一种提高小孔忍冬桑黄胞内黄酮产量的方法

摘要

本发明公开了一种提高小孔忍冬桑黄胞内黄酮产量的方法，属于微生物发酵领域。本发明的小孔忍冬桑黄(Sanghuangporus lonicericola)能够通过液体发酵产黄酮类化合物，通过在其液体发酵培养基中添加一定量的植物激素多效唑，其胞内黄酮得率相对于未添加多效唑时提高了约0.47‑3.27倍，黄酮产量提高约1.30‑2.83倍，该物质能够稳定地促进桑黄黄酮的合成；同时，本发明还提供了在添加多效唑诱导下，小孔忍冬桑黄黄酮合成的培养条件，为提高桑黄属真菌黄酮的研究提供一定的理论及实践基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高小孔忍冬桑黄胞内黄酮产量的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

小孔忍冬桑黄(Sanghuangporus lonicericola)隶属于真菌界(Fungi)，担子菌门(Basidiomycota)，蘑菇纲(Agaricomycetes)，锈革孔菌目(Hymenochaetales)，锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)，桑黄孔菌属(Sanghuangporus)，是目前所知的14种桑黄孔菌属真菌之一。

桑黄孔菌属真菌是药用真菌中少数含有黄酮类化合物的真菌之一。具有多种生物活性，如抗肿瘤、降血糖、增强免疫力、抗氧化、抗菌、抗炎等。但自然界中的野生桑黄数量少，人工栽培桑黄技术复杂，且周期相对较长，因此，可研究通过液体深层发酵的方式来生产并提高黄酮类化合物的产量。

目前，能够促进黄酮产量的方式有发酵培养基及发酵条件的优化；在液体发酵培养基中添加诱导物，如合成黄酮类化合物的前体物质，如香豆素、肉桂酸等，但该方法的不足之处在于生产成本相对较高；现有研究表明，在发酵培养基中添加一定浓度的植物激素能够促进黄酮类化合物的产量。因此，如何大幅提高桑黄黄酮的发酵产量，以进一步降低生产成本，以实现桑黄黄酮类化合物的广泛应用已成为桑黄孔菌属真菌液体发酵急需解决的问题。

多效唑，化学名(2RS,3RS)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)戊-3-醇，分子式C

发明内容

本发明的目的在于针对现有桑黄孔菌属真菌中黄酮类化合物产量较低现象，提供一种能稳定提高桑黄黄酮产量、且生产工艺简单的方法。

本发明提供了多效唑在提高桑黄孔菌属真菌黄酮类化合物产量方面的应用。

在一种实施方式中，所述桑黄孔菌属真菌包括但不限于小孔忍冬桑黄(Sanghuangporus lonicericola)、大孔忍冬桑黄、桑树桑黄、暴马桑黄、栎生桑黄等。

在一种实施方式中，所述黄酮类化合物包括但不限于柚皮素、异樱花素、橙皮素、甲基桑黄黄酮A、甲基桑黄黄酮B、异甲基桑黄黄酮B、紫铆素、樱桃苷、短叶松素、二氢槲皮素、二氢杨梅素、高圣草酚、高车前素、樱黄素、芫花素、金合欢素、杨梅素、异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁、儿茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、鼠李糖苷等中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述小孔忍冬桑黄包括但不限于小孔忍冬桑黄(Sanghuangporus lonicericola)已公开于《药用真菌桑黄的种类解析》。

在一种实施方式中，所述应用是将多效唑加入至桑黄孔菌属真菌的发酵培养基中。

在一种实施方式中，所述多效唑的终浓度≥0.03mg/mL。

在一种实施方式中，所述多效唑的终浓度为0.10～0.15mg/mL。

在一种实施方式中，所述多效唑在接种前或发酵第0～48h内加入至发酵培养基中。

本发明还提供一种利用小孔忍冬桑黄发酵生产黄酮的方法，所述方法是将所述小孔忍冬桑黄在含多效唑的发酵培养基中的发酵。

在一种实施方式中，所述多效唑在发酵培养基中的浓度≥0.03mg/mL。

在一种实施方式中，所述多效唑在发酵培养基中的浓度为0.03～0.20mg/mL。

在一种实施方式中，所述方法先将小孔忍冬桑黄菌进行菌种活化，再将活化的菌种用于种子液制备，再将种子液转移至含多效唑的发酵培养基中发酵产胞内黄酮。

在一种实施方式中，所述方法先将小孔忍冬桑黄菌进行菌种活化，再将活化的菌种用于种子液制备，再将种子液转移至发酵培养基中，并于发酵第0～48h内向发酵培养基中加入多效唑。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的初始pH≥5.5。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的初始pH为5.5～7.5。

在一种实施方式中，所述小孔忍冬桑黄菌菌种活化步骤为：将斜面菌种取直径为5mm的菌块，在无菌条件下接种于PDA平板上活化培养7-9天，培养温度为28℃。

在一种实施方式中，所述小孔忍冬桑黄菌种子液制备方法为：将经活化后的小孔忍冬桑黄菌菌种在无菌条件下，接种直径为2-3mm的菌片5-6片至种子培养基中，装液量为100mL/250mL；115℃灭菌20min；培养条件：温度28℃，160r/min恒温摇床培养6-7天，即得种子液。

在一种实施方式中，所述种子培养基每L含有：葡萄糖20g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水硫酸镁0.5g。

在一种实施方式中，所述小孔忍冬桑黄液体发酵产胞内黄酮的方法为：将所述种子液按10％(V/V)的接种量接种至液体发酵培养基中，培养温度28℃，180r/min恒温摇床培养7-9天。

在一种实施方式中，所述方法还将发酵获得的发酵液用80目筛子过滤，洗涤后于60℃烘干至恒重，即得发酵菌丝体。

在一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：葡萄糖20g、酵母浸粉3g、磷酸二氢钾1.0g、七水硫酸镁0.5g，L-苯丙氨酸0.3g。

本发明还要求保护应用所述方法制备的富含黄酮的小孔忍冬桑黄菌丝体。

本发明还提供所述方法在生产黄酮或含黄酮的产品中的应用。

有益效果：本发明提供了多效唑提高小孔忍冬桑黄菌株发酵产黄酮类化合物方面的新用途，通过在其发酵培养基中添加一定量多效唑，可使小孔忍冬桑黄菌丝体中的胞内黄酮得率相对于未添加多效唑时提高约0.47-3.27倍，可使胞内黄酮产量提高约1.30-2.83倍，该物质能够稳定地促进桑黄黄酮的合成；同时，本发明还提供了在多效唑诱导条件下，利用小孔忍冬桑黄菌株发酵产黄酮类化合物的基本发酵条件，为提高桑黄属真菌黄酮的研究提供一定的理论及实践基础。

附图说明

图1为不同外源物对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响；其中，生物量显著性差异:#，P<0.05、##，P<0.01、###，P<0.001；黄酮得率显著性差异：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

图2为多效唑添加浓度对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响；其中，生物量显著性差异:#，P<0.05、##，P<0.01、###，P<0.001；黄酮得率显著性差异：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

图3为多效唑添加时间对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响；其中，生物量显著性差异:#，P<0.05、##，P<0.01、###，P<0.001；黄酮得率显著性差异：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

图4为培养基初始pH对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响；其中，生物量显著性差异:#，P<0.05、##，P<0.01、###，P<0.001；黄酮得率显著性差异：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

图5为小孔忍冬桑黄黄酮得率随发酵时间的变化曲线；黄酮得率处理组与对照组相比：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

图6为小孔忍冬桑黄生物量随发酵时间的变化曲线；生物量对照组与处理组相比：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

图7为小孔忍冬桑黄培养基残糖量随发酵时间的变化曲线；残糖量对照组与处理组相比：*，P<0.05、**，P<0.01、***，P<0.001。

具体实施方式

发酵产物的处理及胞内黄酮的提取：

菌丝体→过滤、烘干、磨粉→干燥菌丝体粉末(50mg)→90％乙醇浸泡24h(料液比1:50)→水浴浸泡1.0h(70℃)→超声提取1.0h(50℃)→离心(10000r/min，10min)→定容→胞内黄酮粗提物。在不做特别说明的情况下，具体实施方式中所提及的“黄酮”是指能够按照该测定方法测得的黄酮类化合物，包括但不限于柚皮素、异樱花素、橙皮素、甲基桑黄黄酮A、甲基桑黄黄酮B、异甲基桑黄黄酮B、紫铆素、樱桃苷、短叶松素、二氢槲皮素、二氢杨梅素、高圣草酚、高车前素、樱黄素、芫花素、金合欢素、杨梅素、异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁、儿茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、鼠李糖苷等。

黄酮含量测定：黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，测定体系为100uL的样品浴液，补加无水乙醇至200uL，然后按顺序加入40uL 5％NaNO

黄酮得率(mg/g)：黄酮得率＝总黄酮含量(mg)/小孔忍冬桑黄菌丝体质量。

生物量(mg/L)：以单位体积的发酵液中小孔忍冬桑黄菌丝体干重表示。

外源物的添加方式为：先将外源物用二甲基亚砜(DMSO)溶液配制成一定浓度母液，采用过滤方式除菌，加入一定体积外源物母液至无菌液体发酵培养基中并调节至所需终浓度。

种子培养基(每1L)：葡萄糖20g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水硫酸镁0.5g，pH自然。

发酵培养基(每L)：葡萄糖20g、酵母浸粉3g、磷酸二氢钾1.0g、七水硫酸镁0.5g，L-苯丙氨酸0.3g，pH 6.9±0.2。

实施例1不同外源物对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响

a.菌种活化：将小孔忍冬桑黄菌斜面菌种在无菌条件下接种于PDA平板上活化培养7-9天，培养温度为28℃；

b.种子培养：取直径为2-3mm的菌片5-6片，接种至装液量100mL/250mL三角瓶的已灭菌种子培养基中，培养温度28℃，160r/min恒温摇床培养6-7天获得种子液；

c.发酵培养：250mL三角瓶中加入100mL发酵培养基，115℃灭菌20min；用DMSO溶解并配制成母液浓度为30mg/mL的外源物溶液，采用过滤方式除菌，其中外源物包括多效唑(PP333)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)；在接种前在无菌条件下加入100uL外源物母液调节终浓度至0.03mg/mL，以添加相同体积经过滤除菌的无菌水作为CK组，DMSO溶液作为溶剂对照组(DMSO组)；再将步骤b培养获得的种子液按10％(V/V)的接种量接种至液体发酵培养基中，培养温度28℃，180r/min恒温摇床培养7天，80目筛子过滤，将培养基用蒸馏水冲洗干净，60℃烘干至恒重，即得发酵菌丝体；

发酵结束后，测定各组小孔忍冬桑黄菌丝体胞内黄酮的产量。结果显示(图1)，添加无菌水和DMSO时的黄酮得率与生物量均无显著差异，说明确实是外源物的诱导使黄酮得率增加，此外，多效唑和溶剂对照组的黄酮得率分别为10.744mg/g和5.679mg/g，黄酮得率提高了89.19％；结合生物量，二者黄酮产量分别为64.455mg/L和28.050mg/L，产量提高了129.79％。

实施例2多效唑添加浓度对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响

培养基与培养方法同实施例1，区别在于，步骤c以多效唑为外源物，将多效唑用DMSO溶液配制成浓度为0-200mg/mL的母液，经过滤除菌后，添加一定体积母液至发酵培养基中，调节至终浓度为分别为0.03、0.05、0.10、0.15、0.20mg/mL。

发酵结束后，测定小孔忍冬桑黄菌丝体胞内黄酮的产量。结果显示(图2)，在生物量浓度为0.10和0.15mg/mL时，黄酮得率分别达23.821mg/g和24.269mg/g，相对于实施例1中的溶剂对照组(5.679mg/g)，黄酮得率分别提高了3.19倍和3.27倍；生物量浓度为0.10和0.15mg/mL时，黄酮产量分别为107.542mg/L和106.995mg/L，分别是DMSO组的2.83倍和2.81倍；生物量终浓度为0.20mg/mL时，黄酮得率达18.788mg/g，黄酮产量为83.166mg/L。

实施例3多效唑添加时间对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响

培养基与培养方法同实施例1，区别在于，步骤c以多效唑为外源物，将多效唑用DMSO溶液配制成浓度为200mg/mL的母液，经过滤除菌后，分别在发酵第0、24、48、72、96、120、144h添加一定体积的多效唑母液调节至多效唑在发酵培养基中的终浓度为0.10mg/mL。

发酵结束后，测定小孔忍冬桑黄菌丝体胞内黄酮的产量。结果显示(图3)，在第0天添加外源物，菌体的生长受到明显抑制，但黄酮得率可达26.223mg/g，较DMSO组提高1.86倍，发酵第24h和48h的黄酮得率分别为24.361mg/g和23.363mg/g，较DMSO组分别提高1.66倍、1.55倍；第0、24、48h的生物量分别为91.174mg/L、120.841mg/L和120.228mg/L，较DMSO组分别提高0.78倍、1.36倍、1.35倍；超过96h后，黄酮得率低于15.474mg/g，黄酮产量低于85.503mg/L。

实施例4培养基初始pH对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响

培养基与培养方法同实施例1，区别在于，步骤c以多效唑为外源物，将多效唑用DMSO溶液配制成一定浓度的母液，经过滤除菌后，加入至发酵培养基中，使多效唑在发酵培养基中的终浓度为0.10mg/mL，并分别用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节pH至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5或11.5。

发酵结束后，测定小孔忍冬桑黄菌丝体胞内黄酮的产量。结果显示(图4)，pH为5.5～11.5时，黄酮得率达26.003mg/g～29.200mg/g；pH为5.5～7.5时，黄酮得率达26.003mg/g～29.200mg/g，较DMSO组提高了1.84-2.19倍，黄酮产量达62.931～101.116mg/L；pH为7.5时，黄酮产量较DMSO组提高0.98倍。

实施例5发酵时间对小孔忍冬桑黄黄酮合成及生物量的影响

培养基与培养方法同实施例1，区别在于，步骤c以多效唑为外源物，将多效唑用DMSO溶液配制成一定浓度的母液，经过滤除菌后，加入至发酵培养基中，使多效唑在发酵培养基中的终浓度为0.10mg/mL，以未添加(CK组)为对照，比较PP333组与CK组在菌体生长、产物生成及底物消耗等方面随时间的变化情况，分别检测培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天的发酵样品。每日取样后，测定小孔忍冬桑黄菌丝体胞内总黄酮的产量、生物量、残糖量。

结果显示，PP333组黄酮得率从第2天开始即显著高于对照组(图5)，培养至第5d后即可达到19.023mg/g以上的得率，产量为58.084mg/L，在培养第8天得率为21.946mg/g，产量为88.238mg/L。生物量随着培养时间的增加，一直处于逐渐增加的趋势，但增加速度低于CK组(图6)，这与葡萄糖的消耗曲线能够一一对应(图7)，即CK组的葡萄糖消耗快于处理组，CK组的葡萄糖在第6天后基本完全消耗，且实验中发现，对照组菌体培养第6-7天后，培养基颜色变深，出现菌体出现自溶的情况。因此，小孔忍冬桑黄发酵的结束时间，在未添加外源物时宜控制在6-7天；添加外源物时培养时间宜控制在6-8天。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。