一种基于近红外光谱的象牙鉴定方法

摘要

本发明提供了一种基于近红外光谱的象牙鉴定方法，首先收集样品，对样品光谱采集部位进行了选取，并对样品进行近红外光谱扫描和光谱数据的采集；选择建模的校正集及验证集光谱数据，确定特征普段，选取最佳的主因子值和F值，建立象牙的近红外光谱鉴别模型；利用模型对待测样品的近红外光谱数据进行分析，给出样品鉴定结果。本发明首次利用近红外分析方法建立象牙的真伪鉴定模型，与传统形态学鉴定比较，本发明方法具有客观化，数字化，可量化的特点；与分子生物方法比较，本发明无需复杂的前处理，是一种检测速度快、操作简便且对样品无损的方法，适合作为监管部门现场执法的快速查验初筛方法，对促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及象牙的光谱无损鉴定方法。使用近红外光谱的检测技术，对象牙及其仿制品进行检测鉴定，属于生物技术领域。

背景技术

象牙制品以其独特而高贵的色泽、滑润的质地、天然与人工斧凿的完美结合而受到人们广泛的认同和青睐。但人们为了获取象牙，大量猎杀大象，在这精美绝伦的牙雕工艺品背后往往潜藏着血腥的真相。大象是列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)的物种，其贸易严格受到限制。

对象牙的鉴定，主要基于其的施氏角结构，施氏角结构的有无和外缘施氏角的大小是鉴定是否是象牙，是否是现代象牙或是猛犸象牙的主要特征。但若已经成为工艺制品，无外缘施氏结构，或者有的象牙本身缺少特征纹路，此时仅从上述形态特征进行鉴定，往往无法判断。从象牙中提取DNA，从分子生物学角度鉴定象牙也有成功案例，但且不论是地下埋藏了上万年猛犸象牙，即便是现代象象牙其钙化、石化的程度也已经非常高，DNA含量极低，因此提取DNA存在很高的难度。此外，也有根据象牙物理特性的鉴定方法，如测定其摩氏硬度、密度、折射率等，但效果一般，与近似物的值都较接近，较难作为独立判断的依据。近红外光谱技术(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是一种无损鉴定方法，利用不同物质在近红外光谱区域的不同光谱特性进行检测鉴定。本发明利用近红外光谱技术建立了鉴定和区分象牙和象牙仿制品及其他一些天然物质的方法。

发明内容

本发明提供了一种基于近红外光谱的象牙鉴定方法，包括以下步骤：

S1.收集样品；

S2.样品光谱采集部位的选取和近红外光谱扫描；

S3.样品近红外光谱鉴定模型建立；

S4.近红外光谱鉴定结果的判定：利用近红外光谱分析模型对待测样品的近红外光谱数据进行分析，给出样品鉴定结果。

进一步的，S2步骤中所述样品光谱采集部位的选取应选择具有该样品典型颜色部位进行扫描。

进一步的，S2步骤中近红外光谱仪的扫描参数设置为：光谱扫描范围1000 nm～1800nm，分辨率11nm，扫描次数30次。每份样品扫描2次，2次的平均值作为原始光谱。

进一步的，S3步骤中选择建模的校正集及验证集光谱数据，确定特征普段，选取最佳的主因子值和F值，建立象牙的近红外光谱鉴别模型。

进一步的，S3步骤中所述近红外光谱分析模型中F值设置为0.57，主因子设置为2。

进一步的，S4步骤中所述近红外光谱鉴定结果的判定：一个样品测量有多个光谱，只要有一次光谱的结果显示为象牙即判定为象牙。

进一步的，所述近红外光谱分析模型的建立，包括如下步骤：

(1)收集样品；

(2)采集近红外光谱：利用光谱扫描范围1000nm～1800nm，分辨率11nm，扫描次数30次的光谱仪进行基础光谱采集；采用近红外漫反射的方式进行扫描并采集基础光谱，每份样品扫描2次，得到的平均值作为样品的原始光谱；依次对每个样品采用相同的方法进行扫描并得到平均值；对采集得到的异常光谱样本进行识别和删除；

(3)根据已知样品的性质，划分校正集和验证集，所述校正基为象牙光谱，所述验证集为非象牙光谱；

(4)光谱预处理：对所述校正集和验证集光谱进行预处理；

(5)对预处理后的漫反射光谱提取特征波段，选择象牙鉴别的敏感谱段；

(6)象牙模型的建立与验证：应用提取出来的特征波长，通过马氏距离计算，并采用SIMCA定性分析方法建立鉴别模型，推导得出最佳主因子值和F值；

(7)识别正确率：用验证集及已知类别的样本检测模型的正确率；

(8)对未知样本进行预测：通过(6)建立的象牙鉴别模型对未知样本进行模式识别。

更进一步的，所述近红外光谱分析模型的建立步骤(2)中对采集得到的异常光谱样本进行识别和删除，包括光谱特征和同性质的物质差异显著的光谱和吸光度超过1.5的光谱的直接删除。

更进一步的，所述近红外光谱分析模型的建立步骤(3)中所述象牙光谱，包括非洲象象牙、亚洲象象牙和猛犸象象牙的光谱。

更进一步的，所述近红外光谱分析模型的建立步骤(4)中对所述校正集和验证集光谱进行预处理，包括标准正态变量变换，去趋势校正，Savitzky-Golay 平滑，Savitzky-Golay导数和均值中心化。

更进一步的，所述近红外光谱分析模型的建立步骤(5)中象牙鉴别的敏感谱段分别为1160～1200nm，1430～1500nm，1680～1710nm，1720～1750nm。

更为具体的，本发明提供一种基于近红外光谱分析技术的高效无损预测结果准确的象牙鉴别方法，方法步骤如下：

(1)收集样品：收集非洲象象牙、亚洲象象牙、猛犸象象牙原牙或制品各至少10件，同时收集模仿品包括塑料象牙制品、象牙果制品等，以及牛角、鹿角、砗磲、红珊瑚等天然材质的样品；

(2)采集近红外光谱：利用光谱扫描范围1000nm～1800nm，分辨率11nm，扫描次数30次的光谱仪进行基础光谱采集。采用近红外漫反射的方式进行扫描并采集光谱，每份样品扫描2次，得到的平均值作为样品的原始光谱；依次对每个样品采用相同的近红外漫反射的方式进行扫描并得到平均值；对采集得到的异常光谱样本进行识别和删除，如光谱特征和同性质的物质差异显著的光谱和吸光度超过1.5的光谱等直接删除；

(3)根据已知样品的性质，划分校正集(象牙光谱，包括非洲象象牙、亚洲象象牙和猛犸象象牙的光谱)和验证集(非象牙光谱)；

(4)光谱预处理：对上述校正集和验证集光谱进行预处理，包括标准正态变量变换(standard normal variate transformation，SNV)，去趋势校正(detrend， DT)，Savitzky-Golay平滑，Savitzky-Golay导数和均值中心化等。通过预处理达到对噪声、背景的吸收，同时降低和消除光散射等干扰信息；

(5)对预处理后的漫反射光谱提取特征波段，象牙鉴别的4个敏感谱段，分别为1160～1200nm，1430～1500nm，1680～1710nm，1720～1750nm；

(6)象牙模型的建立与验证：应用筛选出来的特征波长，通过马氏距离计算，并采用SIMCA定性分析方法建立鉴别模型，推导得出最佳主因子值和F值；

(7)识别正确率：用验证集及已知类别的样本(已知是否为象牙的样本) 检测模型的正确率；

(8)对未知样本进行预测：通过(6)建立的象牙鉴别模型对未知样本进行模式识别。

本发明的有益效果包括：本发明首次利用近红外分析方法建立象牙的真伪鉴定模型，与传统形态学鉴定比较，本发明所述方法具有客观化，数字化，可量化的特点；本发明与分子生物方法等现有技术相比，本发明所述方法无需复杂的样品前处理，检测速度快、操作简便且是对样品无损，适合作为监管部门现场执法的快速查验初筛方法，如海关在国际机场和国际邮件查验现场进行快速初筛。

附图说明

图1A至图1H光谱图和模型统计图表。图1A～图1B：2个米黄色象牙和2个呈暗灰黑色象牙的原始光谱图(图1A)和导数光谱(图1B)；图1C～图1D：2个蓝黑色猛犸象牙外皮和2个米黄色猛犸象牙的原始光谱图(图1C)和导数光谱图(图 1D)；图1E～图1F：不同厚度的象牙制品的原始光谱图(图1E)和导数光谱图(图 1F)；图1G～图1H：SIMCA建模过程中定性分析校正集光谱(包括现代象牙和猛犸象牙)时发现的异常光谱。

图2象牙典型样品图片及扫描方式图片。2A：典型的米黄色象牙画轴轴头；2B：典型的灰黑色象牙画轴轴头；2C：典型的蓝黑色的猛犸象牙外皮；2D：典型的米黄色猛犸象牙；2E：象牙刀片；2F：薄片型样品放在桌面上扫描；2G：薄片型样品持在手上扫描。

图3A至图3 F象牙近红外光谱鉴定建模分析图。图3A：校正样本F值为2.5；

图3B：验证样本F值为2.5；图3C：校正样本F值为1.14；图3D：验证样本F 值为1.14；图3E：校正样本F值为0.57；图3F：验证样本F值为0.57。

具体实施案例

1.样品的性状对检测结果的影响：

1.1样品

收集了153件象牙制品，包括99个现代象牙但无法区分亚洲象牙或非洲象牙的制品，26件非洲象牙制品，18件亚洲象牙制品，10件猛犸象牙制品。多数象牙呈典型的象牙白色或米色或米黄等颜色，5件象牙制品由于年代久远或者保存不当，样品表面呈暗色，如黑灰色等；8件为带深蓝色牙皮的猛犸象牙制品。此外，多数象牙制品为画轴轴头、手镯、印章、佛珠、平安扣等等，具有一定的厚度，有些象牙制品呈薄片形，如3件象牙扇，2件象牙刀片，5件象牙钢琴琴键薄片等。由于同一样品不同部位存在颜色和形状的差异，因此往往对同一样品的不同部位同时采集多个光谱信息，因此实际得到的光谱样本数大于样品个数。

1.2光谱扫描方法

利用光谱扫描范围1000nm～1800nm，分辨率11nm，扫描次数30次的光谱仪进行基础光谱采集。采用近红外漫反射的方式进行扫描并采集光谱，每份样品扫描2次，求平均值作为样品的一个原始光谱；依次对每个样品采用相同的方法进行扫描并得到平均值。

1.3样品颜色和厚度对检测结果影响

1.3.1光谱比对

图1A是2个米黄色象牙轴头(典型图如图2中的2A)和2个呈暗灰黑色象牙轴头(典型图如图2中的2B)的原始光谱图，从波形判断这4个光谱差异不大，但暗色样品的吸光度明显高于白色样品。图1B是图1A的原始光谱在窗口数3(参与求导的数据点数为3)的情况下经过1次拟合1次求导后的导数光谱图，图1B中4个光谱图的差异不大。说明图2中的2B类型的灰黑色对光谱图的影响不大。图1C是2个蓝黑色猛犸象牙外皮(典型图如图2中的2C)和2 个米黄色猛犸象牙(典型图如图2中的2D)的原始光谱图，图形上蓝黑色样品和米黄色样品在1000nm～1400nm区域的吸收峰存在一定的差异，经过光谱处理后，图形上仍然存在一定的差异(图1D)。

图1E是厚度为0.69mm的象牙扇扇骨片、2.86mm的象牙刀片(图2中的 2E)和长径21.6mm、短径17.4mm的象牙佛珠的原始光谱图，图1F是其导数光谱图(求导条件同上)。图1E和图1F都显示，不同样品的厚度对光谱图形影响不大，且扫描方式，即样品放在桌面上扫描(图2中的2F)亦或是样品持在手上扫描(图2中的2G)，扫描得到的光谱差异也不大。

1.3.2建模分析

图1G和图1H是用SIMCA建立模型的过程中定性分析校正集光谱(包括现代象牙和猛犸象牙)时发现的异常光谱。208个校正集光谱中，在F值为默认值2.5，推荐的主因子值为3的条件下，发现了23个异常光谱，其中9个为猛犸象牙黑色部位采集到的光谱样本，10个为象牙扇扇骨片的光谱样本。

1.4结论

样品颜色会对扫描结果存在一定的影响，如同一物质，颜色深和浅的部位吸光度会有差异，即便目测光谱图形无差异，软件通过计算分析后较容易划分为异常样本，也说明了和其他样本光谱还是存在一定的差异。同样，样品的厚度若太薄(如1.3.2中的10个判断为异常样本的扇骨片，厚度都小于1mm)也容易引起误判。检测样本时，若样本不同部位的颜色不同，厚度不同时，应扫描具有该物质典型颜色部位，同时取有一定厚度的部位进行扫描，以免造成误判。

2.象牙鉴定的模型建立

2.1样品及光谱样本

用于校正集的153件样品和208个光谱样本，以及用于验证集的21类不同属性的77件样品和175个光谱样本，详见表1。

2.2模型建立

按照“发明内容”中的(1)～(6)所述，建立初步的模型。模型建立过程中涉及到主因子-F值聚类判别，在对208个校正集光谱样本和175个验证集光谱样本进行建模时，推荐的主因子值为3，此时包含了样品96.5％的信息量。初始默认的F阈值为2.5左右，如图3A显示，此时的校正样本中有20个左右的样本被列为异常，其余都是正常的校正样本；但同时验证样本中也显示(图3B)，有相当部分验证样本为列入正常样本，这意味着这部分光谱对应的非象牙材质样品也会被鉴定为象牙。调整F值至1.14左右，此时被列入异常的校正样本数增多 (图3C)，但仍有相当数量的验证样本被列入正常样本(图3D)。继续调整F值至0.57左右(图3E和图3F)，统计显示此时校正样本中正常样本数为155 (155/208*100％＝75.4％)，异常样本数53，验证样本中正常样本数降低至13 (13/175*100％＝7.4％)，异常样本数升至162。虽然此时只有53个校正样本被列入异常样本(即这53个光谱所对应的象牙样品被判定为非象牙)，但仍然有13 个验证样本被认为是正常样本(即这13个光谱所对应的非象牙样品被判定为象牙)。进一步确认，被误判为象牙的样品主要是动物骨骼，包括马来熊骨和金猫骨。

在F值保持0.57的情况下，调整了主因子值。研究发现，将主因子从3调整至1或者2时，校正集中的正常样本比例提高，而同时验证集中的正常样本比例也提高，如降至2时，校正集中的正常样本比例从75.4％提至88.9％ (185/208*100％)，验证集中的正常样本比例从7.4％升至12.0％(21/175*100％)；而将主因子从3调整至4或者5时，校正集中的正常样本比例下降，而同时验证集中的正常样本数也下降，如升至4时，校正集中的正常样本比例从75.4％降至 60.1％(125/208*100％)，验证集中的正常样本比例从7.4％降至4.6％ (8/175*100％)。因此在F值保持不变的情况下，将主因子从3降低至1或者2，有利于降低假阴性，但假阳性率会增高；若将主因子从3升高至4或者5，则假阴性比例会上升，假阳性比例则会降低。

无论是调整F值还是调整主因子值，目的在于让校正集中尽可能多的样本归类于正常样本，从而降低检测结果的假阴性；同时让验证集中尽可能少的样本归类于正常样本，降低检测结果的假阳性。调整F值和主因子值，使假阳性率和假阴性率都保持在比较低的水平，同时根据检测目的，如检测目的是为了打击濒危动植物的走私而进行的初步筛选，则一般来说比较假阴性，更加可以容忍假阳性。因此，最终将F值设置为0.57，将主因子设置为2，保存设置，并完成模型的建立。

3.象牙鉴定的模型验证

3.1识别的正确率

利用2.2建立的模型，验证表1中样品鉴定的准确率。形态学鉴定和分子生物学鉴定的方法参考海关总署文件《象牙及象牙制品鉴定方法(试行)》署科发〔2019〕75号的方法。

三种不同的方法的判定方式如下。近红外光谱鉴定结果的判定：判定为“象牙”，即一个样品测量有多个光谱，只要有一次光谱的结果显示为象牙，即判断该样品为象牙；否则判定为“非象牙”。形态学鉴定结果判定：判定为“象牙”，即有明显的施氏结构，热针戳无孔痕，无烟；“非象牙”，即无施氏结构，热针戳有孔痕，冒白烟；“无法鉴定”，即无施氏结构，热针戳无孔痕，无烟。分子生物学鉴定结果判定：判定为“象牙”，即分子检测的结果为非洲象，亚洲象，或者猛犸象；“非象牙”，即鉴定结果为除象以外的其他物种；“无法鉴定”，即未能鉴定到物种。

光谱鉴定准确率＝鉴定准确的样品数/样品总数*100％。鉴定结果以形态学结合分子生物学的结果(综合判定结果)为准，即这两个方法中有一个方法鉴定为“象牙”即为“象牙”；有一个方法鉴定为“非象牙”，即为“非象牙”；两种方法都为“无法鉴定”，则为“无法鉴定”；两种方法有矛盾时，即一种方法的结果为“象牙”，另一种方法的结果为“非象牙”时，需要再验证，但一般不会出现该类矛盾的结果。

利用建立的模型检测表1的样品的光谱，得到的鉴定结果显示(表1)，所有经形态学和/或分子生物学鉴定为象牙的样本，本模型的鉴定结果也都为象牙，未有假阴性，因此对象牙的识别正确率达到100％。但在鉴定马来熊骨和金猫骨时，误判率分别为100％和66.7％，但即便用裸眼感官鉴别，也极容易区分马来熊、金猫骨骼与象牙的区别，因此在实际工作中该假阳性完全可以避免。但对其他材质的样品，包括最容易鉴错的象牙仿制品，如象牙的塑料仿制品和象牙果制品等，则能够做到鉴定准确率100％。

因为在象牙制品的初筛程序中，一旦在初筛中归为阴性(即非象牙)，后续可能就不再进行鉴定，而假阳性可以在后续的检测中继续鉴定。因此本发明基于近红外光谱的象牙鉴定方法，能有效避免将样品误判为阴性(假阴性)，不会因此放过真正的象牙制品，更有利于打击象牙买卖等行为。

3.2对未知样本的预测

对海关截获的20件疑似象牙制品进行鉴定。近红外光谱鉴定的方法，即利用上述2中建立的模型；形态学和分子生物学鉴定的方法仍参照海关总署文件《象牙及象牙制品鉴定方法(试行)》署科发〔2019〕75号中方法。三种不同的方法的判定方式同3.1。

近红外检测得到的结果，20个样品中18个样品与综合判断一致，其中11个为象牙，7个为非象牙。2个近红外光谱结果与综合判定不符合的样品(表2中，13和14号样品)，近红外光谱都判定为象牙，综合判定的结果都是无法鉴定，但由于真象牙也存在无典型纹理，和极易出现DNA提取不到的情况，且样品本身经过宏观鉴定为疑似象牙样品，因此这两个样品为真象牙的概率同样存在。

表1建立模型所使用的样品及鉴定结果

注：若样品体积较大存在不同截面，或各个部位颜色、厚度等存在差异，则在同一样品的不同部位视情况采集2-4个原始光谱；

表2疑似象牙制品的鉴定结果