益母草碱在制备用于防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物中的应用

摘要

本发明提供了益母草碱在制备用于防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物中的应用。本发明通过构建AD动物模型，验证了益母草碱能够改善AD动物的空间学习记忆和行为能力，抑制其皮层和海马区Tau蛋白的磷酸化，降低Aβ蛋白的聚集；还构建了感染性中枢神经损伤细胞模型，验证了益母草碱能够抑制LDH的释放、细胞色素c的释放和凋亡效应蛋白caspase‑3的表达并提高多巴胺信号通路的响应度、NQO1酶，逆转脂氧合酶LOX、糖原合酶激酶GSK3β以及PDE的酶活，因此本发明验证了益母草碱靶向PDE的新靶点和新机制，基于此验证了益母草碱在防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物中的新用途。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及益母草碱的新用途，具体涉及益母草碱在制备用于防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物中的应用。

背景技术

痴呆是指慢性获得性进行性智能障碍综合征，是一种综合病，临床上以缓慢出现的智能减退为主要特征，以老年斑、神经纤维缠结和神经元丢失为主要的病理改变。老年痴呆主要分为三大类：阿尔茨海默症、血管性痴呆以及继发性痴呆。

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性和不可逆的神经退行性变性疾病，是不同于血管性痴呆的最常见的痴呆类型，是老年人的常见病、多发病。AD起病隐匿，病情进行性加重，主要表现为进行性精神状态衰变，包括记忆、智力、定向、判断能力、情感障碍和行为失常等，甚至发生意识模糊。通常AD患者在起病2～3年后症状转为明显，5～10年内死于继发感染和全身衰竭。AD的病理学特征是临床确诊的重要依据，主要包括：神经元间由不溶性的β-淀粉样蛋白(amyloid beta-protein，Aβ)沉积形成老年斑(senileplaque，SP)、神经元内Tau蛋白高度磷酸化形成神经元纤维缠结(neurofibrillarytangle，NFT)、乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)能神经元变性和丢失等，这些病理改变一般发生在患者的大脑皮层、海马和前脑基底。AD已经严重威胁到老年人的健康，因其迅猛增加的医疗需求和照料负担也给患者、患者家庭和社会带来了巨大的压力，并成为继心血管疾病、肿瘤和脑卒中之后的第四大杀手，因此急需进行抗AD和治疗各种中枢神经元损伤的新药研发。

中草药益母草唇形科植物，最早收载于《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效。益母草常用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。益母草碱是传统中药益母草的特异成分，大量文献及专利已报道了益母草碱能够抑制血管平滑肌收缩，对心肌和脑缺血的有效保护作用；还被发现益母草碱可降低血脂，并有效改善血管性痴呆大鼠的认知障碍。

但迄今，尚未见有关所述益母草碱对AD、非血管性痴呆影响的有关报道，更未见益母草碱对病毒或细菌感染侵袭转移时神经元的作用的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了益母草碱在制备用于防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了益母草碱或其药学上可接受的盐在制备用于防治非血管性痴呆的药物中的应用。

进一步的，所述益母草碱的分子式为C

进一步的，所述非血管性痴呆为阿尔茨海默症、脑外伤性痴呆和脑瘤诱发性痴呆。

本发明通过构建经典AD动物模型，利用Morris水迷宫的定位航行实验和空间探索实验验证了所述益母草碱能够改善AD动物模型的空间学习记忆和行为能力，增加其自主与探究行为。

本发明还利用免疫组化、蛋白电泳、ELISA检测、生化检测以及酶活检测，进一步的验证了所述益母草碱能够有效抑制AD动物模型皮层和海马区Tau蛋白231位磷酸化，降低Aβ蛋白的聚集，进而降低老年斑的沉积。

进一步的，所述益母草碱能够增加AD动物模型脑内Ach和BDNF的含量。

进一步的，所述益母草碱能够增加AD动物模型脑内cAMP和dopamine的含量，提高PKA激酶酶活以及抑制磷酸二酯酶PDE的活性。

进一步的，分子对接实验验证了所述益母草碱与PDE蛋白之间具有相互作用。

进一步的，所述PDE蛋白的活性口袋部位是益母草碱的作用靶点。

本发明还提供了益母草碱或其药学上可接受的盐在制备用于防治感染性中枢神经损伤的药物中的应用。

进一步的，所述感染性中枢神经损伤是由病毒或/和细菌感染导致的中枢神经元细胞损伤。

进一步的，所述病毒为流感病毒；所述细菌为金黄色葡萄球菌。

本发明采用了灭活金黄色葡萄球菌和灭活流感病毒混合处理神经元细胞获得感染性中枢神经损伤细胞模型，利用免疫组化、蛋白电泳、ELISA检测、生化检测以及酶活检测，验证了所述益母草碱能够恢复损伤的中枢神经元细胞的细胞活力。

进一步的，所述益母草碱能够抑制感染性中枢神经损伤细胞模型的LDH的释放。

进一步的，所述益母草碱能够增加感染性中枢神经损伤细胞模型的多巴胺信号通路的响应度。

进一步的，所述益母草碱能够增加感染性中枢神经损伤细胞模型的NQO1酶、脂氧合酶LOX、糖原合酶激酶GSK3β的酶活。

进一步的，所述益母草碱能够抑制感染性中枢神经损伤细胞模型的细胞色素c的释放和凋亡效应蛋白caspase-3的表达。

进一步的，所述益母草碱的每日每kg的小鼠给药剂量为8-80mg。

进一步的，由所述益母草碱防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的有效剂量推算至临床每日成人的给药剂量为10mg-500mg。

本发明还提供了一种防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物，所述药物含有益母草碱或其药学上可接受的盐酸盐或硫酸盐。

进一步的，所述药物为益母草碱或其药学上可接受的盐的单组份，或与药学上可接受的载体或赋形剂组合而成的复方制剂。

进一步的，所述药物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过构建AD小鼠模型和感染性神经中枢损伤细胞模型，验证了益母草碱能够调整非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤中多条信号通路、蛋白的表达或酶的分泌、活力等，进而达到防治AD、感染性神经中枢损伤的目的，而且益母草碱无副作用，安全可靠，因此益母草碱有望成为或用于防治多种非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物或主要功效成分，为非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤提供新的治疗思路。本发明也是首次验证了益母草碱靶向PDE的新靶点和新机制，基于该新靶点和新机制验证了益母草碱在防治非血管性痴呆或感染性中枢神经损伤的药物中的新用途。

附图说明

图1为益母草碱对各组小鼠上平台的潜伏期(S)的影响。

图2为益母草碱对各组小鼠上平台的总路程的影响。

图3为益母草碱对各组动物进入C区和原平台区的次数的影响。

在图1-3中，与模型组相比较：

图4和图5：益母草碱与PDE酶的分子相互作用的结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

益母草碱(市售)，白色粉末，其分子式为C

实施例1：益母草碱改善AD小鼠的空间学习记忆能力和空间探索能力

30只小鼠随机分为5组，每组6只，分别为(1)假手术组；(2)模型组；(3)低剂量组(口服益母草碱8mg/kg)；(4)高剂量组(口服益母草碱80mg/kg)；(5)多奈哌齐组(口服多奈哌齐1.5mg/kg)。

用无菌生理盐水溶解淀粉样蛋白Aβ1-42，浓度为500μmol/L，在37℃保温箱中孵育5天后备用。小鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，并固定在脑立体定向仪上，常规消毒后切开小鼠头顶正中间皮肤，擦净并充分暴露颅骨中线和前囟，设置颅骨表面标志点(以前囟为零点，前囟后3.5mm、中线旁2.5mm)，用牙科钻在左右标志点各钻一孔，注射针进入颅骨表面下3.0mm，即为海马背侧部的注射点，在注射时左右两侧的海马均注射。模型组、低剂量组、高剂量组和多奈哌齐组均注射2.5μL的Aβ1-42，注射后留针2min；假手术组注射等剂量的生理压水，注射后留针2min。注射后，取出微量注射器，用牙科水泥封闭钻孔，缝合伤口、碘伏消毒。术后给所有的小鼠均肌肉注射青霉素钠盐连续注射5天。5天后，低剂量组按10mg/kg给小鼠口服益母草碱，高剂量组按80mg/kg给小鼠口服益母草碱，多奈哌齐组按1.5mg/kg给小鼠口服药物多奈哌齐，模型组和假手术组等量口服生理盐水，每日1次，口服3周。

给药结束后，进行Morris水迷宫实验测试小鼠的空间学习记忆能力、自主与探索行为。Morris水迷宫分为定位航行实验和空间探索实验两部分，第1-4天进行定位航行实验，第5天进行空间探索实验。

定位航行实验主要反映动物空间记忆的能力。第二、三、四天各组小鼠上平台所经过的潜伏期统计如表1和图1所示，各组小鼠上平台所经过的总路程统计如表2和图2所示。各组小鼠上平台的潜伏期结果显示，训练四天后，模型组与假手术组有统计学差异；同时假手术组和各给药组的潜伏期都比模型组显著缩短；训练第四天，高低剂量组小鼠上平台的时间与模型组对比具有显著差异，表明其学习能力得到明显增强。各组小鼠上平台所经过的总路程数据显示，训练4天后，假手术组和各给药物组动物上台前游泳的路程都缩短；训练第四天，模型组与假手术组上平台前游泳的总路程对比具有统计学差异，高低剂量组显著短于模型组，阳性药物多奈哌齐也具有统计学差异。综上所述，AD模型造模成功且给药物动物学习能力明显比模型组强，说明益母草碱能够改善以淀粉样蛋白斑块为特征的AD小鼠的空间学习记忆能力。

表1益母草碱对各组小鼠上平台的潜伏期(S)的影响

注：与模型组相比较：

表2益母草碱对各组小鼠上平台的总路程(米)的影响

注：与模型组相比较：

空间探索实验作为水迷宫实验中较为敏感而精确的评价指标，显示的是动物的记忆保持能力，进入目标象限和原平台区域的次数越多越好。C区为实验设定的目标象限。结果如表3和图3所示，模型组进入C区和原平台的次数与假手术组相比有显著性差异；给药组相比模型组进入目标象限和原平台的次数显著增加，这表明给药物组动物记忆保持能力比模型组要显著增强，说明益母草碱能够改善AD小鼠模型的记忆和行为能力，并增加其自主与探究行为。

表3益母草碱对小鼠空间探索能力的影响

注：与模型组相比较：

实施例2：益母草碱对AD小鼠皮层和海马区沉积的老年斑沉积的影响

采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，并快速取出脑组织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。用蛋白质定量仪测定蛋白浓度，再将蛋白浓度用RIPA裂解液全部调平至20μg/μL，按照每4μL蛋白样品加入1μL蛋白上样缓冲液(5X)的比例将两者混合，100℃或沸水浴加热3-5min，-20℃冰箱保存。蛋白变性后于仪器上进行蛋白Aβ表达含量和Tau蛋白磷酸化的检测。

实验结果如表4和表5所示，与假手术组相比，模型组小鼠的脑组织内Aβ的沉积和Tau蛋白231位磷酸化(p231)水平均显著增加，与实际相符。Aβ的沉积与老年斑的形成有关，而老年斑的沉积又与AD症状密切相关；Tau蛋白在AD等某些神经退行性疾病中起着关键作用。益母草碱和阳性药物多奈哌齐可有效抑制Aβ蛋白的表达量，同时减少Tau蛋白231位磷酸化水平，这表明益母草碱能够有效降低阿尔茨海默动物模型皮层和海马区沉积的老年斑，能够有效抑制抑制Aβ蛋白的聚集以及大脑中Tau蛋白过度磷酸化和神经元纤维缠结，对AD具有很好的治疗效果，而且益母草碱的作用效果还显示了一定的量效关系，其中以益母草碱高剂量组效果最优。

表4益母草碱对动物脑组织内Aβ表达水平的影响

注：与模型组相比较：

表5益母草碱对动物脑组织内Tau蛋白磷酸化水平的影响

注：与模型组相比较：

实施例3：益母草碱对AD小鼠脑内乙酰胆碱(Ach)和脑源性神经生长因子(BDNF)的影响

采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，并快速取出脑组织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检测Ach和BDNF的含量。

结果如表6所示，与假手术组相比，模型组小鼠脑内的Ach和BDNF的含量显著减少，而益母草碱高低剂量组和阳性药物多奈哌齐均可有效增加Ach和BDNF的含量，表明益母草碱可以显著改善AD动物模型的胆碱能神经的功能，并能够增加脑源神经营养因子的水平，进而有效改善小鼠的学习记忆功能障碍和神经元缺失，并可能修复已损伤的神经元，增加突触的可塑性，并增强神经内在生长能力，达到防治AD的目的。

表6益母草碱对AD小鼠脑内Ach和BDNF的影响

注：与模型组相比较：

实施例4：益母草碱对小鼠脑内的cAMP和dopamine含量、PKA激酶以及磷酸二酯酶PDE活性的影响

采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，并快速取出脑组织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检测cAMP和dopamine的含量，并采用生化方法检测PKA激酶的活性；采用PDE酶活检测试剂评价益母草碱对AD小鼠脑内的磷酸二酯酶PDE的影响。

结果如表7和表8所示，与假手术组相比，模型组小鼠脑内的cAMP和dopamine含量、PKA激酶活性显著减少，磷酸二酯酶PDE的活性显著增加，而益母草碱高低剂量组和阳性药物多奈哌齐均可明显增加了cAMP和dopamine含量、PKA激酶以及降低磷酸二酯酶PDE的活性，表明益母草碱可以显著增加动物脑内的cAMP和dopamine的水平，cAMP的增加可增强神经内在生长能力和加强营养因子的作用的关键因素；同时dopamine水平的提高可以显著改善动物的学习记忆功能障碍。此外，益母草碱还可有效增加cAMP下游PKA激酶的活性，通过PDE/cAMP途径强化长时程突触易化及长时程增强(long term potentiation，LTP)影响学习记忆过程，即通过升高cAMP水平和增强PKA活性来诱导晚期LTP，从而有效改善老年痴呆的认知功能和学习记忆缺陷，因此本发明首次验证了益母草碱作为PDE抑制剂的潜在功能，且益母草碱能够通过本发明所提出的新机制，即PDE-cAMP-PKA信号通路来发挥抗神经退行性疾病的显著疗效。

表7益母草碱对小鼠脑内cAMP和dopamine的影响

注：与模型组相比较：

表8益母草碱对小鼠脑内PDE酶活性的影响

注：与模型组相比较：

本发明还分别利用生物大分子相互作用仪和分子对接软件来验证了益母草碱与PDE蛋白的作用靶点，结果如图4和5所示，益母草碱与PDE的相互作用为-8.90kcal/mol，且PDE蛋白的活性口袋部位是益母草碱的作用靶点。

实施例5：益母草碱对病毒和细菌感染中枢神经元细胞活力和LDH释放的影响

本发明采用灭活金黄色葡萄球菌和灭活流感病毒混合处理神经元细胞，观察益母草碱对神经元损伤的保护作用。具体操作如下：将神经细胞SH-SY5Y接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和15％FBS)，置于37℃、5％CO

结果如表9所示，与空白组相比，模型组的细胞活力以及培养基中LDH的酶活力显著减少，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显提高SH-SY5Y的细胞活力以及LDH的酶活力，说明益母草碱可有效保护神经元细胞，恢复细胞的活力，显著抑制病毒或者细菌感染引起的乳酸脱氢酶的释放，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM的保护效果最好，且优于阿司匹林的作用效果。

表9益母草碱对病毒和细菌诱导产生的神经细胞毒的影响

注：与模型组相比较：

实施例6：益母草碱对病毒和细菌感染中枢神经元细胞多巴胺神经递质响应水平的影响

SH-SY5Y细胞是一种功能强大的神经元体外培养细胞，可被多巴胺等神经递质激活信号通路。

采用实施例5所述的细胞模型，药物与诱导剂(病毒和细菌)和细胞共孵育48小时，结束后，采用Westernblot法测定多巴胺受体的位点磷酸化水平。

结果(表10)可以看出，与空白组相比，模型组的多巴胺响应度显著下降，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显提高多巴胺响应度，说明益母草碱可显著逆转病毒和细菌感染神经元导致的多巴胺信号通路响应度的下降，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM用药组的增加效果最好，且明显优于阳性药物阿司匹林的效果。

表10益母草碱对病毒和细菌感染神经元细胞响应放多巴胺神经递质的影响

注：与模型组相比较：

实施例7：益母草碱对病毒和细菌感染中枢神经元细胞NQQ1活性的影响

采用实施例5所述的细胞模型，药物与诱导剂(病毒和细菌)和细胞共孵育48小时，结束后，采用荧光底物酶法测定NQO1的活性。

NQO1是表征细胞在病毒和细菌感染时细胞对其抵抗的功能指标，由结果(表11)可以看出，与空白组相比，模型组的NQO1酶活性显著降低，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显提高NQO1酶活性，说明益母草碱可有效逆转病毒和细菌感染神经元导致的NQO1酶活性的下降，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM用药组的增强效果最好，并显著优于阳性药物阿司匹林的效果。

表11益母草碱对病毒和细菌神经元细胞NQO1酶活力的影响

注：与模型组相比较：

实施例8：益母草碱对病毒和细菌感染中枢神经元细胞脂氧合酶活性的影响

采用实施例5所述的细胞模型，药物与诱导剂(病毒和细菌)和细胞共孵育48小时，结束后，收集低温蛋白裂解液，离心取上请，采用生化酶法测定脂氧合酶LOX的活性。

由结果(表12)可以看出，与空白组相比，模型组的LOX酶活显著升高，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显降低LOX酶活，说明益母草碱可显著逆转病毒和细菌感染神经元导致的脂氧合酶LOX活性的增加，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM用药组的抑制效果最好，并优于阳性药物阿司匹林组的效果。

表12益母草碱对病毒和细菌感染神经元细胞内脂氧合酶LOX活性的影响

注：与模型组相比较：

实施例9：益母草碱对病毒和细菌感染中枢神经元细胞GSK3β活性的影响

采用实施例5所述的细胞模型，药物与诱导剂(病毒和细菌)和细胞共孵育48小时，结束后，采用生化酶检测神经元细胞内糖原合酶激酶GSK3β的活性。

由结果(表13)可以看出，与空白组相比，模型组的GSK3β酶活性显著升高，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显降低GSK3β酶活，说明益母草碱可显著抑制病毒和细菌感染神经元导致的GSK3β激酶活性的增加，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM用药组的抑制效果最好。

表13益母草碱对病毒和细菌感染神经元细胞内GSK3β激酶活性的影响

注：与模型组相比较：

实施例10：益母草碱对病毒和细菌感染中枢神经元细胞线粒体细胞色素c外漏和caspase-3表达的影响

采用实施例5所述的细胞模型，药物与诱导剂(病毒和细菌)和细胞共孵育48小时，结束后，采用Western Blot的方法检测细胞质中细胞色素c(cytoC)与线粒体中细胞色素c的比值C％；并采用试剂盒检测caspase-3的活性。

结果如表14所示，与空白组相比，模型组的C％值显著上升，也就是说细胞色素c从线粒体中释放到了细胞质中，进而会导致线粒体膜电位下降，线粒体功能受障，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显降低C％值，说明益母草碱能够显著的抑制细胞色素c的释放，恢复神经元细胞线粒体的功能，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM用药组的抑制效果最好，且显著优于阳性药物阿司匹林的效果。

另外，与空白组相比，模型组的凋亡效应蛋白Caspase-3的表达水平增加，而益母草碱高低剂量组和阳性药物阿司匹林均可明显下调Caspase-3的表达，说明益母草碱能够显著抑制Caspase-3的表达，降低细胞的凋亡，从而增加细胞活力，并呈现一定的剂量依赖性，其中以益母草碱高剂量20μM用药组的抑制效果最好，且显著优于阳性药物阿司匹林的效果。

表14益母草碱对病毒和细菌感染神经元细胞质内细胞色素c和Caspase-3表达的影响

注：与模型组相比较：

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。