基于共进化分析的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用

摘要

本发明涉及一类酶活显著提高的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用。本发明所述突变体包含氨基酸序列的第51位和/或第93位氨基酸突变，所述内切纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。本发明采用迭代饱和突变技术，基于进化耦合分析，通过选择具有高耦合强度的氨基酸残基对作为关键突变位点优化持续性内切葡聚糖酶的分子结构、提高酶活。与野生型酶相比，本发明所述持续性内切葡聚糖酶突变体的外切酶和内切酶活性显著增强，对纤维素底物的高效降解和降低生成成本具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一类酶活提高的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

纤维素是地球上分布最广、储量最丰富的可再生资源，其高效的生物转化对实现我国“碳中和”的远景目标、解决能源危机和促进社会可持续发展具有重要的意义，然而水解过程中需要的酶种类多、用量大，导致的酶成本过高等问题仍然是限制纤维素转化技术商业化的一个重要瓶颈。

持续性内切葡聚糖酶(Processive endoglucanase)作为一类双功能纤维素水解酶，可高效降解纤维素生成小分子寡糖，然而目前持续性内切葡聚糖中外切酶活性较弱、持续性差等问题，严重影响了该酶在纤维素低成本高效生物转化领域的应用。此外，持续性内切葡聚糖酶的蛋白质工程改造目前主要集中在催化通道周围的芳香族氨基酸和一些来自特定区域(酶活性架构区域)内的特殊氨基酸，研究范围狭窄，导致一些潜在的关键氨基酸残基被遗漏。

在蛋白质进化过程中，有相互作用残基对之间存在一种“共进化”模式，即当一个残基发生变异时，与其有相互作用的残基也要发生相应的变异，以维持整体空间结构及生物学功能。共进化位点残基之间的协同作用与基于变构相互作用、上位相互作用、补偿性相互作用和协同效应的蛋白质结构和功能密切相关。近年来，通过结构生物信息学和计算生物学预测接触残基对，发现残基的共同进化被发现是可行的，并且随着蛋白质序列数据库规模的加速增长，越来越多的计算机辅助软件被开发用于共进化位点的预测。如EVfold、GREMLIN ConKit和RaptorX-Contact等，已被提出用于检测共进化的残基并有效改善酶的催化性能。Wang(FEBS Letters，2020，594：799-812)等为了探索提高Bacillusnaganoensis来源的普鲁兰酶的催化活性，采用EVfold和GREMLIN辅助软件，筛选得到七组可能存在共进化关系的氨基酸残基对(D614/H539、E530/T520、D541/D473、E777/T730、K631/Q597、V328/I565、Y392/Y571)，采用饱和突变和组合突变等技术获得了多个催化活性显著提高的突变体。其中突变体K631V/Q597K/D541I/D473的催化效率相比于原始酶提高了6.3倍，提升效果显著。同样，Huang(Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104：8299-8308)等为了增强Penicillium oxalicum 16来源的β-葡聚糖酶的多种酶特性进而提高纤维素乙醇的产量，基于共进化理论，鉴定了一个三重突变体G414G/D421V/T441S，其最适温度更接近发酵温度，催化效率同样得到提高，最终纤维素乙醇的产量相比于原始酶提高了22％。

尽管国内外研究者通过蛋白质工程改造技术提高纤维素酶催化活性的研究已经取得了非常显著的进展。然而目前对持续性内切葡聚糖酶持续性机制仍缺乏整体系统的理论认识，难以满足持续性内切葡聚糖酶定向设计与改造的需求，因此基于大规模序列比对的共进化分析方法不仅为蛋白质工程技术改造持续性内切葡聚糖酶以提高其催化活性提供了理论指导，同时有助于阐释该类酶的特殊催化机制。

发明内容

本发明采用迭代饱和突变技术，基于EVfold和GREMLIN生物信息工具对持续性内切葡聚糖酶同源序列进行比对分析，计算氨基酸残基间的相关程度，将生成的蛋白质共进化网络映射到相似度较高的参比序列上，选择存在共进化关系的关键氨基酸残基对优化纤维素酶的分子结构、提高酶活，获得一类酶活显著提高的持续性内切葡聚糖酶突变体。本发明所述的持续性内切葡聚糖酶的突变体具有较高的催化活性，为纤维素原料的工业话生物转化提供新的可行性。

为实现上述目的，本发明基于持续性内切葡聚糖酶EG5C-1进行了优化改造。具体技术方案如下：

一类内切葡聚糖酶突变体，包含如SEQ ID NO：1所示的内切葡聚糖酶氨基酸序列的第51位和第93位氨基酸突变。所述内切葡聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，本发明所述的突变体氨基酸序列第51位的赖氨酸突变为丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，优选苏氨酸；和第93位亮氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，优选苏氨酸。

更优选的，所述突变体第51位的赖氨酸突变为苏氨酸和第93位亮氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：3(K51T)或SEQ ID NO：4(K51T/L93T)所示。

本发明另一目的在于提供编码本发明所述的内切葡聚糖酶突变体基因以及包含所述内切葡聚糖酶突变体基因的重组载体及所述重组载体的转化体。

进一步的，本发明还提供了所述的重组载体的制备方法，通过人工合成或基因克隆的方法制备本发明所述内切纤维素酶突变体基因，构建表达载体得到重组质粒，转化至入宿主细胞。

优选的，所述宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母细胞或枯草芽孢杆菌，优选为大肠杆菌BL21。

本发明所述的内切纤维素酶突变体可以用于催化纤维素生物降解。

本发明的有益效果在于：本发明采用迭代饱和突变技术，基于共进化理论和分子动力学模拟等技术，通过选择特定的氨基酸残基对进行持续性内切葡聚糖酶的分子改造，探索远端残基替代对酶活性的影响，不仅阐释了该类酶的特殊催化机制，同时为更好的改造持续性内切葡聚糖酶提供了更有价值的信息。

附图说明

图1.持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其迭代饱和突变体的SDS-PAGE电泳分析。其中M为蛋白marker，泳道1为原始酶EG5C-1发酵液破碎上清，泳道2-9分别为突变体A89G/K47F、K51T/L93T、L126Q/K84I、V260S/V61I、K47V/A89G、K84I/L126I、L93Q/K51V、V61I/V260F的发酵液破碎上清，箭头所指处为目的蛋白33.4kDa处。

图2.共进化氨基酸残基对突变体对CMC和Avicel底物的相对水解活性。

图3.第一轮迭代饱和突变与第二轮迭代饱和突变突变体对CMC和Avicel底物的酶活对比。

图4.持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其突变体K51T/L93T的最适温度(图4A)和温度稳定分析(图4B)。

图5.持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其突变体K51T/L93T的最适pH(图5A)和pH稳定分析(图5B)。

图6.持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及最佳突变体K51T/L93T以再生无定形材料PASC为底物反应30min、60min、120min、180min后反应液中可溶性还原端与不溶性还原端的比列。

图7.持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其最佳突变体K51T/L93T以Avicel为底物的Langmuir曲线及结合常数。

具体实施方式

为了更好地说明本发明地目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例做进一步地详细说明。

实施例一EVcoupling软件分析及共进化氨基酸残基对的筛选

通过NCBI数据库，将已知的GH5家族的持续性内切葡聚糖酶序列进行蛋白质序列比对，寻找并获得其同源蛋白家族(Pfam:PF00150)。使用EVfold生物信息工具对持续性内切葡聚糖酶同源序列进行比对分析，计算氨基酸残基间的相关程度，将生成的蛋白质共进化网络映射到相似度较高的参比序列上，使用PLM作为唯一的评分标准，确定并选择可能存在共进化关系的关键氨基酸残基对。本实施例基于PLM算法，选择分数大于0.8的氨基酸残基对进行进一步实验，分别是K51/L93，K84/L126，K47/A89，V61/V260。

实施例二持续性内切葡聚糖酶突变体的构建及最优突变体的筛选程序

对实施例一确定的关键氨基酸残基对进行迭代饱和突变，采用BinWu(Biotechnology for Biofuels，2018，11:20)公开的方法，构建含有SEQ ID NO：2的重组质粒，以SEQ ID NO：2所示的序列为模板，参照Vazyme生物产品及操作手册，利用如下设计的相应突变引物，全质粒扩增出定点突变序列，所用引物如下：

nnn对应不同氨基酸的密码子如下：TGT(Cys)、GAT(Asp)、GAA(Glu)、TTT(Phe)、GGC(Gly)、CAT(His)、ATT(Ile)、AAA(Lys)、CTG(Leu)、ATG(Met)、AAT(Asn)、CCG(Pro)、CAG(Gln)、CGT(Arg)、TCA(Ser)、ACA(Thr)、GTT(Val)、TGG(Trp)、TAT(Tyr)。

设计突变体：第一轮突变(K51X、L93X、K84X、L126X、K47X、A89X、V61X、V260X)，X代表20个不同的氨基酸。

第二轮突变(K51T/L93X、L93Q/K51X、K84I/L126X、L126Q/K84X、K47V/A89X、A89G/K47X、V61I/V260X、V260S/V61X)，X代表20个不同的氨基酸。

PCR反应体系如下：

PCR程序设定如下：

95℃，3min；

95℃，15s；60℃，15s；72℃，8min；30个循环；

72℃，10min；

4℃，Hold。

全质粒扩增完成后，取2μL PCR产物进行核酸电泳验证。验证结束后，使用DpnI消化酶，降解初始模板。

消化体系如下：

PCR产物 1μL

DpnI酶 1μL

10×QuickCut Buffer 2μL

消化程序如下：

37℃，30min。

消化结束后，将PCR产物采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21(DE3)，并涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素LB琼脂平板上，37℃培养14-16h。经序列测定(由安徽通用生物公司完成)验证突变结果，获得相应突变体。

分别将上述构建的突变体以及原始酶EG5C-1接种至50mL的LB液体培养基中，加入硫酸卡那霉素，使其终浓度为100μg/mL，180rpm/min，37℃过夜培养；以2％的接种量将过夜培养的种子液，接种至新鲜的50mL的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃恒温培养至OD

取诱导表达的发酵液，12000rpm/min离心20min，弃去上清，然后用50mM Na

结果如图1所示，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1的分子量为33.4kDa，结果显示诱导后突变体在33.4kDa处都有明显的条带，表明持续性内切葡聚糖酶突变体成功诱导表达。

以羧甲基纤维素钠CMC和微晶纤维素Avicel为底物测定突变体酶活变化，每一组共进化残基对的迭代饱和突变对CMC(A)和Avicel(B)底物的相对水解活性结果如图2所示，第一轮突变中，突变体(K51T、L93Q)、(K47V、A89G)、(K84I、L126Q)、(V61I、V260S)的酶活相对于原始酶EG5C-1有所提高(图2A)，随后以这些突变体为模板进行第二轮的迭代饱和突变，结果显示(图2B)，仅仅有四组突变体的酶活相对于原始酶提高显著(K51T/L93T、K84I/L126I、K47V/A89V、A89G/K47F)，且第一轮酶活提高的位点经过迭代饱和突变后并没有显示出较好的催化活性(图3)，K51T/L93Q、K47V/A89G、K84I/L126I、V61I/V260S突变体对两种底物的活性均低于单点突变(K51T、L93Q)、(K47V、A89G)、(K84I、L126Q)、(V61I、V260S)，由此可见，共进化位点之间存在着相互协同关系，只有在特定的氨基酸情况下才能显示出最好的催化活性。基于此，以选择活性提高最显著的K51T/L93T突变体为例进一步进行研究。

实施例三持续性内切葡聚糖酶突变体的酶学性质分析

持续性内切葡聚糖酶突变体水解活力测定方法

酶活力单位定义：一个酶活力单位即为在60℃，pH 6.0条件下，每分钟由底物产1mmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。

(1)内切纤维素酶(Endo-glucanase)：准确称取1g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于100mL的Na

(2)外切纤维素酶(Exo-glucanase)：准确称取10g微晶纤维素(Avicel)溶于100mL的Na

(3)滤纸酶活(FPase)：准确称取0.5g烘干滤纸(FP)，加入1.5mL Na

比酶活X＝(还原糖含量/180/10(30))/n

其中：X---比酶活，U/mg

180----------还原糖从毫克转换为微摩尔

10(30)--反应时间

n-------------反应蛋白含量，mg

1.最适反应温度和温度稳定性。

将实施例二得到的突变体酶液按照一定浓度稀释并吸取500μl加入装有1.5mLCMC底物的试管中，并分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下反应10min，反应结束后加入3mL DNS溶液煮沸5min，测定其酶活。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制酶活随着温度变化的曲线。

为了测定突变体和原始酶的温度稳定性，将稀释的酶液分别放入30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中孵育2h，然后按照测定内切纤维素酶活力的方式测定其剩余的酶活力。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。

结果如图4所示，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1与突变体K51T/L93T的最适反应温度均为60℃，当温度在30℃-60℃时，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及突变体的酶活逐渐升高，当温度高于60℃时，EG5C-1及其突变体的酶活均显著下降。持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其突变体K51T/L93T在低于50℃条件下保温2h，仍然保留了80％以上的酶活力，而在高于60℃条件下保温2h后，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1的酶活力保留了约70％，而其突变体却仍然保留了80％以上的活力，表明突变体酶的温度稳定性相比于原始酶有所提高。

2.最适pH和pH稳定性

配制不同pH的缓冲和底物：柠檬酸-柠檬酸钠(pH 3.0-6.0)、Na

将稀释的酶液用不同pH的缓冲进行稀释，置于冰上4℃孵育2h，然后按照测定内切纤维素酶活力的方式测定其酶活力。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。

结果如图5所示，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1与突变体K51T/L93T的最适反应pH均为pH 6.0，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其突变体在pH6.0条件下，具有最高水解活性，随着pH的升高或降低，其酶活性均减少。持续性内切葡聚糖酶EG5C-1与突变体K51T/L93T在pH5.0-9.0之间的稳定性较为平稳，在各个条件下孵育2h后均能保留70％以上的酶活力，而在pH3.0-5.0之间，持续性内切葡聚糖酶及其突变体的稳定性均下降，在各个pH条件下，EG5C-1保留的酶活力相比于突变体K51T/L93T都较低，表明突变体的pH稳定性得到了提高。

实施例四持续性内切葡聚糖酶最佳突变体K51T/L93T的持续性能力分析

持续性内切葡聚糖酶的持续性是通过检测降解再生无定形纤维素(PASC)所产生的可溶性还原端与不可溶性还原端的比例确定的。测定步骤如下：

(1)将实施例二得到的酶液按照一定的浓度稀释并吸取500ul加入装有1.5mL 1％的PASC底物(w/v)的试管中混匀；

(2)试管于60℃下反应30min、60min、120min、180min后取出，立即用沸水煮沸5min，终止反应；

(3)将反应物离心，12000rpm，10min；

(4)将沉淀用Na

(5)根据DNS法分别测定上清液与沉淀中还原糖的含量并计算不同反应时间段的还原端比例。

结果如图6显示，反应时间由0.5h延长至3h时，原始酶EG5C-1所产生的可溶性与不溶性还原糖的比例由2.18增加至3.19，与此同时，最佳突变体K51T/L93T酶解PASC产生的可溶性还原糖和不溶性还原糖的比值随着时间的延长而不断增加，从0.5h比值为2.26，3h后增加至3.56。结果说明，最佳突变体K51T/L93T在内切酶和外切酶活性提高的同时其持续性能力也得到了加强。

实施例五持续性内切葡聚糖酶最佳突变体K51T/L93T的结合能力分析

为了定量确定突变体对底物Avicel的结合能力的影响，采用Langmuir等式，在4℃条件下测定突变体对Avicel的结合能力变化。

(1)将不同稀释梯度的酶液(0-30uM)与10mg已经用磷酸缓冲(Na

(2)将离心管放置在冰浴摇床上，200rpm/min反应2h；

(3)将混合物12000rpm/min离心10min，取离心上清液，使用BCA法测定上清液的蛋白质浓度(q

结果如图7所示，突变体K51T/L93T对于Avicel的解离常数(K

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 基于共进化分析的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis BS-5

<400> 1

Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys

1 5 10 15

Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly

20 25 30

Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp

35 40 45

Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala

50 55 60

Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys

65 70 75 80

Asn Lys Val Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr

85 90 95

Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn

100 105 110

Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly

115 120 125

Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp

130 135 140

Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser

145 150 155 160

Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly

165 170 175

Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp

180 185 190

Ala Asn Val Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln

195 200 205

Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile

210 215 220

Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Gln Gly Gly Val

225 230 235 240

Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser

260 265 270

Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly

290 295 300

<210> 2

<211> 906

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis BS-5

<400> 2

gcagggacaa aaacgccagt agccaagaat ggccagctta gcataaaagg tacacagctc 60

gttaaccgag acggtaaagc ggtacagctg aaggggatca gttcacacgg attgcaatgg 120

tatggagaat atgtcaataa agacagctta aaatggctga gagatgattg gggtatcacc 180

gttttccgtg cagcgatgta tacggcagat ggcggttata ttgacaaccc gtccgtgaaa 240

aataaagtaa aagaagcggt tgaagcggca aaagagcttg ggatatatgt catcattgac 300

tggcatatct taaatgacgg taatccaaac caaaataaag agaaggcaaa agaattcttc 360

aaggaaatgt caagccttta cggaaacacg ccaaacgtca tttatgaaat tgcaaacgaa 420

ccaaacggtg atgtgaactg gaagcgtgat attaaaccat atgcggaaga agtgatttca 480

gttatccgca aaaatgatcc agacaacatc atcattgtcg gaaccggtac atggagccag 540

gatgtgaatg atgctgccga tgaccagcta aaagatgcaa acgttatgta cgcacttcat 600

ttttatgccg gcacacacgg ccaattttta cgggataaag caaactatgc actcagcaaa 660

ggagcaccta tttttgtgac agagtgggga acaagcgacg cgtctggcca gggcggtgta 720

ttccttgatc aatcgaggga atggctgaaa tatctcgaca gcaagaccat cagctgggtg 780

aactggaatc tttctgataa gcaggaatca tcctcagctt taaagccggg ggcatctaaa 840

acaggcggct ggcggttgtc agatttatct gcttcaggaa cattcgttag agaaaacatt 900

ctcggc 906

<210> 3

<211> 302

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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1 5 10 15

Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly

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Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp

35 40 45

Ser Leu Thr Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala

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Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp

130 135 140

Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser

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Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly

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Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp

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<210> 4

<211> 302

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys

1 5 10 15

Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly

20 25 30

Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp

35 40 45

Ser Leu Thr Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Asn Lys Val Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn

100 105 110

Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly

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Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp

130 135 140

Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser

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Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly

165 170 175

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Ala Asn Val Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln

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<210> 5

<211> 51

<212> DNA

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<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aatgatgaca tatatcccnn nctcttttgc cgcttcaacc gc 42

<210> 8

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gcggttgaag cggcaaaaga gnnngggata tatgtcatca tt 42

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gcttcaaccg cttcnnntac tttatttttc acggacgggt tgt 43

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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acaacccgtc cgtgaaaaat aaagtannng aagcggttga agc 43

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gacgtttggc gtgtttccgt annngcttga catttccttg aagaa 45

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<213> Artificial Sequence

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ttcttcaagg aaatgtcaag cnnntacgga aacacgccaa acgtc 45

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<213> Artificial Sequence

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ccattttaag ctgtcnnnat tgacatattc tccataccat tgcaatccg 49

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cggattgcaa tggtatggag aatatgtcaa tnnngacagc ttaaaatgg 49

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<212> DNA

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gacatatatc ccaagctctt ttgcannntc aaccgcttct tttactttat ttttca 56

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tatacatcgc tgcacggaan nnggtgatac cccaatcatc 40

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gatgattggg gtatcaccnn nttccgtgca gcgatgtata 40

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cagcaagacc atcagctggn nnaactggaa tctttctgat aa 42

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gcttatcaga aagattccag ttnnnccagc tgatggtctt gctgtcg 47