一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组及其鉴别方法与应用

摘要

本发明提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组以及鉴定方法，涉及基因检测技术领域，所述引物组包括引物F和引物R，引物F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，引物R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；鉴别方法包括以下步骤：1)提取待测鱼基因组DNA；2)以提取的待测鱼基因组DNA为模板，以引物F和引物R对所述模板进行PCR扩增获得扩增产物；3)取所述扩增产物进行凝胶电泳检测，若有且仅有一条142bp的扩增片段，则待测鱼为雷氏七鳃鳗，若有且仅有一条250bp的扩增片段，则待测鱼为东北七鳃鳗；对东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗进行基因水平上鉴别，避免了外观形态难以区分、背景来源不明确的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组及其鉴别方法与应用。

背景技术

东北七鳃鳗(Lampetra moriiBerg)及雷氏七鳃鳗(Lethenteron reissneri) 均隶属于七鳃鳗目七鳃鳗科七鳃鳗属，为古老的无颌脊椎动物，有重要的科研价值。现有的东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的鉴定方法主要是依据外观形态区分或利用线粒体测序技术分析DNA的部分序列。前一种基于形态学鉴定的方法简单直观，如检测体长、体高、头长、吻长、眼间距、尾柄长、尾柄高与体长比等可量性状，已有研究认为东北七鳃鳗体型居中，而雷氏七鳃鳗体型较小，但两者间的差异较小，尤其用于不同水体，不同生长时期的种群鉴定时误差较大。此外，早期研究认为雷氏七鳃鳗两背鳍相连而东北七鳃鳗两背鳍分离，这种形态差异也已经被证实是由产卵前后的体态变形引起，以此作为分类依据也误差较大。近些年随着分子生物学的兴起，诞生了后一种线粒体DNA的检测方式，这种方法基于COI序列扩增分析，通过与线粒体组、基因组等测序数据比对，检测结果较为准确，已广泛应用于水产领域的种质资源鉴定及群体遗传多样性分析。但测序分析所需样本材料较多，实验过程较长，成本也较高，且对检验人员的专业知识要求较高。东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗作为中国国家二级重点保护野生动物，如何能在做好种群保护的前提下，准确高效的做到个体或群体鉴定，到目前为止，现有的技术还没有解决这一问题的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组及其鉴别方法，在最大限度做好种群保护的前提下，对东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗在基因水平上进行鉴别，有效的避免了外观形态难以区分、背景来源不明确等难以鉴定区分的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组，所述引物组包括引物F和引物R，引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。

优选的，所述引物组中引物F和引物R的使用浓度为8～12μmol/L。

优选的，所述检测试剂包括10×PCR Buffer、dNTP、Ex Taq酶和ddH

本发明还提供了利用所述的引物组、所述试剂盒进行东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的鉴别方法，包括以下步骤：

1)提取待测鱼基因组DNA；

2)以提取的待测鱼基因组DNA为模板，以引物F和引物R对所述模板进行PCR扩增获得扩增产物；

3)取所述扩增产物进行凝胶电泳检测，若有且仅有一条142bp的扩增片段，则待测鱼为雷氏七鳃鳗，若有且仅有一条250bp的扩增片段，则待测鱼为东北七鳃鳗。

优选的，所述步骤1)中待测鱼基因提取于鳍条组织。

优选的，所述步骤2)PCR扩增的反应体系以10μL计，包括以下组分：

30ng/μL基因组DNA 1.0μL

10μmol/L上游引物F 0.4μL

10μmol/L下游引物R 0.4μL

10×PCRBuffer 1.5μL

2mmol/L dNTP 1μL

5U/μL Ex Taq酶0.2μL

ddH

所述步骤2)PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

本发明的技术效果和优点：

本发明提供了用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组及其鉴别方法，利用一对分子标记引物，该引物来源于线粒体组trnE及Cytb之间的 D-loop控制区，对东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗在基因水平上进行鉴别；利用这一对引物对待检验样本进行PCR扩增检测，若只得到长度为250bp的扩增片段，则待检验样品来源于东北七鳃鳗，若只得到长度为142bp的扩增片段，则待检验样品来源于雷氏七鳃鳗。本发明与现有的利用线粒体D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析技术的主要区别为：(1)针对性强，所开发的引物只适用于东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗线物种的区别鉴定；(2)具有操作简单、成本低、鉴定周期短等优势，只需通过简单的DNA提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳操作即可直接根据扩增产物的大小进行分辨鉴定，不需要进行测序；(3)样品来源于鳍条组织，不必采用肌肉组织，采样方法不伤害活体样本的继续生长及繁殖，且在野外采样操作简单，样品容易保存，对于珍稀濒危物种，可以最大限度的起到物种保护的作用。

附图说明

图1为实施例1所述方法凝胶电泳检测结果；

图2为实验例1凝胶电泳检测结果；

图3为实验例2凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组，所述引物组包括引物F和引物R，引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物 R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的试剂盒，包括所述的由引物F和引物R组成的引物组和检测试剂。

在本发明中，所述引物组中引物F和引物R的使用浓度分别优选为 8～12μmol/L，进一步优选为9～11μmol/L，再进一步优选为10μmol/L。

在本发明中，所述试剂盒的检测试剂优选的包括10×PCR Buffer、dNTP、Ex Taq酶和ddH

本发明还提供了一种采用所述的引物组、所述试剂盒进行东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的鉴别方法，包括以下步骤：

1)提取待测鱼基因组DNA；

2)以提取的待测鱼基因组DNA为模板，以引物F和引物R对所述模板进行PCR扩增获得扩增产物；

3)取所述扩增产物进行凝胶电泳检测，若有且仅有一条142bp的扩增片段，则待测鱼为雷氏七鳃鳗，若有且仅有一条250bp的扩增片段，则待测鱼为东北七鳃鳗。

在本发明中，所述鉴别方法中待测鱼基因优选的提取于鳍条组织。

在本发明中，所述提取待测鱼基因组DNA，具体的采用酚氯仿法提取。

在本发明中，提取待测鱼基因组DNA后，进行PCR扩增，优选的所述 PCR扩增的反应体系以10μL计，包括以下组分：

30ng/μL基因组DNA 1.0μL

10μmol/L上游引物F 0.4μL

10μmol/L下游引物R 0.4μL

10×PCR Buffer 1.5μL

2mmol/L dNTP 1μL

5U/μL Ex Taq酶0.2μL

ddH

所述PCR扩增的扩增程序优选为：94℃预变性2min；94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

在本发明中，PCR扩增后，取所述扩增产物进行凝胶电泳检测，所述凝胶电泳检测优选的包括以下步骤：

取4μL产物与2μL的溴酚蓝混合，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳电压优选为140V，时间优选为20min；电泳结束后将凝胶置于多功能凝胶成像仪的紫外光下检测PCR扩增产物目的片段的长度。

在本发明所述凝胶电泳检测过程中，优选的采用0.5×TBE缓冲液和1％琼脂糖凝胶：

所述0.5×TBE缓冲液制备方法优选为：5.4g的Tris和2.7g的硼酸加入 800ml双蒸水中溶解，再加入2ml 0.5M的EDTA(pH＝8.0)混匀，定容至 1000ml；

所述1％琼脂糖凝胶的制备方法优选为：琼脂糖0.5g加入0.5×TBE缓冲液50mL，加热2min溶解，室温放置3min，溶液温度冷却至50℃～60℃，加入核酸染料2μL，充分混合，倒入制胶模中，缓缓插上梳子并静止冷却使其凝固。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

剪取待检群体的鳍条组织50mg，单个样品分别放入2mL离心管中，加入600μLDNA提取裂解液(1M Tris pH8.0、5M NaCl、0.5M EDTA pH8.0、 10％SDS和200μg/mL Protein K)混匀，于55℃消化10小时，加入等体积 600μL的酚氯仿混合液(1:1)抽提1次，高速离心机12000rpm离心10min，吸取上清550μL加入1ml无水乙醇沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，加入1ml 70％酒精洗涤1次，5000rpm离心3min，弃去上清液留沉淀，室温干燥10min，加入100μL的0.1×TE溶液使沉淀充分溶解，利用仪器 Nanodrop 8000(Thermo FisherScientific,MA,USA)测定DNA浓度后稀释至 30ng/μL，保存于4℃备用。

以提取的基因组DNA为模板，利用Ex Taq(TaKaRa公司)进行PCR 扩增，引物(F，R)的扩增体系如下：

基因组DNA(30ng/μL)1.0μL

上游引物F(10μmol/L)0.4μL

下游引物R(10μmol/L)0.4μL

10×PCR Buffer 1.5μL

dNTP(2mmol/L)1μL

Ex Taq酶(5U/μL)0.2μL

ddH

Total 10μL；

PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，反应结束后72℃延伸5min，4℃保存；

序列信息如下：

F:AATCACAAATTTTTAATTGT(SEQ ID No.1)

R:AATAGATAACATTTTAAAAT(SEQ ID No.2)。

PCR扩增反应结束后，取4μL产物与2μL的溴酚蓝均匀混合后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳条件采用140V电压，20min；电泳结束后将凝胶置于多功能凝胶成像仪的紫外光下检测PCR扩增产物目的片段的长度。

电泳过程中所用到的0.5×TBE缓冲液及用1％琼脂糖凝胶配制方法如下：(1)0.5×TBE缓冲液：5.4g的Tris粉，2.7g的硼酸，加入800ml双蒸水中充分溶解，再加入2ml0.5M的EDTA(pH＝8.0)混匀后，定容1000ml，此时得到的即为0.5×TBE缓冲液；(2)1％琼脂糖的制备：称取琼脂糖0.5g 于三角瓶中；加入0.5×TBE缓冲液，50mL；采用微波炉中火加热2min使其充分溶解，室温放置3min，溶液温度冷却至50℃-60℃，加入核酸染料2μL，摇匀使其充分混合，倒入制胶模中，缓缓插上梳子并静止冷却使其凝固。

如图1所示：泳道M为DL2000 DNAmarker；泳道1-4待检测样品的电泳结果为142bp的扩增片段，样品来源为雷氏七鳃鳗；泳道5-9检测样品的电泳结果为250bp的扩增片段，样品来源为东北七鳃鳗。

实验例1

为了进一步证明本技术所设计引物的特异性及准确性，特设计两组对比实验。

(一)选取六种常见鱼类麦穗鱼、鲫、翘嘴鲌、鲤、鲢、草鱼的鳍条样本，提取DNA作为实验模板，以本实验所设计一对引物F及R进行扩增；序列信息为：

F:AATCACAAATTTTTAATTGT(SEQ ID No.1)

R:AATAGATAACATTTTAAAAT(SEQ ID No.2)

具体实验操作如下：

(1)基因组DNA提取：剪取六种常见鱼类麦穗鱼、鲫、翘嘴鲌、鲤、鲢、草鱼的鳍条样本，DNA提取方法与实施例1中所述提取待测鱼基因组 DNA方法一致。

(2)PCR扩增：以提取的六种常见鱼类麦穗鱼、鲫、翘嘴鲌、鲤、鲢、草鱼基因组DNA为模板，利用Ex Taq(TaKaRa公司)进行PCR扩增，扩增体系及PCR反应条件也与实施例1中所述PCR扩增相一致。

(3)凝胶电泳检测：PCR扩增反应结束后，取4μL产物与2μL的溴酚蓝均匀混合后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳条件采用140V 电压，20min；电泳结束后将凝胶置于多功能凝胶成像仪的紫外光下检测PCR 扩增产物目的片段的长度。

(4)结果分析：如图2所示：泳道M为DL2000 DNAmarker；泳道1-6 分别为麦穗鱼、鲫、翘嘴鲌、鲤、鲢、草鱼的DNA样本的扩增产物。

由扩增结果可见，本技术所设计引物对F与R在相同的实验条件下，麦穗鱼、鲫、翘嘴鲌、鲤、鲢、草鱼等样本的扩增结果为非特异性条带，不能用于样本分类鉴定。

其中，所述雷氏七鳃鳗样品扩增长度为142bp，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；东北七鳃鳗扩增长度为250bp，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实验例2

基于前期东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗线粒体组序列D-Loop区的差异序列区设计一对对比引物对C-F及C-R，引物序列为：

C-F:CGCTTCTAATAATCTTCCTCA(SEQ ID No.5)

C-R:CAGTTGTATGCCAAGAGTGAT(SEQ ID No.6)

根据东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗线粒体组序列信息，引物对C-F及C-R的东北七鳃鳗的理论扩增长度为265bp，而雷氏七鳃鳗的理论扩增长度为 226bp。以东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的DNA为模板，利用引物对C-F及C-R 进行扩增。基因组DNA提取、PCR扩增体系及反应条件、凝胶电泳检测等实验操作均与本技术所述方法相一致。结果分析如图3所示：泳道M为DL2000 DNAmarker；泳道1-3为雷氏七鳃鳗的扩增片段，泳道4-6为东北七鳃鳗的扩增片段。由扩增结果可见，对比引物对C-F及C-R在相同的实验条件下，东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的扩增结果相似，仍然不能直接用于样本分类鉴定。

由以上实施例可知，本发明提供了针对于东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗鉴别的引物组，只需通过简单的DNA提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳操作即可直接根据扩增产物的大小进行分辨鉴定，不需要进行测序，本发明所著的鉴别方法不伤害活体样本的继续生长及繁殖，且在野外采样操作简单且样品容易保存。对于珍稀濒危物种，可以最大限度的起到物种保护的作用。本发明操作简单、成本低且鉴定周期短。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120> 一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组及其鉴别方法与应用

<160> 6

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<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatcacaaat ttttaattgt 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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