、0.3M、0.5M和0.7M)。

通过离心加上深度过滤收获含有HSA融合蛋白的澄清的细胞培养上清液，并使用AC柱、特别是Capto Blue(High Sub)柱(1CV：3mL)，按照表26中描述的条件将其纯化。

表26.用于Capto Blue柱的操作条件

向平衡过的柱装载澄清收获物，并首先用清洗1溶液清洗，随后用下面的表27中描述的清洗2溶液进行第二次清洗，随后是第三次清洗，然后用洗脱缓冲液洗脱。通过UV 280分析洗出液的浓度，通过分析型体积排阻色谱法(SEC)分析HMW/LMW，并通过酶联免疫吸附测定法分析HCP含量。所比较的用于第二次清洗的各种不同清洗溶液阐述在表27中。

表27.用于清洗2的具有不同组氨酸/咪唑浓度的清洗溶液(HSA融合蛋白)

使用含有四种不同浓度的组氨酸或咪唑的清洗溶液进行的HAS-融合蛋白的CaptoBlue纯化的过程性能示出在表28中。

表28.清洗溶液中不同组氨酸/咪唑浓度/pH的比较

正如在表28中所示，结果证实组氨酸和咪唑溶液在去除HCP方面显著高效。清洗溶液的更高组氨酸和咪唑浓度导致洗出液合并物中更低的HCP。含有组氨酸或咪唑的清洗溶液的更高pH导致洗出液合并物中更低的HCP，但步骤得率也更低。