一种蔬菜中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯残留检测方法

摘要

本发明提供了一种蔬菜中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯残留检测方法，具体步骤如下：S1试样的制备；S2试样的称取；S3试样的提取；S4衍生反应。通过本发明的技术方案，确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯在番茄酱、黄瓜和姜中残留的提取和净化方法；异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯和9‑（甲氨甲基）蒽化学反应的反应介质、反应时间及衍生剂的量，及衍生产物的稳定性；在高效液相色谱串联质谱仪检测参数、高效液相色谱串联质谱仪法检测条件。本方法通过衍生反应改变了化合物的理化性质把酯类化合物转移到灵敏度更高的高效液相色谱串联质谱上检测。通过衍生反应改善了前处理的净化效果，提高了方法的专属性。降低了检测的灵敏度，提高了检测效率。

说明书

技术领域

本发明涉及农残检测技术领域，具体而言，特别涉及一种蔬菜中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯残留检测方法。

背景技术

异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯属于异硫氰酸酯（R—N＝C＝S）类物质，是一类含硫化合物。其结构如图1。在十字花科植物如白花菜、南美金莲花科、番木瓜科、辣木科、车前科等，尤以芸薹属中广泛存在一种硫代葡萄糖苷类物质，硫代葡萄糖苷酶（简称芥子酶）与硫代葡萄糖苷相伴而生，在活体的植物中，它们被膜系统隔开。在有水分的情况下，细胞受到破坏，二者接触发生反应，硫代葡萄糖苷在芥子酶作用下降解为异硫氰酸酯（Isothiocyanates，简称ITCs），是某些调味品和蔬菜制品中刺激性特征风味的来源，也具有抗癌、抑菌等生理活性，其作为杀虫剂、杀菌剂、除草剂和熏蒸剂广泛应用在农业当中。

GB 2763-2021中规定异硫氰酸烯丙酯在番茄中最大残留限量：0.05mg/kg，异硫氰酸甲酯在番茄和姜中的最大残留限量分别：0.05mg/kg，2mg/kg。ITCs含量的测定，归纳起来可分为三大类即色谱法、光谱法和容量分析法。其中容量分析法种类较多，在常量分析中为常用方法，而色谱法等多用于微量分析及ITCs的鉴定。大多数ITCs化合物具有一定挥发性，用GC分离，FID和MS检测器检测是微量分析中常用检测手段，对于残留限量的痕量分析满足不了要求。本发明先将样品通过衍生剂衍生，提高了样品净化和质谱的检测效果，用高效液相色谱-串联质谱法检测番茄、姜及其制品番茄酱、姜粉等中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的残留量，方法定量限：10μg/kg，回收率：67%-117%，重现性：0.7%-7.5%。该方法具有检测限低，分析时间短，分析范围广，分离能力强，定性分析结果可靠等优点，并能完全满足残留标准限量要求。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种蔬菜中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯残留检测方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种蔬菜中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯残留检测方法，具体步骤如下：

S1试样的制备：选取蔬菜样品，按照GB2763相关要求进行取样，将样品切碎缩分后制成匀浆，装入洁净的样品袋内-18℃冷冻存储待测；

S2试样的称取：称取试样1g（精确至0.01g)到15mL塑料离心管内，加入3mL-5mL纯水，涡旋混匀，混匀后，静置2小时；

S3试样的提取：加入5mL乙酸乙酯，在高速组织研磨机上1300r/min振荡提取2min；然后转速3500r/min，离心3min；

S4 衍生反应：移取适量上层有机相，过0.22μm有机系滤膜后转移到2mL塑料离心管内；用移液器准确移取100μL到进样小瓶内，加入900μL乙酸乙酯，再加入60μL 520mg/L的9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，LC-MS/MS检测；测得样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量。

作为优选方案，S1中的蔬菜样品为番茄、黄瓜、番茄酱、鲜姜中的一种时，加入3mL纯水。

进一步地，S1中的蔬菜样品为姜粉时，加入5mL纯水。

作为优选方案，还包括S5空白试验：不称取试样的情况下，重复S2至S4。

作为优选方案，标准工作曲线的配制过程，包括以下具体步骤：

T1标准储备液：分别准确称取10mg的异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯标准物质，用少量乙酸乙酯溶解后，用乙酸乙酯定容至10.0 mL，配成1000 mg/L标准储备液，于-20℃避光存储；

T2混合标准溶液A：用移液枪分别准确移取0.01 mL标准储备液，用乙酸乙酯定容到10.0 mL，得到1.0 mg/L混合标准溶液A，-4℃避光存储，有效期1个月；

T3系列校准溶液：用移液枪准确移取50微升混合标准溶液A，用乙酸乙酯定容至5.0mL，得到10μg/L混合标准工作液B，现用现配；分别移取0μL、20μL、60μL、100μL、140μL、200μL、300μL、1000μL体积的混合标准工作液B，用乙酸乙酯定容至1000μL，得到系列校准溶液；

T4系列校准溶液的衍生：以上系列校准溶液中各加入60μL 520mg/L的 9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，上机LC-MS/MS检测，该溶液现用现配，以分析物的峰面积为纵坐标

进一步地，还包括S6添加试验：添加水平10μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、70μg/kg、100μg/kg、150μg/kg，称取试样后，分别准确加入异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的1.0mg/L混合标准溶液A10μL、30μL、50μL、70μL、100μL和150μL充分混匀后，重复S2至S4；为验证方法的精密度和定量限，10μg/kg、30μg/kg、50μg/kg水平添加分别做6个平行。

进一步地，还包括S7基质匹配校准曲线的制备：选取阴性样品分别添加系列浓度水平的标准物质，添加水平同S6。

进一步地，衍生反应液（520mg/L）的配制过程为称取9-（甲氨甲基）蒽0.013g，二氯甲烷溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度即可，避光保存，现用现配。

作为优选方案，S4中的LC-MS/MS的色谱条件为色谱柱：Agilent ZORBAXEclipsePlus C18 2.1×100mm 1.8μm PN：959758-902；柱温：40℃；进样体积：1μL； 流动相：A：1mmol/L 甲酸氨溶液（含0.1%甲酸）B： 甲醇 ；流速：0.4 mL/min；梯度程序： 0.00-0.60 min，A：50%-50%；0.60-3.00 min，A：50%-5%；3.00-4.00 min，A：5%-5%；4.00-4.50min，A：5%-50%；4.50-6.00 min，A：50%-50%；

质谱条件为雾化器温度：250℃，雾化器流速：14L/min，雾化器压力：40pis，鞘层气体温度：325℃，鞘层气体流速：10L/min，正模式毛细管电压：4000V，正模式RF透镜高压电压：150V，RF透镜低压电压：60V，MRM选择离子模式；异硫氰酸烯丙酯衍生物的母离子为321.1 m/z，子离子为191.1 m/z和143.1 m/z；异硫氰酸甲酯衍生物的母离子为295.1 m/z，子离子为191.1 m/z和117.1 m/z。

本发明由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：

1.确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯在番茄酱、黄瓜和姜中残留的提取和净化方法。

2.确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯和9-（甲氨甲基）蒽化学反应的反应介质、反应时间及衍生剂的量，及衍生产物的稳定性。

3.确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯和9-（甲氨甲基）蒽衍生产物在高效液相色谱二极管阵列检测器检测条件。

4.确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯和9-（甲氨甲基）蒽衍生产物在高效液相色谱串联质谱仪检测参数。

5.确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯和9-（甲氨甲基）蒽衍生产物的结构。

6.确定了异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯在番茄酱、黄瓜和姜中残留检测的高效液相色谱串联质谱仪法。

7.本方法通过衍生反应改变了化合物的理化性质把酯类化合物转移到灵敏度更高的高效液相色谱串联质谱上检测。

8.通过衍生反应改善了前处理的净化效果，提高了方法的专属性。

9.降低了检测的灵敏度，提高了检测效率，一个样品的仪器分析时间有30min，缩短到6min。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为异硫氰酸甲酯（左）和异硫氰酸烯丙酯（右）结构式；

图2为系统空白衍生产物色谱图；

图3 为5mg/L混合标准品衍生产物色谱图（异硫氰酸甲酯衍生产物2.577min，异硫氰酸烯丙酯衍生产物3.564min）；

图4为5mg/L异硫氰酸酯衍生产物光谱图；

图5为蒽标准溶液扫描光谱图；

图6为异硫氰酸甲酯与9-（甲氨甲基）蒽衍生反应方程式；

图7为异硫氰酸烯丙酯与9-（甲氨甲基）蒽衍生反应方程式；

图8为异硫氰酸甲酯衍生产物结构图；

图9为异硫氰酸烯丙酯衍生产物结构图；

图10为5mg/L 异硫氰酸烯丙酯衍生物溶剂标准品Ms scan TIC色谱图；

图11为5mg/L 异硫氰酸烯丙酯衍生物溶剂标准品在2.807min-2.997min平均质谱图；

图12为5mg/L 异硫氰酸烯丙酯衍生物溶剂标准品子离子扫描质谱图；

图13为5mg/L 异硫氰酸甲酯衍生物溶剂标准品Ms scan TIC色谱图；

图14为5mg/L 异硫氰酸甲酯衍生物溶剂标准品在0.741min-0.817min平均质谱图；

图15为5mg/L 异硫氰酸甲酯衍生物溶剂标准品子离子扫描质谱图；

图16为衍生反应时间对衍生效率的影响；

图17为衍生试剂体积对衍生效率的影响；

图18为异硫氰酸甲酯（下）和异硫氰酸烯丙酯（上）衍生产物校正曲线；

图19为0.2μg/L 溶剂标准品色谱图；

图20为系统空白色谱图；

图21为番茄色谱图；

图22为番茄spike110μg/kg色谱图；

图23为鲜姜色谱图；

图24为鲜姜spike110μg/kg色谱图；

图25为黄瓜色谱图；

图26为黄瓜spike110μg/kg色谱图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

下面结合图1至图26对本发明的实施例的蔬菜中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯残留检测方法进行具体说明。

实施例中使用的仪器、试剂：

高效液相色谱-串联质谱仪（1290 Infinity Ⅱ-6495LC/TQ，Aglient）；电子天平（Sartorius CPA225D，德国赛多利斯公司）；高速离心机(Multifuge X3R，美国Thermo 公司)；高通量组织研磨机（2010 Geno/Grinder®，美国SPEX SamplePrep公司）；超纯水仪（Milli-Q A10，美国Millipore公司）；Eppendorf移液枪：2-20μL、20-100μL、20-200μL、100-1000μL等。

乙腈(色谱纯 ，美国Honey well公司)；甲酸（质谱用，纯度≥95% ，美国SigmaFluka公司）；9-（甲氨甲基）蒽（97%，麦克林N885935 1g/瓶，CAS:73356-19-1)，美国Sigma公司）；乙酸乙酯（ HPLC4L/141-78-6，默睿科）；二氯甲烷（HPLC 500mL/75-09-2，天津光复化学试剂有限公司）；纯水（Milli-Q超纯水，电阻率25℃18.2MΩ﹒cm）；注射式有机系滤膜（0.22μm, 13mm，中国Agela Technologies）。

标准品：异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate)（CAS：57-06-7,纯度98.2%，AccuStandard, 20℃±4℃ 储存）；异硫氰酸甲酯(methyl isothiocyanate )（CAS：556-61-6,99.2%，NEOCHEMA, 20℃±4℃ 储存）。

实施例1

标准工作曲线的配制过程，包括以下具体步骤：

T1标准储备液：分别准确称取10mg（精确至0.01 mg）的异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯标准物质，用少量乙酸乙酯溶解后，用乙酸乙酯定容至10.0 mL，配成1000 mg/L标准储备液，于-20℃避光存储；

T2混合标准溶液A：用移液枪分别准确移取0.01 mL标准储备液，用乙酸乙酯定容到10.0 mL，得到1.0 mg/L混合标准溶液A，-4℃避光存储，有效期1个月；

T3系列校准溶液：用移液枪准确移取50微升混合标准溶液A，用乙酸乙酯定容至5.0mL，得到10μg/L混合标准工作液B，现用现配；按表1分别移取0μL、20μL、60μL、100μL、140μL、200μL、300μL、1000μL体积的混合标准工作液B，用乙酸乙酯定容至1000μL，得到系列校准溶液；

表1 系列校准溶液配制表

T4系列校准溶液的衍生：以上系列校准溶液中各加入60μL 520mg/L的 9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，上机LC-MS/MS检测，该溶液现用现配，以分析物的峰面积为纵坐标

分别衍生blank(试剂空白）、5mg/L异硫氰酸甲酯、5mg/L异硫氰酸烯丙酯和5mg/L2种混合标准溶液高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）分析，仪器参数如下；高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18 4.6×150mm 5μm PN:883975-902；柱温：40℃；进样体积：10μL； 流动相：乙腈-水（7+3，v/v）；流速：1.0 mL/min，检测波长：250nm。

实施例2

S1试样的制备：选取番茄样品，按照GB2763相关要求进行取样，将样品切碎缩分后制成匀浆，装入洁净的样品袋内-18℃冷冻存储待测；

S2试样的称取：称取番茄试样1g（精确到0.01g）到15mL塑料离心管内，加入3mL纯水，涡旋混匀，混匀后，静置2小时；

S3试样的提取：加入5mL乙酸乙酯，在高速组织研磨机上1300r/min振荡提取2min；然后转速3500r/min，离心3min；

S4 衍生反应：移取适量上层有机相，过0.22μm有机系滤膜后转移到2mL塑料离心管内；用移液器准确移取100μL到进样小瓶内，加入900μL乙酸乙酯，再加入60μL 520mg/L的9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，LC-MS/MS检测；测得样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量。

LC-MS/MS的色谱条件为色谱柱：Agilent ZORBAX EclipsePlus C18 2.1×100mm1.8μm PN：959758-902；柱温：40℃；进样体积：1μL； 流动相：A：1mmol/L 甲酸氨溶液（含0.1%甲酸）B： 甲醇 ；流速：0.4 mL/min；梯度程序见表2： 0.00-0.60 min，A：50%-50%；0.60-3.00 min，A：50%-5%；3.00-4.00 min，A：5%-5%；4.00-4.50 min，A：5%-50%；4.50-6.00min，A：50%-50%；

表2 高效液相色谱仪-串联质谱仪液相梯度程序

质谱条件为雾化器温度：250℃，雾化器流速：14L/min，雾化器压力：40pis，鞘层气体温度：325℃，鞘层气体流速：10L/min，正模式毛细管电压：4000V，正模式RF透镜高压电压：150V，RF透镜低压电压：60V，MRM选择离子模式；化合物质谱参数见表3，异硫氰酸烯丙酯衍生物的母离子为321.1 m/z，子离子为191.1 m/z和143.1 m/z；异硫氰酸甲酯衍生物的母离子为295.1 m/z，子离子为191.1 m/z和117.1 m/z。

表3 高效液相色谱仪-串联质谱仪化合物质谱参数

实施例3

S1试样的制备：选取黄瓜样品，按照GB2763相关要求进行取样，将样品切碎缩分后制成匀浆，装入洁净的样品袋内-18℃冷冻存储待测；

S2试样的称取：称取黄瓜试样1g（精确到0.01g）到15mL塑料离心管内，加入3mL纯水，涡旋混匀，混匀后，静置2小时；

S3试样的提取：加入5mL乙酸乙酯，在高速组织研磨机上1300r/min振荡提取2min；然后转速3500r/min，离心3min；

S4 衍生反应：移取适量上层有机相，过0.22μm有机系滤膜后转移到2mL塑料离心管内；用移液器准确移取100μL到进样小瓶内，加入900μL乙酸乙酯，再加入60μL 520mg/L的9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，LC-MS/MS检测；测得样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量。

LC-MS/MS的色谱条件和质谱条件同实施例2。

实施例4

S1试样的制备：选取番茄酱样品，按照GB2763相关要求进行取样，将样品切碎缩分后制成匀浆，装入洁净的样品袋内-18℃冷冻存储待测；

S2试样的称取：称取番茄酱试样1g（精确到0.01g）到15mL塑料离心管内，加入3mL纯水，涡旋混匀，混匀后，静置2小时；

S3试样的提取：加入5mL乙酸乙酯，在高速组织研磨机上1300r/min振荡提取2min；然后转速3500r/min，离心3min；

S4 衍生反应：移取适量上层有机相，过0.22μm有机系滤膜后转移到2mL塑料离心管内；用移液器准确移取100μL到进样小瓶内，加入900μL乙酸乙酯，再加入60μL 520mg/L的9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，LC-MS/MS检测；测得样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量。

LC-MS/MS的色谱条件和质谱条件同实施例2。

实施例5

S1试样的制备：选取鲜姜样品，按照GB2763相关要求进行取样，将样品切碎缩分后制成匀浆，装入洁净的样品袋内-18℃冷冻存储待测；

S2试样的称取：称取鲜姜试样1g（精确到0.01g）到15mL塑料离心管内，加入3mL纯水，涡旋混匀，混匀后，静置2小时；

S3试样的提取：加入5mL乙酸乙酯，在高速组织研磨机上1300r/min振荡提取2min；然后转速3500r/min，离心3min；

S4 衍生反应：移取适量上层有机相，过0.22μm有机系滤膜后转移到2mL塑料离心管内；用移液器准确移取100μL到进样小瓶内，加入900μL乙酸乙酯，再加入60μL 520mg/L的9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，LC-MS/MS检测；测得样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量。

LC-MS/MS的色谱条件和质谱条件同实施例2。

实施例6

S1试样的制备：选取姜粉样品，按照GB2763相关要求进行取样，将样品切碎缩分后制成匀浆，装入洁净的样品袋内-18℃冷冻存储待测；

S2试样的称取：称取姜粉试样1g（精确到0.01g）到15mL塑料离心管内，加入5mL纯水，涡旋混匀，混匀后，静置2小时；

S3试样的提取：加入5mL乙酸乙酯，在高速组织研磨机上1300r/min振荡提取2min；然后转速3500r/min，离心3min；

S4 衍生反应：移取适量上层有机相，过0.22μm有机系滤膜后转移到2mL塑料离心管内；用移液器准确移取100μL到进样小瓶内，加入900μL乙酸乙酯，再加入60μL 520mg/L的9-（甲氨甲基）蒽衍生反应液，拧紧瓶盖，室温放置16h后，LC-MS/MS检测；测得样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量，根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯含量。

LC-MS/MS的色谱条件和质谱条件同实施例2。

空白试验

S5空白试验：不称取试样的情况下，重复S2至S4。

添加试验

S6添加试验：添加水平10μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、70μg/kg、100μg/kg、150μg/kg，称取试样后，分别准确加入异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的1.0mg/L混合标准溶液A10μL、30μL、50μL、70μL、100μL和150μL充分混匀后，重复S2至步骤S4；为验证方法的精密度和定量限，10μg/kg、30μg/kg、50μg/kg水平添加分别做6个平行。

基质匹配校准曲线

S7基质匹配校准曲线的制备：选取阴性样品分别添加系列浓度水平的标准物质，添加水平同S6。

衍生产物的定性：

分别衍生blank(试剂空白）、5mg/L异硫氰酸甲酯、5mg/L异硫氰酸烯丙酯和5mg/L2种混合标准溶液高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）分析，仪器参数见2.2.1。色谱图见图2和图3，异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的衍生物的保留时间分别是：2.577min和3.564min。其光谱图见图4，最大吸收波长250nm，在280nm-400nm波长范围内具有同蒽（图5）的类似的典型紫外吸收光特征。

采用LC-MS/MS对衍生产物进一步确认，其产物母离子扫描质谱图和子离子扫描质谱图见图10~图15。衍生产物的化学结构见图6和图7，衍生反应化学方程式见图8和图9。

衍生反应条件的优化

异硫氰酸酯类化合物与胺反应生成硫脲类物质，常用反应溶剂为二氯己烷，二氯甲烷的密度比水大，用二氯甲烷提取食品中的异硫氰酸酯类残留物时，二氯甲烷层在下层，不方便提取液的转移。分别比较了二氯甲烷和乙酸乙酯两种溶剂，发现二者在相同衍生时间内，衍生产率基本一样。故优先选择乙酸乙酯作为反应溶剂和提取溶剂。

衍生时间的优化：配制0.1mg/L溶剂标准品，加入衍生试剂后，立即上机测试，连续采集18个小时的数据，从图16中可以看到，15小时后衍生产物的响应基本平稳。

衍生试剂的加入量优化： 配制0.1mg/L溶剂标准品，分别加入5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL体积的衍生反应液（520mg/L），衍生反应过夜后上机测试。从图17中可以看到选择60μL即可。

衍生产物稳定性验证：每天配制0.1mg/L溶剂标准品，加入60μL衍生试剂后，密封室温放置。比较连续5天的标准品响应，异硫氰酸甲酯衍生物RSD2.2%，异硫氰酸甲酯衍生物RSD4.9%，说明其在5天内是稳定的。

方法线性及定量限：以3倍信噪比（S/N）估算仪器检出限,以10倍信噪比（S/N）估算仪器定量限，0.2μg/L溶剂标准品色谱图见图19；其线性方程、相关系数（见图18）和方法检出限见下表4。比较了不同基质配制的系列校正曲线，其斜率和溶剂标准品曲线的斜率差异不大，说明基质干扰比较小。为获得更准确数据最终定量方式选择了基质匹配校正曲线来定量。

表4 异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯的线性及定量限

准确度与精密度：选择黄瓜、番茄、番茄酱、鲜姜和姜粉样品，添加0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg水平的标准溶液，验证数据见表5。回收率67%-117%；相对标准偏差（RSD）0.7%-7.5%。

表5 方法的准确度与精密度

方法专属性：从系统空白（图20）、黄瓜（图25、图26）、番茄（图21、图22）和鲜姜（图23、图24）色谱图中可以看到，在异硫氰酸甲酯和异硫氰酸烯丙酯衍生物出峰位置处没有干扰峰出现，这两个衍生产物分离度良好，符合要求，说明该色谱条件具有良好的选择性和专属性。

在本发明的描述中，术语“多个”则指两个或两个以上，除非另有明确的限定，术语“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；术语“连接”、“安装”、“固定”等均应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。