一种基于核磁共振的无机硫含量的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于核磁共振的无机硫含量的检测方法，通过安全环保的前处理将样品中所有价态的无机硫氧化至硫酸根，基于三(2‑氨基乙基)胺合成一种选择性识别硫酸根的配体，将核磁共振技术与阴离子自组装相结合，通过探测核磁共振氢的化学位移实现无机总硫的定量检测。该方法避免了传统方法中无机汞和甲醛的使用，克服了化学发光法只能检测无色样品的局限。该检测手段具有定量准确、重现性良好等特点，且结合国标法检可实现高通量检测，为食品漂白后残留超标的无机硫快速筛选提供了一种新途径。同时该发明在其他样品生产、质量控制、过量添加、残留鉴定等领域和工业生产中也存在潜在应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及磁共振技术领域和无机硫含量技术领域，利用核磁共振波谱技术和阴离子识别技术，结合前处理提供了一种利用核磁共振检验食品中无机硫含量的检测方法。

背景技术

硫的氧化物及其盐类具有漂白、防腐和抗氧化的作用，因此在薯类食品、糖果制品、速冻蔬菜制品、水产品、啤酒红酒果酒类，茶叶、药材的生产加工过程中，加入不同价态的含硫化合物对其进行处理，从而实现漂白、防腐、抗氧化和防褐变的作用。此外含硫的盐对氧化酶有强的抑制作用，会与食品中的糖发生反应阻断糖基化合物与氨基酸的缩合反应，防止食物发生酶性褐变和非酶性褐变，且低价硫盐有较强的还原性，可以阻断微生物的生理氧化作用，进而防止微生物对食品造成的危害。

食品中的总无机硫含量的来源包括一小部分自身代谢过程和酵母发酵产生出的少量二氧化硫，如香菇等，另一大部分来自于硫磺熏蒸、硫盐类腌制食品的外源性硫残留。在食品生产工业中，通过添加含硫物质，改善产品色泽及降低微生物含量，然而无机硫的超标添加和过量残留造成的危害不容小觑，其会引起急性眼、鼻粘膜刺激性症状，甚至喉头、支气管痉挛，水肿，长期过量摄入会影响肌体对钙的吸收，也会导致嗅觉迟钝，鼻炎支气管炎哮喘等症状。为此国内标准对不同食品包括薯类、糖果、冻干蔬菜、水果汁、饼干、粉丝和果脯等食品二氧化硫等残留限量进行规定，包括最低0.02g/kg，最高不超过0.35g/kg。但部分商家仍然会过量使用含硫化合物，因此检测食品中的硫含量势在必行。

当前食品、药材中的二氧化硫及其盐类的检测方法包括分光光度法，荧光光度法，化学发光法，电化学传感器法，激光拉曼等光谱法，分离色谱法和植物检测法。然而这些方法对二氧化硫及其盐类检测是相对慢速的，不满足目前食品快速检测领域的需求；现有快速检测方法包含碘量法、乙酸铅试纸法、盐酸副玫瑰苯胺比色法、流动注射分光光度法等，这些方法均需使用有毒有害试剂，如经典的碘量法需要使用甲醛作为掩蔽剂，盐酸副玫瑰苯胺比色法需使用四氯汞钠，上述检测方法均无法满足当今绿色检测需求。因此开发一种具有检测快，灵敏度高、安全性好的二氧化硫及其盐类的检测方法非常重要。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种选择性识别硫酸根的配体，硫酸根可与配体产生相互作用进而影响核磁共振氢谱的化学位移，通过核磁共振可快速灵敏地检测到信号的变化从而算出样品中的硫酸根含量。同时本发明提供了一种快速的前处理方法，可将样品中所有无机硫氧化至最高价态——硫酸根。这样，就可以一次性检验出样品中总无机硫含量，以解决背景技术中的问题。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种基于核磁共振的无机硫含量的检测方法，可以测定市场上加工食品残留的无机硫含量，包括以下步骤：

步骤1：样品前处理

(1).称取待测样品5-10g，加入10mL去离子水中；充分搅拌；离心，取上清液备用；

(2).取(1)所得上清液，加入H

(3).将(2)所述溶液加热并煮沸5-20分钟，即得待测样品溶液；其中，煮沸时间为5-20分钟；

步骤2：配体合成

在干燥的三口瓶中加入对硝基苯甲酸溶解在二甲基甲酰胺中形成溶液，抽空换氮三次后加入三乙胺，开启搅拌，室温下缓慢往体系中滴加叠氮磷酸二苯酯，滴加完毕后，在室温下继续搅拌反应2-3小时；反应完全后，往体系中加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到对硝基苯甲酰叠氮化物；其中，对硝基苯甲酸、三乙胺、叠氮磷酸二苯酯与二甲基甲酰胺的摩尔比为：1:1.2-1.5:1.1-1.5:300-500；

在干燥的三口瓶中加入硝基苯甲酰叠氮化物和分析纯甲苯配成的溶液，抽空换氮三次后，把体系加热至回流反应，得到对硝基苯异氰酸酯的甲苯溶液；将体系抽空换氮，往体系中滴加三(2-氨基乙基)胺的四氢呋喃溶液，析出橙色固体，将体系加热到90℃，反应2-3小时，溶液颜色从橙色变为淡黄色；反应完全后，过滤，固体用甲苯和乙醚洗涤三次，真空干燥得到淡黄色，即为产物配体；硝基苯甲酰叠氮化物、三(2-氨基乙基)胺、甲苯和四氢呋喃的摩尔比为3-4:1:300-400:300-500；

步骤3：标准曲线绘制

将硫酸钠溶解在去离子水中，制备成硫酸钠标准液，将不同浓度硫酸钠溶液加入到配体的氘代二甲亚砜溶液当中，其中硫酸钠和配体的摩尔比为0-1:1，用超声仪超声得到均相体系，将其加入核磁管中，采用核磁共振谱仪进行氢谱表征，得到二胺中两个氢原子NH-1和NH-2的化学位移，将化学位移与硫酸钠浓度之间的关系绘制成标准工作溶液回归曲线；根据曲线得到线性回归方程，计算出回归曲线斜率和截距；

步骤4：称量5mg配体分子并溶解在500uL氘代二甲亚砜中形成溶液，并取步骤1中的样品溶液的50uL，加入体系中，用超声仪超声得到均相体系，将其加入核磁管中待测；

步骤5：将装有样品的步骤4的核磁管放入核磁共振仪，进行核磁共振氢谱测定；

步骤6：将得到的核磁共振氢谱进行解析，得出NH-1和NH-2化学位移，根据步骤3中拟合公式，计算得到硫酸根的浓度，并根据硫酸根浓度换算为无机硫含量。

其中，步骤3所述制备成硫酸钠标准液，具体包括：用去离子水配制浓度为0.03-0.1g/mL的硫酸钠母液，将母液进行梯度稀释，配制8-10个不同浓度的硫酸钠标准溶液，标准溶液浓度范围为0-30mg/mL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明具有较好的精确度、选择性和灵敏度，能够很好地消除其它物质信号的干扰，准确的从组成成分较为复杂体系中检测得到无机硫含量的信号。同时，还具有操作简单、无损稳定的优势，可用于监控药品、食品内无机硫的含量，在食品学、医学领域具有重要的应用价值。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)特异性性强，仅针对于无机硫分子信号作选择性观测，不会受到其它分子结构类似化合物信号干扰；

(2)处理方法简单，无需对待测样品中无机硫进行分离，可直接应用于样品混合无机硫的检测；

(3)测量迅速，只需将样品放入核磁设备，运行一整套如图3的单脉冲序列，在几分钟内就可以得到磁共振图谱，完成检测；

(4)对场强没有依赖性，适用于不同规格的磁共振谱仪，只要利用液态核磁氢谱，得到配体分子内与氮原子直接相连的氢原子的化学位移值，就可以通过与标准曲线对比，计算得到样品中所含有的硫含量，实现对无机硫选择性检测。

附图说明

图1为本发明配体的合成路线图；

图2为本发明合成配体的高分辨核磁

图3为用于采集核磁

图4为本发明化学位移氢谱随浓度的增大变化趋势图；

图5为本发明配体中氢的化学位移随浓度变化的曲线图和回归方程拟合图；

图6为加标红酒样品的化学位移氢谱随硫酸根浓度的增大变化趋势图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。同时，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明公开了一种基于核磁共振的无机硫含量的检测方法，通过核磁共振的方法与阴离子自组装配体识别结合，提出了一种基于三(2-氨基乙基)胺，合成了一种具有拓扑结构的三臂配体分子1,1',1”-(nitrilotris(ethane-2,1-diyl))tris(3-(4-nitrophenyl)urea)，该分子可以选择性识别硫酸根，与之结合后会改变配体的氢信号，间接实现无机总硫的定量检测。该方法避免了传统方法中无机汞和甲醛的使用，克服了化学发光法只能检测无色样品的局限。该检测手段具有定量准确、重现性良好等特点，且结合国标法检可实现高通量检测，为食品漂白后残留超标的无机硫快速筛选提供了一种新途径。同时也可以用于其他类似流质样品生产、质量控制以及掺伪鉴定等领域。在生物学研究、工业生产、以及医学领域也具有广泛的应用价值。

实施方式的主要步骤流程如下：

步骤1：在干燥的三口瓶中加入40-50mmol对硝基苯甲酸溶解在30-37.5mL二甲基甲酰胺中形成溶液，抽空换氮三次后加入48-60mmol三乙胺，开启搅拌，室温下缓慢往体系中滴加滴加44-55mmol叠氮磷酸二苯酯，滴加完毕后，在室温下继续搅拌反应2-3小时；反应完全后，往体系中加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到对硝基苯甲酰叠氮化物；其中，对硝基苯甲酸、三乙胺与叠氮磷酸二苯酯的摩尔比为：1:1.2:1.1

在干燥的三口瓶中加入对38-47.5mmol硝基苯甲酰叠氮化物和分析纯甲苯28-35mL配成的溶液，抽空换氮三次后，把体系加热至回流反应，得到对硝基苯异氰酸酯的甲苯溶液；将体系抽空换氮，往体系中滴加10-12.5mmol三(2-氨基乙基)胺的四氢呋喃溶液，析出橙色固体，将体系加热到90℃，反应2-3小时，溶液颜色从橙色变为淡黄色；反应完全后，过滤，固体用甲苯和乙醚洗涤三次，真空干燥得到淡黄色，即为产物配体；硝基苯甲酰叠氮化物与三(2-氨基乙基)胺的摩尔比为3.8:1

反应过程如图1所示，所得产物配体的

步骤2：制备标准工作溶液，标准溶液的配制方法、标准曲线绘制和公式拟合包括如下步骤，将5752mg硫酸钠溶解在去离子水中，制备100ml母液稀释使用。取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4ml母液，分别对应为28.76、57.52、86.28、115.04、143.80、172.56、201.32和230.08mg硫酸钠，加入去离子水，将其制备成10ml不同浓度的硫酸钠溶液，并将样品命名为0、1、2、3、4、5、6、7和8，分别将目标化合物制备成5mg配体的500μl氘代二甲基亚砜溶液。采用单脉冲序列测定得到核磁共振氢谱，数据点数，39998个，扫描次数16次，采集时间1.99s，停留时间50μs，脉冲宽度10μs，脉冲功率21.8W，光谱宽度19.99ppm(10000赫兹)，FID分辨率0.500025赫兹，总采集时间为1分钟5秒。随着硫酸盐浓度的增加，相同条件下配体中二胺中两个NH峰的化学位移明显偏离，形成明显的规律性，如图4。不同硫酸钠浓度下，配体结构中所有氢的化学位移如表1所示。并绘制浓度与NH-1和NH-2化学位移的标准曲线图，计算出回归曲线斜率和截距，绘制标准工作溶液回归曲线如图5。根据曲线得到线性回归方程，并拟合出公式；其中，图5中，图(a)CH

步骤3：对待测样品用30％H

步骤4：将待测样品加热并煮沸2分钟，将过氧化氢完全分解。操作简单易行，可处理大量样品。

步骤5：用电子天平称量5mg配体分子并溶解在0.5mL氘代二甲亚砜中形成溶液，并取步骤3中的溶液50μL加入体系中，用超声仪超声10min得到均相的体系，并加入5mm核磁管中待用。

步骤6：将步骤5的核磁管放入500MHz AVANCE III核磁共振仪，进行氘代二甲亚砜锁场，自动调谐和匀场，所有实验都是在298K下进行的，没有旋转。使用布鲁克"zg"序列，"DQD"采样模式，数据处理为傅里叶变换，自动相位校正，自动基线校正和氘代二甲亚砜溶剂峰定标为2.50ppm。

步骤7：将得到的氢谱解析出NH-1和NH-2化学位移，根据拟合出的公式，计算可得硫酸根的浓度。

表1：不同硫酸钠浓度下，配体结构中所有氢的化学位移

实施例1

红酒样品的化学位移氢谱随硫酸根浓度的加标回收

实验样品：市售干红葡萄酒。

测定仪器：Bruker AVANCE III 500MHz核磁共振仪。测试温度为298K。

测定方法：在干燥的三口瓶中加入50mmol对硝基苯甲酸溶解在37.5mL二甲基甲酰胺中形成溶液，抽空换氮三次后加入60mmol三乙胺，开启搅拌，室温下缓慢往体系中滴加滴加55mmol叠氮磷酸二苯酯，滴加完毕后，在室温下继续搅拌反应2-3小时；反应完全后，往体系中加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到对硝基苯甲酰叠氮化物；其中，对硝基苯甲酸、三乙胺与叠氮磷酸二苯酯的摩尔比为：1:1.2:1.1。

在干燥的三口瓶中加入对47.5mmol硝基苯甲酰叠氮化物和分析纯甲苯35mL配成的溶液，抽空换氮三次后，把体系加热至回流反应，得到对硝基苯异氰酸酯的甲苯溶液；将体系抽空换氮，往体系中滴加12.5mmol三(2-氨基乙基)胺的四氢呋喃溶液，析出橙色固体，将体系加热到90℃，反应2-3小时，溶液颜色从橙色变为淡黄色；反应完全后，过滤，固体用甲苯和乙醚洗涤三次，真空干燥得到淡黄色，即为产物配体；硝基苯甲酰叠氮化物与三(2-氨基乙基)胺的摩尔比为3.8:1。

用电子天平称量5mg配体分子并溶解在0.5mL氘代二甲亚砜中形成溶液，共配4支，配制含有2.876、5.752、8.628、11.504mg/mL的红酒样品并分别取50uL，加入到含有配体分子氘代二甲亚砜溶液中，用超声仪超声10min得到均相的体系，并加入5mm核磁管中待用。将核磁管放入500MHz AVANCE III核磁共振仪，进行氘代二甲亚砜锁场，自动调谐和匀场，所有实验都是在298K下进行的，没有旋转。使用布鲁克"zg"序列，"DQD"采样模式，数据处理为傅里叶变换变换，自动相位校正，自动基线校正和氘代溶剂残留峰定标为2.50ppm，即可得到样品化学位移氢谱(如图6)。并代入拟合出的公式(表2、表3)。拟合后最大相对误差不超过-16％。

表2：根据加标红酒样品的NH-1化学位移检测无机硫浓度；

表3：根据加标红酒样品的NH-2化学位移检测无机硫浓度；

实施例2开心果样品的化学位移氢谱对应硫酸根浓度的加标回收

实验样品：市售炒货开心果。

测定仪器：Bruker AVANCE III 500MHz核磁共振仪。测试温度为298K。

测定方法：在干燥的三口瓶中加入40mmol对硝基苯甲酸溶解在30mL二甲基甲酰胺中形成溶液，抽空换氮三次后加入48mmol三乙胺，开启搅拌，室温下缓慢往体系中滴加滴加44mmol叠氮磷酸二苯酯，滴加完毕后，在室温下继续搅拌反应2-3小时；反应完全后，往体系中加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂，得到对硝基苯甲酰叠氮化物；其中，对硝基苯甲酸、三乙胺与叠氮磷酸二苯酯的摩尔比为：1:1.2:1.1。

在干燥的三口瓶中加入对38mmol硝基苯甲酰叠氮化物和分析纯甲苯28mL配成的溶液，抽空换氮三次后，把体系加热至回流反应，得到对硝基苯异氰酸酯的甲苯溶液；将体系抽空换氮，往体系中滴加10mmol三(2-氨基乙基)胺的四氢呋喃溶液，析出橙色固体，将体系加热到90℃，反应2-3小时，溶液颜色从橙色变为淡黄色；反应完全后，过滤，固体用甲苯和乙醚洗涤三次，真空干燥得到淡黄色，即为产物配体；硝基苯甲酰叠氮化物与三(2-氨基乙基)胺的摩尔比为3.8:1。

用电子天平称量5mg配体分子并溶解在0.5mL氘代二甲亚砜中形成溶液，配制含有3.00mg/mL的开心果浸出液样品10mL，用1mL30％H

表4根据加标开心果浸出液样品的NH-1和NH-2化学位移检测无机硫浓度

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。