益母草碱在用于制备防治间歇性跛行的药物中的应用

摘要

本发明提供了益母草碱在用于制备防治间歇性跛行的药物中的应用。本发明将益母草碱作为有效成分与辅料混合后制成分散片或其他给药剂型，并利用实验验证利用益母草碱制备成的分散片的分散均匀性好，均能在3分钟内完全崩解，同时还证明了益母草碱能够有效对抗血管收缩、并恢复间歇性跛行动物腿部肌肉的抗疲劳功能，且具有靶向抑制PDE酶活性来改善治疗间歇性跛行，因此益母草碱及其作为有效成分制备的药剂具有很好的应用在防治间歇性跛行中的作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及益母草碱在用于制备防治间歇性跛行的药物中的应用。

背景技术

间歇性跛行是指患者从开始走路，或走了一段路程以后一般为数百米左右，出现单侧或双侧腰酸腿痛，下肢麻木无力，以至跛行，但稍许蹲下或坐下休息片刻后，症状可以很快缓解或消失；病人仍可继续行走，但再走一段时间后，上述症状会再度出现，因为在这一过程中，跛行呈间歇性出现，故称为间歇性跛行。

间歇性跛行的出现主要是由于在腰椎管已有狭窄的病理基础上，因直立时椎体及神经根的压力负荷增大，再加上行走时下肢肌肉的舒缩活动进一步促使椎管内相应脊神经节的神经根部血管生理性充血，继而静脉癖血以及神经根受牵拉后，相应部位微循环受阻而出现缺血性神经根炎，从而出现腰腿疼痛、下肢麻木、无力等症状。当患者蹲下、坐下或平卧休息后，神经根的压力负荷降低，消除了肌肉活动时的刺激来源，脊髓及神经根缺血状态得以改善，因此症状也随之减轻、消失。但再行走时，上述症状会再度出现，再休息，症状再缓解，如此反复，交替出现，形成了间歇性跛行。它是腰椎管狭窄症的主要临床特点之一。在有主动脉缩窄的病变时，由于缩窄一下供血不足，下肢血压下降，而出现下肢无力、麻木、发凉，甚至有间歇性跛行，这一点可以归为血管性间歇性跛行。

西医中常用的间歇性跛行治疗药物是西洛他唑(一种磷酸二酯酶3抑制剂)，其可阻断cAMP代谢而提升血液中cAMP的浓度，造成血管扩张的治疗效果，但是西洛他唑的副作用明显，包括头痛、异常粪便、腹泻、晕眩、及心悸。中医常使用具有息风化痰、化癖通络的牛黄、穿山甲等药物，除湿、化痰之慧米、瓜萎等及宣通阳气之桂枝等进行治疗或预防，但该类药物的特点是远期效果不理想，疗效不确切。

发明内容

本发明的目的在于提供了益母草碱在用于制备防治间歇性跛行的药物中的应用。所述益母草碱靶向抑制PDE酶活性，能够显著的治疗间歇性跛行，并起到显著的镇痛的作用，通过益母草碱与辅料混合制成益母草碱分散片无任何毒副作用、治疗效果好。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了益母草碱在用于制备防治间歇性跛行的药物中的应用。

进一步的，本发明通过构建间歇性跛行大鼠模型，并通过相关实验验证了所述益母草碱具有显著的镇痛效果，且还能够通过显著恢复间歇性跛行动物的腿部肌肉的收缩力，抵抗其腿部肌肉疲劳来改善和治疗间歇性跛行。

进一步的，所述益母草碱能够显著抑制间歇性跛行动物腿部的PDE酶活性。

进一步的，所述益母草碱能够有效抑制血管收缩，并有效对抗血管聚集血小板上清导致的动物股动脉血管痉挛。

进一步的，所述益母草碱能够靶向抑制PDE酶活性，与PDE蛋白之间具有相互结合作用。

进一步的，所述益母草碱的实验动物使用剂量为2-180mg/kg/d。

进一步的，将所述益母草碱防治间歇性跛行的药物的有效剂量推算至临床成人的给药剂量为10-800mg/d。

进一步的，所述益母草碱的实验动物使用剂量为10-180mg/kg/d。

进一步的，所述益母草碱还包括其药学上可接受的盐。

进一步的，防治间歇性跛行的药物，是将所述益母草碱与辅料混合制成的益母草碱分散片或片剂、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂、气雾剂。

进一步的，所述益母草碱分散片包括如下重量份的组分：益母草碱5-12份、固体分散体30-60份、填充剂60-90份、崩解剂8-15份、润滑剂3-8份、矫味剂1-3份。

进一步的，所述益母草碱分散片包括如下重量份的组分：益母草碱12份、固体分散体40份、填充剂60-80份、崩解剂10-12份、润滑剂4-6份、矫味剂2份。

进一步的，所述益母草碱分散片包括如下重量份的组分：益母草碱12份、固体分散体40份、填充剂80份、崩解剂11份、润滑剂5份、矫味剂2份。

进一步的，所述固体分散体为水溶性载体材料，包括PEG-6000、PEG-4000、泊洛沙姆188、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、聚乙烯氧化物中的至少一种。

最优的，所述固体分散体为水溶性载体材料PEG-6000。

进一步的，所述填充剂包括微晶纤维素、甘露醇、乳糖、糊精、可压性淀粉中的至少一种。

最优的，所述填充剂为微晶纤维素和乳糖。

进一步的，所述崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代轻丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

最优的，所述崩解剂为交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和羧甲基淀粉钠或交联聚乙烯吡咯烷酮和低取代轻丙基纤维素(L-HPc)。

进一步的，所述润滑剂包括微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、玉米淀粉中的至少一种。

进一步的，所述的矫味剂包括甘露醇、甜菊素、阿司帕坦中的至少一种。

进一步的，所述益母草碱分散片包括如下重量份的组分：益母草碱12份、PEG-600040份、微晶纤维素40份、乳糖40份、L-HPc 5.5份、PVPP 5.5份、硬脂酸镁2.5份、微粉硅胶2.5份、阿斯帕坦2份。

进一步的，所述益母草碱分散片的制备方法为：首先按照处方量称取各组分，首先将益母草碱粉碎至粒径1-10μm，再将固体分散体高温水浴熔融后与粉碎的益母草碱搅拌均匀，迅速倾出，并移至超低温冷冻固化，粉碎、过筛后，加入填充剂、崩解剂、润滑剂和矫味剂，混匀后直接压片即可。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明制备的益母草碱分散片分散均匀性好，能在3分钟内完全崩解，且溶出度高，而且本发明的益母草碱分散片能更好保持药物含量的稳定，增加其中有效成分益母草碱的利用度和溶出量，因此本发明的益母草碱分散片具有分散状态佳、崩解时间短、药物溶出迅速、吸收快、生物利用度高、不良反应少、服用方式多样及携带方便，尤其适合老年人和吞咽困难患者等优点。本发明还验证到益母草碱具有很好的镇痛效果，并恢复间歇性跛行动物腿部肌肉的收缩力，有效对抗其肌肉疲劳，且具有靶向抑制PDE酶的功效，与临床用药西洛他唑效果相当，但无毒副作用，因此将益母草碱作为有效成分，制备成其他给药剂型，能够很好的应用于防治间歇性跛行，具有很好的使用前景。

附图说明

图1为益母草碱与PDE酶的生物大分子SPR相互结合活性结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1：益母草碱分散片的制备

本发明所述的益母草碱分散片包括如下组分：

益母草碱分散片的制备方法为：按上述配比称取原辅料；将益母草碱粉碎至粒径1-10μm后，与PEG-6000混合，采用常规熔融法制备固体分散体；或采用如下操作步骤：将PEG6000于80℃恒温水浴熔融，加入益母草碱后搅拌均匀，迅速倾出，并移至-20℃下冷冻固化，然后取出干燥，经粉碎、过筛后备用；将制备得到的固体分散体再次粉碎，过80目筛后与微晶纤维素、乳糖、L-HPc、PVPP、阿斯帕坦、硬脂酸镁和微粉硅胶混匀后直接压片，压制成1000片，得到益母草碱分散片。

实施例2：益母草碱分散片的制备

本发明所述的益母草碱分散片包括如下组分：

益母草碱分散片的制备方法为：按上述配比称取原辅料；将益母草碱粉碎至粒径1-10μm后，与泊洛沙姆188混合，采用熔融法制备固体分散体；然后将制备得到的固体分散体粉碎，过80目筛后与微晶纤维素、乳糖、L-HPc、PVPP、阿斯帕坦、硬脂酸镁和微粉硅胶混匀后直接压片，压制成1000片，得到益母草碱分散片。

实施例3：益母草碱分散片的制备

本发明所述的益母草碱分散片包括如下组分：

益母草碱分散片的制备方法为：按上述配比称取原辅料；将益母草碱粉碎至粒径1-10μm后，与PEG-4000混合，采用熔融法制备固体分散体；然后将制备得到的固体分散体粉碎，过80目筛后与微晶纤维素、乳糖、L-HPc、PVPP、阿斯帕坦、硬脂酸镁和微粉硅胶混匀后直接压片，压制成1000片，得到益母草碱分散片。

实施例4：益母草碱分散片的制备

本发明所述的益母草碱分散片包括如下组分：

益母草碱分散片的制备方法为：按上述配比称取原辅料；将益母草碱粉碎至粒径1-10μm后，与PEG-6000、泊格沙姆188混合，采用熔融法制备固体分散体；然后将制备得到的固体分散体粉碎，过80目筛后与微晶纤维素、乳糖、L-HPc、PVPP、阿斯帕坦、硬脂酸镁和微粉硅胶混匀后直接压片，压制成1000片，得到益母草碱分散片。

实施例5：益母草碱分散片的性质考察

对实施例1-4中制备得到的益母草碱分散片进行分散均匀性、体外溶出度试验检测，试验方法与结果如下：

1、分散均匀性试验：分别取4种不同的益母草碱分散片各6片，参照分散均匀性检查法，将益母草碱分散片加入15-25℃的100mL水中，振摇3分钟，观察分散片的崩解状态。结果如表1所示，4种益母草碱分散片都全部崩解并通过《中国药典》中规定的2号筛，表明本发明的益母草碱分散片具有很好的分散均匀性且符合药典要求。

表1分散均匀性试验结果

2、体外溶出度试验：按照药典溶出度测定法，采用转篮法，取上述分散均匀性试验制得的益母草碱分散水溶液，以1％十二烷基硫酸钠900ml为溶剂，转速50rpm，温度37℃±0.5℃，在试验开始后45min取样，将取得的样品利用高效液相色谱法测定其中益母草碱的含量，并计算出分散片的溶出度。

结果见表2，本发明制得的益母草碱分散片溶出度能达到57％以上。

由上述实验可知，本发明制备的益母草碱分散片符合药典对分散均匀性和体外溶出度的要求，表明本发明中分散片制备成功。

表2溶出度试验结果

实施例6：益母草碱分散片中辅料的考察

本实施例中，先将益母草碱粉碎至粒径1-10μm；

固体分散技术可将难溶性药物以分子、胶体、微晶或无定型状态高度分散于水溶性固体载体材料中，制得药物具有很大的分散度，同时由于载体材料的存在增加了药物的可润湿性，从而在与胃肠液接触后，可加快药物的溶出速度，促进药物的吸收，从而提高药物的生物利用度，达到高效和速效的目的。固体分散体载体的筛选：速释型固体分散体所用的载体多为水溶性高分子化合物，常用的有PEG-4000、PEG-6000、聚乙烯吡咯烷酮PVPP，泊格沙姆188。

本发明选择上述四种辅料进行固体分散体的筛选，并将溶出度作为评价指标。

1、PEG-4000、PEG-6000和泊格沙姆188样品的制备：分别取不同载体9份，于80℃恒温水浴熔融，分别加入益母草碱1份并搅拌30分钟后，迅速倾出，移至-20℃下冷冻固化，取出干燥，粉碎过80目筛，干燥保存。

2、PVPP样品的制备：称取益母草碱1份加适量无水乙醇，60℃搅拌使溶解；再称取9份PVPP，加入上述乙醇液中，60℃搅拌使溶解，回收乙醇，干燥、粉碎后过80目筛，干燥保存。

3、物理混合物的制备：按1∶9的重量比称取主药和载体进行混合，粉碎后过80目筛，然后混合均匀，干燥保存。

将上述的样品进行溶出度的测定，结果见表3，载体与主药相同比例条件下，PEG-6000对益母草碱的溶出度提高最大，因此PEG-6000是制备益母草碱分散片的辅料载体的最优选择。

表3水溶性载体的筛选

实施例7：益母草碱分散片对小鼠热板镇痛的影响

将雌性小鼠放在热板测痛仪上，筛选50只合格性小鼠(体重20g左右)，即预选5-30s内有痛反应的小鼠，若小鼠只舔后足时间小于5秒或者大于30秒均弃置。为防止小鼠足部烫伤，也应设截止时间，一般为60秒，以小鼠添后足反应的潜伏期为痛阈指标。随机取合格的40只雌性小鼠，分为5组，每组8只，分为模型组、阿司匹林片组、实施例1制备的益母草碱分散片低剂量组10mg/kg、中剂量组50mg/kg、高剂量组100mg/kg。各组均按照表4中的剂量灌胃给药，1次/天，连续给药2周，测定末次药后1小时、2小时发生添足反应的时间。

结果如表4所示，小鼠舔足反应潜伏期时间显示，与模型组比较，阿司匹林组可有效延长潜伏期的时间，表明模型可靠。各给药组的小鼠添足反应的潜伏期均有延长，且存在剂量依赖关系，高剂量组的潜伏期显著大于模型组，说明益母草碱分散片能够延长小鼠对热板刺激的添足反应潜伏期，其具有镇痛作用。

表4益母草碱分散片对热板小鼠实验的镇痛效果

注：与模型组比较，*p＜0.05。

实施例8：益母草碱分散片对间歇性跛行大鼠模型中的测试

本发明采用经典的间歇性跛行大鼠模型如下：腹腔注射40mg/kg戊巴比妥麻醉Wistar大鼠(9-10周)，手术将右股动脉结扎后，继续喂养一周，最后一天在小鼠断食过夜后，分别以10、50、180mg/kg的剂量把实施例1制备的益母草碱分散片冲服后给予大鼠作为低、中、高剂量组，而部分大鼠作为模型组则给予等量的生理盐水，在给药60分钟后，将每一只大鼠用0.4mg/kg乌拉坦和0.08mg/kg的α-氯醛糖腹腔注射麻醉。为了将胶原给药到动脉中，经大鼠的左颈动脉插入导管，使其末端位于髁动脉支点的近端；之后将大鼠置于俯卧状，把其右后腿剥皮以便暴露出腹胫骨-趾骨-趾肌肉，再将大鼠跟腱包扎，然后剪断，并连接在等轴张力测量仪上，以大约100g的静息张力保持其位置，暴露小鼠的坐骨神经，进一步通过双极电极，按矩形脉冲刺激(10V，0.5Ms，1Hz)，记录由电子刺激所产生的收缩力。

益母草碱分散片给药测试90分钟后，也就是当开始电子刺激坐骨神经后的5分钟，通过在20分钟内向腹主动脉不断注射(20g/kg/min)胶原溶液来诱导收缩力疲乏下降。在收缩力的测试过程中保持鼠温，以及用生理盐水进行保护避免暴露肌肉和坐骨神经干燥。关于测试益母草碱分散片的疗效，是在胶原注射20分钟后，根据所测量的收缩力而评价。

结果如表5表明，益母草碱分散片口服给以中、高剂量的药物，可强烈抑制由肌肉局部缺血所引起的大鼠腿部疲劳，这说明益母草碱分散片具有良好的治疗间歇性跛行的效果。

表5益母草碱分散片对肌肉收缩力的影响

实施例9：益母单碱分散片对间歇性跛行大鼠骨骼肌血管内PDE酶活性的影响

本发明采用经典的间歇性跛行大鼠模型如下：腹腔注射40mg/kg戊巴比妥麻醉Wistar大鼠(9-10周)，手术将右股动脉结扎后，继续喂养一周，最后一天在小鼠断食过夜后，分别以10、50、180mg/kg的剂量把实施例1制备的益母草碱分散片冲服后给予大鼠作为低、中、高剂量组，而部分大鼠作为模型组则给予等量的生理盐水，部分大鼠喂药西洛他唑；在给药60分钟后，将每一只大鼠用0.4mg/kg乌拉坦和0.08mg/kg的α-氯醛糖腹腔注射麻醉。为了将胶原给药到动脉中，经大鼠左颈动脉插入导管，使其末端位于髁动脉支点的近端，之后将大鼠置于俯卧状，把其右后腿剥皮以便暴露出腹胫骨-趾骨-趾肌肉。给药测试90分钟后，也就是当开始电子刺激坐骨神经后的5分钟，通过在20分钟内向腹主动脉不断注射(20g/kg/min)胶原溶液来诱导收缩力疲乏下降，然后迅速剥离血管，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。用蛋白质定量仪测定蛋白浓度，将其浓度用RIPA裂解液全部调平至20μg/ul，然后采用生化检测试剂盒测定PDE磷酸二酯酶的活性。

结果如表6表明，模型组大鼠的PDE酶活性显著增加，而各个给药组的PDE酶活性均与模型组相比显著降低，说明益母草碱分散片可有效抑制腿部PDE磷酸二酯酶的活性，这与临床药物西洛他唑的效果相当。西洛他唑目前已被用于治疗间歇性跛行，作为一种磷酸二酯酶抑制剂，其可阻断cAMP代谢而提升血液中cAMP的浓度，产生血管扩张的治疗效果，但是西洛他唑的副作用明显，包括头痛、异常粪便、腹泻、晕眩、及心悸。与西洛他唑相比，本发明中的益母草碱分散片能够作为一种副作用低且疗效明确的PDE抑制剂，有效防治间歇性跛行。

表6益母草碱分散片对大鼠腿部PDE酶活性的影响

注：与模型组相比较：

实施例10：益母草碱分散片对抗血管收缩的作用评价

以50mg/kg剂量向新西兰大白兔注射氯胺酮使其麻醉，然后向颈动脉中插入聚乙烯导管，用试管采集血样，其中试管含有适当量的抗凝剂柠檬酸钠。将采集的血样在1000rpm转速下离心15分钟，收集上层的富含血小板的血浆(PRP)。

向PRP中加入等量的缓冲液1(25mM Tris-HCl，130mM NaCl，1.5mM EDTA，pH 7.4)，然后在4℃下以3800rpm转速离心10分钟。将由此所得的血小板沉积物在缓冲液1中重悬，然后在4℃下3800rpm再离心5分钟，再将所得血小板沉积物在缓冲液II(25mM Tris-HCl，130mMNaCl，0.3mM EDTA，pH 7.4)中再次重悬，随即按同样条件离心。最后将所得血小板沉积物悬浮于缓冲液III(25mM Tris-HCl，130mM NaCl，0.1％葡萄糖，0.1％BSA，pH 7.4)中，由此得到了冲洗过的血小板悬浮液。

向所得被冲洗过的血小板悬浮也中加入1mM CaCl

另一方面，从已采集过血的新西兰大白兔切割股动脉。在立体视显微镜下制备螺旋条带制备物(长2厘米，宽1-2毫米)。在填充有已经用95％氧气+5％CO

当血管条带制备物放置大约1小时，等静息张力确认已经稳定后，用等长传感器测量血管条带制备物的张力。每一个血管条带制备物，再加入30mM KCl确认了收缩反应之后，将血管条带制备物用溶液冲洗，以使其张力恢复到先前水平。将血管条带制备物放置30分钟或更长时间，待稳定后，加入聚集过的血小板上清液以1∶100倍稀释。确认张力收缩后，分别以2μM和20μM浓度向Magnus圆筒中加入实施例1制备的益母草碱分散片或加入1μM的西洛他唑或加入等量的生理盐水，研究它们对抗收缩反应的松弛作用。

结果如表7可见，与模型组相比，各给药组的对抗系数均得到显著的提升，表明益母草碱分散片可以有效抑制已聚集过的血小板上清液所引起的血管收缩，且其效果与阳性药物西洛他唑相当。

表7益母草碱分散片对抗兔子收缩反应的松弛作用

注：与模型组比较，*p＜0.05。

实施例11：生物大分子仪检测益母草碱与PDE的相互结合

本发明验采用Biacore T200，固定蛋白的芯片为CM5芯片。首先是蛋白的预富集，将蛋白用pH 4.5，5.0，5.5的醋酸钠分别稀释到10μg·mL

本实验成功将PDE重组蛋白在最适pH5.0的条件下固定到CM5芯片上，实验检测1.5625、3.1250、6.250μmol·L

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。