一种黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶及在黄酮类化合物合成领域的应用

摘要

本发明涉及一种黄酮合酶I/黄烷酮‑3‑羟化酶及在黄酮类化合物合成领域的应用。本发明公开了一种松叶蕨黄酮合酶I/黄烷酮‑3‑羟化酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明首次从蕨类植物中克隆鉴定的一个可以在黄烷酮C2和C3位之间引入双键或C3位引入羟基的双功能酶。其对常见的黄烷酮化合物有较高的催化活性，为生产黄酮类化合物提供了一个候选基因。PnFNS I/F3H可以在大肠杆菌体内可合成黄酮和二氢黄酮醇，在转基因拟南芥中同时提高植物黄酮和黄酮醇类化合物含量。该基因可用于在大肠杆菌和植物底盘中生产黄酮和黄酮醇类化合物，具有较高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于黄酮化合物催化酶技术领域，具体涉及来源于松叶蕨的黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶、所述酶的编码核酸物质、包含所述核酸物质的表达载体、宿主细胞、表达所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的工程菌及其在黄酮类化合物合成领域的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

黄酮类化合物作为一类重要的次级代谢产物，广泛存在于陆生植物。研究表明，黄酮类化合物具有抗菌，抗病毒，抗癌，抗炎和抗氧化等多种生物活性，在植物中参与植物的生长发育，具有增强植物抵抗非生物胁迫的能力。

黄酮合酶I(Flavone synthase I,FNS I)和黄烷酮-3-羟化酶(Flavanone3β-hydroxylase,F3H)都属于2-酮戊二酸/铁(II)依赖性双加氧酶(2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenases,2ODDs)，黄酮合酶I参与黄酮C2和C3位之间双键的形成，是植物黄酮合成的关键酶。黄烷酮-3-羟化酶催化(2S)-黄烷酮生成(2R，3R)-二氢黄酮醇，决定了植物中黄酮醇和花色素的合成。在黄酮类化合物生物合成途径中，黄酮合酶I和黄烷酮-3-羟化酶分别是合成黄酮和黄酮醇的关键酶。蕨类植物富含黄酮类化合物，具有重要的药理活性，但是其黄酮合酶I和黄烷酮-3-羟化酶尚未报道。

松叶蕨(Psilotum nudum)，是我国仅有的松叶蕨属植物，属于蕨类植物中较为原始的类群。松叶蕨中富含黄酮类化合物，其提取物具有一定程度的抗细菌和抗真菌的活性。但目前还没有关于松叶蕨中参与黄酮类化合物生物合成关键酶的研究报道。

发明内容

基于上述技术背景，本发明提供了一种黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶，该酶来源于蕨类植物松叶蕨，属于2-酮戊二酸/铁(II)依赖性双加氧酶，具有铁离子依赖性，能够催化多种黄烷酮类化合物生成相应的黄酮类化合物。上述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶能够在黄烷酮C2和C3位之间引入双键或在C3位引入羟基，是一种双功能酶，对于黄酮及黄酮醇类化合物的体外合成具有重要作用。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶，所述酶具有SEQ IDNO.1所示氨的基酸序列。

本发明第二方面，提供编码第一方面所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的核酸物质。

上述第二方面所述，所述核酸物质包括由于密码子简并性能够翻译得到第一方面所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶或衍生多肽的核酸物质。

进一步的，所述编码核酸为DNA，包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA；所述DNA可以为单链或双链的，可以为编码链或非编码链；本发明提供的一种具体的实施方式中，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶，其编码核酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明第三方面，提供包含第二方面所述核酸物质的表达载体。

优选的，所述表达载体为细菌质粒或酵母质粒，包括pET系列载体。

本发明第四方面，提供包含第二方面所述核酸物质、第三方面所述表达载体的宿主细胞。

优选的，所述宿主细胞为微生物细胞，具体为大肠杆菌。

本发明第五方面，提供一种表达黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的工程菌，所述工程菌与野生型相比，被修饰为具有第一方面所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶表达。

优选的，所述工程菌的出发菌株选自大肠杆菌或酵母菌。

进一步的，所述工程菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌通过转化重组表达质粒实现所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的表达。

本发明第六方面，提供第一方面所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶、第二方面所述编码核酸、第三方面所述表达载体、第四方面所述宿主细胞、第五方面所述表达黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的工程菌在植物黄酮合成领域的应用。

上述第六方面所述植物黄酮包括黄酮及黄酮醇，所述在植物黄酮合成领域的应用包括但不限于以下任意一种：

(1)提高植物中黄酮类化合物的含量从而获得具有良好抗性的植株；

(2)获取高黄酮类化合物含量的植株作为提取原料。

所述应用的一种具体方式为采用第三方面所述表达载体的农杆菌转化到拟南芥中从而获得阳性转染植株。

本发明第七方面，提供一种黄酮类化合物的生物合成方法，所述合成方法以黄烷酮类化合物为底物，加入第一方面所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶或第五方面所述工程菌合成相应的黄酮类化合物。

优选的，所述底物为包括但不限于圣草酚、高圣草素、橙皮素、乔松素、甘草素中的任意一种。

优选的，所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的体外合成温度为0～50℃；进一步的，体外合成温度为38～45℃。

优选的，所述黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶的体外合成pH为5～8.5；进一步的，体外合成pH为7.5～8.5。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：PnFNS I/F3H基因全长cDNA扩增产物的电泳图。

图2：PnFNS I/F3H蛋白SDS-PAGE电泳图；

其中：M:蛋白分子质量标准

泳道1：空载体pET32a蛋白上清；

泳道2：空载体pET32a蛋白纯化；

泳道3：PnFNS I/F3H蛋白上清；

泳道4：PnFNS I/F3H蛋白纯化.

图3：PnFNS I/F3H以柚皮素为底物的酶活催化反应HPLC图谱。

其中：图3A为底物相对活性图；图3B和图3C为相关产物P1(B)和P2(C)的MS/MS裂解谱；Dihydrokaempferol：二氢山奈酚；Apigenin：芹菜素。

图4：PnFNS I/F3H底物选择性分析的HPLC图谱。

图5：PnFNS I/F3H酶活催化反应的最适pH和最适温度。

图6：PnFNS I/F3H在大肠杆菌中饲喂底物柚皮素的HPLC图谱；Dihydrokaempferol：二氢山奈酚；Apigenin：芹菜素。

图7：PnFNS I/F3H基因在拟南芥中的异源表达分析；

图7A：PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥的RT-PCR分析；图7B：PnFNS I/F3H-dmr6转基因拟南芥的RT-PCR分析；PnFNS I/F3H在选定的转基因品系中转录；AtActin被用作参考序列。

图8：PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥中黄酮和黄酮醇分析的HPLC-MS图；

其中，图8A-D：WT、tt6突变体和PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥中金圣草素(A)、芹菜素(B)、木犀草素(C)和山奈酚(D)、槲皮素(E)的分子离子峰；

图8a-e：PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥中金圣草素(a)、芹菜素(b)、木犀草素(c)和山奈酚(d)、槲皮素(e)分子离子的MS/MS裂解谱。

图9：PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥中黄酮和黄酮醇相对含量分析；

图9A：WT、tt6突变体和PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥中黄酮化合物的相对定量；

图9B：WT、tt6突变体和PnFNS I/F3H-tt6转基因拟南芥中黄酮醇化合物的相对定量；Chrysoeriol：金圣草素，Apigenin：芹菜素，Luteolin：木犀草素，Kaempferol：山奈酚，Quercetin：槲皮素。

图10：PnFNS I/F3H-dmr6转基因拟南芥中黄酮和黄酮醇含量分析；

图10A-B：WT、dmr6突变体和PnFNS I/F3H-dmr6转基因拟南芥中芹菜素(A)和槲皮素(B)的分子离子峰；C-D：WT、dmr6突变体和PnFNS I/F3H-dmr6转基因拟南芥中芹菜素(C)和槲皮素(D)的含量；

图10a-b：PnFNS I/F3H-dmr6转基因拟南芥中芹菜素和槲皮素分子离子的MS/MS裂解谱；Apigenin：芹菜素，Quercetin：槲皮素。

图11：实施例中所述PCR扩增程序；

图11A为实施例1中1.2.3部分PCR扩增程序；

图11B为实施例1中1.4部分PCR扩增程序；

图11C为实施例4中4.4部分PCR扩增程序；

图11D为实施例4中4.5部分PCR扩增程序。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1表达基因PnFNS I/F3H的克隆

1.1CTAB-PVP法提取松叶蕨总RNA

CTAB-PVP提取缓冲液配制方法如下：

100mM Tris·HCl(pH 8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；溶液配置用DEPC处理过的ddH

提取方法：

(1)水浴锅调至65℃，将配置好的CTAB提取液置于其中预热。取适量材料至研钵中，加液氮研磨成粉末状。

(2)将研磨好的材料装入液氮速冻的进口2mL离心管中，加入600μL CTAB提取液，上下颠倒混合均匀。

(3)65℃水浴，每隔10min混匀一次，加热30min。

(4)取出离心管待温度降至室温，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12,000rpm离心10min。

(5)吸取上清至进口2mL离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀几次，12,000rpm离心10min。

(6)重复(5)操作。

(7)再吸取上清至新的进口1.5mL离心管中，加入2/3体积的8M LiCl溶液，-20℃放置过夜。

(8)第二天，-20℃取出样品，待溶液解冻后，4℃12,000rpm离心10min，去掉上清，沉淀用700μL 75％乙醇洗涤两次。

(9)弃掉乙醇，将剩余的液体尽量吸干净，于超净台中吹干。

(10)乙醇挥干后，加入30μL DEPC水溶解RNA。用Biophotometer plus核酸蛋白测定仪测试RNA浓度,凝胶电泳看RNA质量。

1.2PnFNS I/F3H基因全长扩增

1.2.1引物设计

利用软件Bioxm 2.0的sequence analysis程序找出PnFNS I/F3H的开放阅读框(Open reading frame)。根据pET32a载体序列，选择合适酶切位点，设计构建蛋白表达载体所用引物。

全长引物：

PnFNS I/F3H-F:CGGGATCCATGGCTTCTTTGATCACTAA；(SEQ ID No.3)

PnFNS I/F3H-R:CCCAAGCTTTCAGGCCTTTGTTCCTGTTT；(SEQ ID No.4)

1.2.2cDNA合成

以提取的上述松叶蕨RNA为模板，用Revert Travel

逆转录体系：

逆转录程序

得到cDNA，存于-20℃。

1.2.3目的基因扩增

将cDNA稀释5倍，以此为模板扩增。

扩增体系：

扩增程序如图11A所示。

用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，切下目的片段，用Gel Extraction Kit试剂盒回收目的片段。

PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)，将目的大小条带切胶回收，方法如下。

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％，W/V，g/100ml)，并用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：

(1)将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％，W/V，g/100ml)后，经溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的大小条带的胶块，放入1.5mL离心管。

(2)加入400μL Binding Buffer(XP2)，在55℃水浴溶解胶块。期间每隔2-3min颠倒震荡离心管一次。

(3)将上述溶胶液转移至HiBind DNA column，HiBind DNA column置于2mL的收集管中，12,000rpm离心1min。

(4)弃掉收集管中的滤液，向HiBind DNA column中加入300μL Binding Buffer(XP2)。12,000rpm离心1min，弃掉滤液。

(5)加入700μL SPW Wash Buffer，12,000rpm离心1min。

(6)重复上步一次。

(7)弃掉滤液，将空HiBind DNA column室温12,000rpm离心2min挥干剩余乙醇。

(8)将HiBind DNA column置于新的1.5mL离心管中，开盖放置至乙醇挥干。在柱子膜中央加入30μL ddH

(9)使用Biophotometer plus核酸蛋白测定仪测定胶回收产物浓度及质量，回收片段立即使用或-20℃保存。

1.3目的片段连接平端载体及转化大肠杆菌DH5α

将目的片段连接到平端载体pTOPO-Blunt上。

连接体系：

程序：

将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中。

转化方法：将Escherichia coli DH5α感受态细胞置于冰上解冻，加入10μL连接产物混匀，冰上放置半小时后42℃热激90s，随后冰上放置2min，加入400μL无抗生素液体LB培养基，37℃110rpm振荡培养1-2h。将菌液均匀涂于Amp LB固体培养基上，37℃培养箱中倒置过夜。

LB培养基组分(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g，加水溶解后，调pH至7.0，定容。固体培养基加入琼脂(12g/L)后，高压蒸汽灭菌。

1.4单克隆阳性验证

在96孔板中加入100μL Amp LB液体培养基，从固体筛选培养基中挑取长势良好的单克隆挑至96孔板中，37℃110rpm振荡培养3-4h，以菌液为模板进行菌落PCR阳性鉴定。

PCR反应体系：

程序如图11B所示。

利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，将PCR产物对应目的条带大小的单克隆送去测序，测序正确后，将阳性单克隆菌液存菌，存菌体系为70μL DMSO和930μL菌液，混匀后冻于-80℃。

实施例2基因蛋白表达及酶活功能分析

2.1蛋白表达载体的构建

2.1.1扩增目的基因

将测序正确的单克隆菌液37℃120rpm过夜培养，利用Plasmid Mini Kit试剂盒抽提质粒：

(1)将所存菌株MemUGT1-pTOPO-DH5α分别划LB板(含100μg/mL Amp)，37℃，12h后长出单克隆，挑取单克隆于4mL含Amp抗性的培养基中，37℃，110rpm培养10h。

(2)取菌液室温12,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能倒掉上清。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1，涡旋振荡至菌体完全悬浮。

(4)向离心管中加入150μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(5)向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速的上下颠倒混匀，此时将出现絮状沉淀。静置2min后，12,000rpm离心5min。

(6)将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3(吸附柱放入收集管中)。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(7)向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(8)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，挥干乙醇后，向吸附膜的中间部分悬空滴加30-50μL蒸馏水，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

以质粒为模板，扩增目的片段，扩增体系及程序同1.2.3。利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，胶回收目的片段。

2.1.2酶切与连接

用限制性内切酶切目的基因片段和pET32a空载体，37℃酶切3.5h，利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，胶回收酶切片段。

酶切体系：

将目的基因与pET32a载体用T4 DNA Ligase连接。

连接体系：

16℃过夜连接。

2.1.3转化大肠杆菌BL21

将连接产物转化至E.coli DH5α中。挑取过夜培养的E.coli DH5α单克隆至4-5mLAmp LB液体培养基中，37℃120rpm培养12h，利用Plasmid Mini Kit试剂盒抽提质粒。将质粒转入E.coli BL21中。转化方法同上。

2.2基因重组蛋白原核表达

2.2.1重组蛋白诱导表达

Pn2ODD-pET32a-BL21接种到Amp LB固体平板，37℃倒置培养过夜。挑取长势良好的单克隆于2mL Amp LB液体培养基中，37℃110rpm振荡培养4-5h。将菌液按照1:100比例接入到200mL Amp LB液体培养基中，37℃110rpm振荡培养至OD600约0.6～0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM。将其置于16℃110rpm振荡诱导不少于12小时。

2.2.2重组蛋白分离和纯化

(1)菌体收集：将诱导过夜的菌液4,000rpm,5min离心收菌。

(2)洗涤菌体：加入15-20mL Binding buffer重悬菌体，5,000rpm,离心5min，弃掉上清。重复操作两次。

(3)超声破碎：加入15-20mL Binding buffer重悬菌体，低温超声破碎。4℃10,000g离心20min。收集上清。沉淀加入Binding buffer重悬，取30μL上清和沉淀样品用于蛋白电泳。

(4)蛋白纯化：将上清加入预装镍柱中，待上清流尽后，加入一个柱体积的Washbuffer除去杂蛋白。随后用含250mM咪唑5mL Elution buffer洗脱目的重组蛋白。取30μL样品用于蛋白电泳。

(5)换液浓缩：收集目的重组蛋白，将其全部加入预冷好的超滤管中，4,000g离心7min。向超滤管中加满Binding buffer，上下颠倒轻轻混匀，重复操作两次。取出超滤管的蛋白，将其转移到预冻好的EP管中。

(6)蛋白保存：向蛋白中加入80％甘油，甘油的体积约为蛋白体积的七分之一。随后将蛋白分装，-80℃保存备用。

Binding buffer：分别称取2.42g Tris-HCl、29.22g NaCl、0.34g imidazole，加水溶解，定1000mL，灭菌后加入70μLβ-巯基乙醇，4℃保存。

Elution buffer：分别称取2.42g Tris-HCl、29.22g NaCl、34g imidazole，加水溶解，定容1000mL，灭菌后加入70μLβ-巯基乙醇，4℃保存。

2.2.3蛋白SDS-PAGE电泳

目的蛋白的表达及分离纯化情况用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium DodecylSulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)进行检测。

(1)组装电泳装置，将玻璃板固定于胶架上。

(2)配制12％分离胶，加入到电泳仪中，加水液封，静置直至分离胶凝固。

(3)配制5％浓缩胶，倒掉上层水。将配制好的5％的浓缩胶混匀后立即倒入，将孔梳插入到玻璃板间(避免气泡的产生)，待胶凝固后拔出梳子。

(4)在蛋白上清液和纯化的蛋白中分别加入适量loading buffer，在沸水中煮5min 13,000rpm离心10min，取上清10μL点样，同时吸取蛋白Marker 2.5μL点样。

(5)向电泳槽中加适量电泳缓冲液，先90V恒压进行电泳，待样品电泳到分离胶时改为130V恒压电泳，直至溴酚蓝至胶的下沿，停止电泳。

(6)取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝R-250染色液中浸泡染色，室温下轻摇染色2h。

(7)用蒸馏水冲洗掉蛋白胶表面的染色液，冲洗2～3次后置于脱色液中脱色2h，脱色过程中更换脱色液数次，直至蛋白胶背景洗干净。

(8)观察结果，照相保存并进行分析，蛋白电泳结果如图2。

2.3酶活功能鉴定

2.3.1体外酶活反应

以柚皮素为底物，对目的蛋白PnFNS I/F3H进行体外功能测定，以pET32a空载体蛋白作为阴性对照。体外酶活反应体系(100μL)，如下：

37℃反应2h，中间间隔1h补充1μL Vc+Fe

2.3.2酶活产物分析

为了验证PnFNS I/F3H的体外酶活功能，HPLC被用于检测上述酶活反应的产物。HPLC分析色谱柱型号：Agilent Eclipse XD-C18，5μm，4.6×150mm。

检测波长为：280nm和350nm。进样量：20μL。

HPLC分析条件如下：

使用标准品的保留时间进行酶活产物鉴定。测定结果如图3。

2.3.3底物选择性分析

对目的蛋白PnFNS I/F3H进行体外功能测定，以pET32a空载体蛋白作为阴性对照。测定结果如图4。反应底物分别为橙皮素(Hesperetin)、乔松素(Pinocembrin)、圣草酚(Eriodictyol)、高圣草素(Homoeriodictyol)和甘草素(Liquiritigenin)；产物分别为香叶木素(Diosmetin)、白杨素(Chrysin)、木犀草素(Luteolin)、金圣草素(Chrysoeriol)和7，4’-二羟基黄酮(4',7-dihydroxyflavone)

2.3.4最适pH和温度

以柚皮素为底物，检测PnFNS I/F3H蛋白酶促反应最适pH和温度。

测定pH对反应速率的影响，温度固定为37℃，酶活所用pH包括5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。测定温度对反应速率的影响，在pH 7.0条件下进行，反应温度为0℃，5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃。测定结果如图5。

2.3.5酶学动力学参数测定

酶学动力学分析在最适pH和温度条件下进行，以柚皮素和高圣草素为底物，底物浓度分别为2、4、8、10、20、50、100和150μM。总体积为100μL，反应时间为10min，平行实验3次。实验结果见表1。

表1

实施例3利用大肠杆菌PnFNS I/F3H-pET32a-BL21生物合成芹菜素和二氢山奈酚。

(1)在37℃恒温培养箱中活化菌株，挑取单克隆接种至4mL LB液体培养基中(含Amp 100μg/mL)中，37℃培养箱继续培养7h；

(2)按照1:100的比例将目的菌株和对照菌株接种到50mL的抗性LB培养基中，37℃，200rpm摇床中培养至OD600＝0.6-0.8，加IPTG使其终浓度为0.5mM，20℃恒温培养6-7h；

(3)向菌液中加入DMSO溶解的底物(柚皮素)，底物浓度为150μM，放入20℃继续培养一段时间；

(4)每隔12h取出500μL菌液，加入等体积的乙酸乙酯萃取2-3次，合并有机相，吹干样品，加入100μL甲醇重溶，用HPLC分析产物。PnFNS I/F3H在大肠杆菌中饲喂底物柚皮素的结果如图6。

实施例4利用转基因植物PnFNS I/F3H-tt6和PnFNS I/F3H-dmr6生物合成黄酮和黄酮醇类化合物。

4.1目的基因过表达载体的构建

根据目的基因PnFNS I/F3H设计gateway引物

attB1-PnFNS I/F3H-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAACCATGGCTTCTTTGATCACTAA；(SEQ ID No.5)

attB2-PnFNS I/F3H-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGGCCTTTGTTCCTGTTT；(SEQ ID No.6)

以PnFNS I/F3H-pET32a质粒为模板，进行PCR扩增，扩增的体系和条件同上。

(1)、BP反应：

反应体系

a、25℃反应6h，加入0.5μL Proteinase K solution，37℃反应10min终止BP反应。将反应产物转化至E.coli DH5α中，加入400μL无抗生素LB，37℃培养2h，涂至含Gent抗性的LB固体平板中，37℃倒置培养过夜。

b、挑取单克隆进行阳性验证，将阳性单克隆送至公司测序，测序正确后，存菌，冻于-80℃。

c、提取PnFNS I/F3H-pDONR207质粒和pGWB5的质粒，进行LR反应。

(2)、LR反应

反应体系：

a、25℃反应6h，加入0.5μL Proteinase K solution，37℃反应10min终止LR反应。将反应产物转化至E.coli DH5α中，加入400μL无抗生素LB，37℃培养2h，涂至含Kan抗性的LB固体平板中，37℃倒置培养过夜。

b、挑取单克隆进行阳性验证，得到PnFNS I/F3H-pGWB5-DH5α菌株，存菌，冻于-80℃。

c、提取PnFNS I/F3H-pGWB5的质粒，进行农杆菌转化。

4.2冻融法转化农杆菌

(1)取出农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化，加入5μL质粒PnFNS I/F3H-pGWB5，轻轻混匀，冰上放置5min。

(2)液氮速冻5min，然后于37℃水浴5min。

(3)加入400μL无抗生素YEP液体培养基，30℃培养2-3h。

(4)5000rpm，离心1min，取200μL菌液涂于含利福平100μg/mL，含卡那霉素50μg/mL和庆大霉素50μg/mL的YEP固体培养基上。30℃静置培养2-3天。

(5)挑取单克隆进行小摇，菌落PCR鉴定其阳性，得到携带质粒PnFNS I/F3H-pGWB5的农杆菌GV3101。

4.3农杆菌介导法转化拟南芥

采用花序侵染法，将含有PnFNS I/F3H-pGWB5过表达载体的农杆菌转化到拟南芥中，方法如下：

(1)将携带质粒PnFNS I/F3H-pGWB5的农杆菌GV3101的单克隆接种至10mL YEP液体培养液中(含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素和100μg/mL利福平，以下简称三抗)，30℃，200rpm，振荡培养过夜。

(2)取300μL培养液接种至30mL三抗YEP液体培养液中，30℃，200rpm，24h，活化第一次。

(3)取300μL培养液接种至10mL三抗YEP液体培养液中，30℃，200rpm，12-14h，活化第二次。

(4)取第二次活化的300μL培养液接种至30mL三抗YEP液体培养液中，30℃，200rpm，培养10h至OD600约为0.9，室温下5000rpm离心10min收集菌体，并重悬于侵染液中，使OD600在1.5左右。

(5)将tt6和dmr6突变体拟南芥生长出来的果荚剪去，将侵染液点至花苞上，避光处理4h后，再侵染第二次。之后避光处理20-24h。

(6)避光处理完成后，拟南芥正常生长，收取T0代种子。

4.4阳性植株的筛选鉴定

经过花序侵染法得到转基因拟南芥的种子需要经过含抗生素的培养基筛选并验证阳性，具体方法如下：

(1)将转基因T0代种子放入1.5mL EP管中，用75％乙醇灭菌3min，上下颠倒保证充分灭菌，弃去75％乙醇。

(2)加入700μL无水乙醇，上下颠倒3min，取出种子放至无菌滤纸上吹干，均匀铺在1/2MS(含25mg/L潮霉素)固体培养基上。放于4℃，春化3天。

(3)3天后，将种子放在22℃光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)12-14天左右。

(4)观察培养基中种子的萌发和生长状态，挑取具有两片真叶的幼苗移栽在营养土中。

(5)挑选阳性植株和突变体拟南芥(阴性对照)的叶片，使用M5超光速mix试剂盒提取DNA，以含有目的基因的质粒为阳性对照，分别用PnFNS I/F3H-RT-F/R引物进行PCR阳性验证，确定阳性植株，收集T1代种子。

M5超光速mix试剂盒提取DNA方法如下：

将2mm

PCR体系：

扩增程序如图11C。

(6)继续筛选收集的T1代种子，选取阳性苗和阴性苗分离比为3:1的植株按照以上操作移栽，收取T2代种子，继续筛选T2代种子，最后得到纯合植株，用于后续基因功能体内分析使用。

4.5转基因拟南芥基因表达分析

利用CTAB-PVP法提取转基因拟南芥，野生型，tt6和dmr6突变体的RNA，并将RNA逆转录为cDNA，具体操作方法同上。根据拟南芥中的内参序列设计内参引物序列At-actin-F/R，以cDNA为模板，以At-actin-F/R和PnFNS I/F3H-RT-F/R为引物，进行RT-PCR检测。

RT-PCR体系：

扩增程序如图11D。

将RT-PCR结果进行跑胶，验证目的基因的表达，结果如图7。

4.6转基因拟南芥的化学成分分析

PnFNS I/F3H-tt6幼苗培养及分析方法：

(1)拟南芥种子处理及春化：将纯合子转基因拟南芥，野生型和突变体种子用75％乙醇灭菌3min，上下颠倒保证充分灭菌，弃去75％乙醇，用无水乙醇上下颠倒3min，取出种子放至无菌滤纸上吹干，均匀铺在1/2MS培养基中，放于4℃，春化3天。

(2)3天后，将种子放在22℃光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)12-14天左右。

(3)收取幼苗，液氮速冻，冻干研磨成粉末，取20mg粉末，加入600μL50％甲醇(含100μM白杨素)，冰水浴超声1h。

(4)4℃，13,400rpm离心30min，吸取400μL上清,加入等体积2N HCl，70℃酸水解40min，600μL乙酸乙酯萃三遍，合并乙酸乙酯相，吹干进液相。

(5)HPLC-MS分析：采用Hypersil Gold(100mm×2.1mm,1.9μm)色谱柱，流速0.3mL/min。液相分析条件如下：

结果如图8和9。

PnFNS I/F3H-dmr6幼苗培养及分析方法：

(1)称取纯合子转基因拟南芥，野生型拟南芥和突变体拟南芥种子6.0mg左右，放入1.5mL EP管中，加入75％乙醇灭菌3min，上下颠倒保证充分灭菌，弃去75％乙醇，用无水乙醇上下颠倒3min，取出种子放至无菌滤纸上吹干，将种子放于含有200μM柚皮素的1/2MS液体培养基中，4℃，春化3天；

(2)3天后，将种子放在22℃光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)12-14天左右。

(3)收取幼苗，用大量水冲洗材料，洗去培养基和底物，吸干水分后液氮速冻，冻干研磨成粉末，取20mg粉末，加入600μL 50％甲醇(含100μM白杨素)，冰水浴超声1h。

(4)4℃，13,400rpm离心30min，吸取400μL上清,加入等体积2N HCl，70℃酸水解40min，600μL乙酸乙酯萃三遍，合并乙酸乙酯相，吹干进液相。HPLC-MS分析方法同上。结果如图10。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种黄酮合酶I/黄烷酮-3-羟化酶及在黄酮类化合物合成领域的应用

<130> 2022803774

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 346

<212> PRT

<213> Psilotum nudum

<400> 1

Met Ala Ser Leu Ile Thr Lys Ala Asn Gly Val Gly Ser Val Lys Ile

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Gly Ile Glu Gln Ile Pro Ser Ala Tyr Ile Lys Asp

20 25 30

Lys Asp Glu Leu Leu Gln Ile Gly His Ser His Phe Ser Lys Glu Ile

35 40 45

Pro Val Ile Ser Leu Ile Lys Leu His Gly Lys Asp Arg Glu Arg Val

50 55 60

Leu Glu Asp Ile Arg Leu Ala Cys Glu Glu Trp Gly Ile Phe Gln Ile

65 70 75 80

Val Asp His Gly Val Thr Glu Glu Ile Gln Lys Lys Met Met Glu Leu

85 90 95

Val His Gly Phe Phe Met Leu Pro Leu Asp Glu Lys Leu Glu Tyr Ala

100 105 110

Met Pro Ala Asp Asp Phe Cys Gly Tyr Ala Asn Gly Ser Phe Leu Lys

115 120 125

Asp Asn Pro Gly Leu Asp Trp Arg Glu Leu Tyr Val Ala Arg Cys Arg

130 135 140

Pro Leu Thr Arg Arg Asp Val Asn Lys Trp Pro Ala Arg Pro Thr Gly

145 150 155 160

Phe Arg Glu Thr Phe Ala Arg Tyr Ser Asp Glu Met Leu Ser Leu Ala

165 170 175

Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ile Ser Asp Ser Leu Gly Leu Pro Ser Asn

180 185 190

Ala Ile Leu Glu Val Cys Gly Glu Thr Glu Gln Lys Val Leu Leu Asn

195 200 205

Tyr Tyr Pro Thr Cys Pro Gln Ala Glu Gln Thr Leu Gly Leu Lys Arg

210 215 220

His Thr Asp Pro Gly Thr Ile Thr Ile Leu Leu Gln Asp Asn Val Ser

225 230 235 240

Gly Leu Gln Ala Thr Lys Asp Gly Gln Asn Trp Val Thr Val Glu Pro

245 250 255

Thr Pro Gly Ala Phe Val Val Asn Leu Gly Asp His Phe His Val Leu

260 265 270

Thr Asn Gly Arg Leu Lys Asn Ala Asp His Arg Ala Thr Val Asn Ala

275 280 285

Ser Lys Thr Arg Thr Thr Val Ala Ala Phe Trp Asn Pro Ala Ala Asp

290 295 300

Ser Lys Val Cys Pro Leu Pro Ala Leu Val Asp Glu Asp His Pro Pro

305 310 315 320

Leu Phe Glu Ala Glu Thr Phe Ser Glu Phe Tyr Asn Arg Lys Met Arg

325 330 335

Met Ala Ala Ala Lys Thr Gly Thr Lys Ala

340 345

<210> 2

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcttctt tgatcactaa ggcaaatggc gttggcagtg ttaagatcct agctgaagct 60

ggaatagagc aaattccttc agcctatatc aaagacaaag atgaactact tcagatcggt 120

cacagtcatt ttagtaagga aatccctgtc atttctctta taaaactaca cggtaaagat 180

cgagagcgag tactggaaga tatcaggcta gcctgtgagg aatgggggat ttttcagatt 240

gtggatcatg gagtgacaga agagattcag aagaaaatga tggagctcgt acatggattt 300

ttcatgctcc cgctagacga gaaattggag tatgcaatgc ctgctgacga tttctgtggc 360

tatgccaacg gcagcttcct gaaggacaat ccgggccttg attggaggga gctgtatgtc 420

gcacgatgcc gtcctcttac cagaagggat gtaaataagt ggcctgcaag acctacaggc 480

ttcagggaga cgtttgcgag atacagtgac gaaatgttaa gtctggcaaa tttgatcata 540

agcgccatct ccgattccct cggtcttccc tccaacgcaa tactggaggt atgcggagag 600

acggaacaga aagtgctttt gaactactac cccacctgcc cacaagccga acagacgtta 660

ggcctgaaga gacacacaga tcccggaaca ataaccattc tgcttcagga caacgtttct 720

ggacttcagg caacaaaaga cgggcagaac tgggtaacag tggagccaac gcctggcgct 780

tttgtggtga acttgggcga tcatttccac gttcttacta acggcaggct gaagaacgca 840

gaccacagag ctactgtgaa cgcttccaaa acccgcacaa cagtagcagc attctggaac 900

ccagctgcag atagtaaggt ctgtccacta ccagctctgg tagatgaaga tcatccacca 960

ttatttgagg cagagacctt ctcagagttt tacaacagga agatgaggat ggcagcagca 1020

aaaacaggaa caaaggcctg a 1041

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccat ggcttctttg atcactaa 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt caggcctttg ttcctgttt 29

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaccatggct tctttgatca ctaa 54

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcaggccttt gttcctgttt 50