调控玉米花粉育性和花粉耐热性的方法

摘要

本发明公开了调控玉米花粉育性和花粉耐热性的方法。本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质Ms42和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白质ms42。实验证明，蛋白质ms42可以提高花粉耐热性和维持玉米雄性可育，蛋白质Ms42可以促进玉米雄性不育。本发明具有重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及调控玉米花粉育性和花粉耐热性的方法。

背景技术

玉米(Zeamays L.)属禾本科玉蜀黍属，是我国第一大粮食作物，随着中国经济的发展，玉米播种面积和产量连年增长，在我国农业生产和国民经济中占有十分重要的地位。玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄，而雄性不育系是作物杂种优势利用和经济杂交种生产的宝贵选育材料，利用雄性不育系可以有效降低母本去雄的成本。随着现代育种技术的进步，基于显性雄性不育系的制种系统已在玉米中得到开发和应用。因此，优良显性雄性不育系的选择对于玉米高效的杂交制种发展具有重要价值。

全球气候变化，温度的升高会对植物生殖细胞的发育以及繁殖成功率产生极大损害。而减数分裂是有性生殖的基础，对植物的基因组多样性和倍性稳定具有重要意义。虽然过去几十年，通过生物学的方法鉴定发现了一些影响植物减数分裂的关键基因，但是对其发育的调控网络还不清楚，尤其是环境温度对于植物减数分裂过程的影响，因此探索高温胁迫下植物雄性生殖细胞发育的调控机制和遗传基础对于农业经济安全以及培育耐高温品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是调控玉米花粉育性和花粉耐热性。

本发明首先保护蛋白质Ms42，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与玉米雄性不育相关的蛋白质；

a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与雄性育性不育相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:1由912个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述蛋白质Ms42的核酸分子。

所述编码所述蛋白质Ms42的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码所述蛋白质Ms42的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质Ms42的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:2由2739个核苷酸组成，SEQ ID NO:2的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质Ms42的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质Ms42的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质Ms42，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质Ms42的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：2所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。

本发明还保护上述任一所述蛋白质Ms42、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为c1)或c2)：

c1)促进玉米雄性不育；

c2)培育雄性不育的玉米品种。

本发明还保护一种培育雄性不育玉米的方法，可包括如下步骤：提高雄性可育玉米中上述任一所述蛋白质Ms42的活性和/或表达量，获得转基因玉米甲；所述转基因玉米甲即为雄性不育玉米。

本发明还保护一种培育雄性可育玉米的方法，可包括如下步骤：抑制雄性不育玉米中上述任一所述蛋白质Ms42的活性和/或表达量，获得转基因玉米乙；所述转基因玉米乙即为雄性可育玉米；

所述雄性不育玉米的不育性状是由于表达上述任一所述蛋白质Ms42引起的。

上述方法中，所述“抑制雄性不育玉米中上述任一所述蛋白质Ms42的活性和/或表达量”具体可通过向雄性不育玉米中导入重组质粒实现；所述重组质粒的制备方法如下：将5’-GGCGTCCGCGCAGAAAAAACGCG-3’和5’-AAACCGCGTTTTTTCTGCGCGGA-3’进行退火反应，形成退火靶点片段，之后将pBUE411-BG载体和退火靶点片段连接，得到重组质粒。

上述方法中，所述雄性不育玉米可为玉米突变体Ms42。

所述转基因玉米乙可为实施例提及的Ms42-In1、Ms42-In2或Ms42-De2。Ms42-In1和Ms42-In2在Ms42基因和ms42基因的编码区分别发生了“A”1个核苷酸的插入和“TT”2个核苷酸的插入，从而引起了移码。Ms42-De2在Ms42基因和ms42基因的编码区发生了“TT”2个核苷酸的缺失，从而引起了移码。

实验证明，在玉米突变体Ms42中通过导入上述重组质粒抑制蛋白质Ms42的活性和/或表达量可以将玉米突变体Ms42的雄性不育恢复为雄性可育。Cas9培育雄性可育玉米突变株实验结果证实Ms42基因两个位点突变导致了玉米的显性雄性不育表型。因此，蛋白质Ms42及其编码基因可以促进玉米雄性不育，具有重要的应用价值。

本发明还保护蛋白质ms42，可为如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID NO:3所示的蛋白质；

A2)在SEQ ID NO:3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

A3)将A1)或A2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与玉米花粉耐热性相关的蛋白质；

A4)与SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与玉米花粉耐热性相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:3由912个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

上述A3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述蛋白质ms42的核酸分子。

所述编码所述蛋白质ms42的核酸分子可为B1)或B2)或B3)或B4)所示的DNA分子：

B1)编码区是SEQ ID NO:4所示的DNA分子；

B2)核苷酸序列是SEQ ID NO:4所示的DNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码所述蛋白质ms42的DNA分子；

B4)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质ms42的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:4由2739个核苷酸组成，SEQ ID NO:4的核苷酸编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ms42的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ms42的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ms42，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质ms42的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护含有编码所述蛋白质ms42的核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

所述含有编码所述蛋白质ms42的核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：4所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pBCXUN-ms42。重组质粒pBCXUN-ms42为将植物表达载体pBCXUN-UbiP的限制性内切酶AscI和KpnI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:4所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述含有编码所述蛋白质ms42的核酸分子的重组微生物可为将含有编码所述蛋白质ms42的核酸分子的重组载体(如重组质粒pBCXUN-ms42)导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。

本发明还保护上述任一所述蛋白质ms42、编码所述蛋白质ms42的核酸分子或含有编码所述蛋白质ms42的核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，的应用，可为C1)-C3)中的至少一种：

C1)提高玉米花粉耐热性；

C2)维持玉米雄性可育；

C3)培育花粉耐热的玉米品种。

本发明还保护一种降低玉米花粉耐热性方法，包括如下步骤：抑制出发玉米中所述蛋白质ms42的活性和/或表达量，获得转基因玉米丙；与出发玉米相比，转基因玉米丙的花粉耐热性降低。

本发明还保护一种降低玉米花粉耐热性方法，包括如下步骤：抑制出发玉米中所述蛋白质ms42的活性和/或表达量和所述蛋白质Ms42的活性和/或表达量，获得转基因玉米丁；与出发玉米相比，转基因玉米丁的花粉耐热性降低。

上述方法中，所述出发玉米可为玉米突变体Ms42。

所述转基因玉米丙或转基因玉米丁可为实施例提及的Ms42-In1、Ms42-In2或Ms42-De2。Ms42-In1和Ms42-In2在Ms42基因和ms42基因的编码区分别发生了“A”1个核苷酸的插入和“TT”2个核苷酸的插入，从而引起了移码。Ms42-De2在Ms42基因和ms42基因的编码区发生了“TT”2个核苷酸的缺失，从而引起了移码。

本发明还保护一种提高玉米花粉耐热性方法，可包括如下步骤：提高出发玉米中所述蛋白质ms42的活性和/或表达量，获得转基因玉米戊；与出发玉米相比，转基因玉米戊的花粉耐热性提高。

上述方法中，所述转基因玉米戊可为实施例提及的ms42-OE1或ms42-OE2。

上述方法中，所述“提高出发玉米中所述蛋白质ms42的活性和/或表达量”具体可通过向出发玉米中导入所述编码所述蛋白质ms42的核酸分子实现。所述编码所述蛋白质ms42的核酸分子具体可通过向出发玉米导入含有编码所述蛋白质ms42的核酸分子的重组载体实现。所述重组载体可为重组质粒pBCXUN-ms42。

实验证明，在玉米自交系B73中过表达ms42基因可以提高玉米花粉耐热性。ms42基因在提高花粉耐热性中具有重要的价值。由于花粉不耐热则花粉育性消失，因此，ms42基因在维持玉米雄性可育中具有重要的价值。

附图说明

图1为玉米突变体Ms42的表型鉴定结果。

图2为Ms42基因克隆和基因结构。A为Ms42的基因定位；B为Ms42的基因结构；C为Ms42的蛋白一级结构。

图3为Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2的突变类型和蛋白质Ms42含量的检测。

图4为Ms42-In1、Ms42-In2、Ms42-De2和玉米突变体Ms42的散粉期表型和花药育性鉴定。

图5为低热胁迫、中度热胁迫和高热胁迫下ms42-In1的雄穗表型和花药育性鉴定。

图6为低热胁迫、中度热胁迫和高热胁迫下ms42-In1的花粉育性统计结果。

图7为ms42-OE1和ms42-OE2中ms42基因的相对表达量检测及高热胁迫下WT、ms42-OE1和ms42-OE2的花粉育性统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

玉米突变体Ms42由美国Maize Genetics Cooperation Stock Center保存，Co-opID为502E；该玉米突变体在该保藏中心的具体网页链接如下：

pBUE411-BG载体记载于如下文献中：Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu,B.，Wang,X.C.，and Chen，Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants.Bmc Plant Biology 14.pBUE411-BG载体具有抗膦丝菌素抗性(又称草胺磷抗性)。

玉米自交系B73-329记载于如下文献中：Zhang M，Cao Y，Wang Z，et al.Aretrotransposon in an HKT1 family sodium transporter causes variation of leafNa+exclusion and salt tolerance in maize[J].New Phytologist，2017.，在文献中的名称为玉米B73-329。

实施例1、与玉米雄性核不育相关的Ms42基因的图位克隆

一、玉米突变体Ms42的表型鉴定和花药育性鉴定

1、观察玉米突变体Ms42和玉米自交系B73(以下简称野生型或WT)的表型。

结果表明(见图1)，与野生型相比，玉米突变体Ms42表现出完全的雄性不育表型，但二者的营养生长状态无显著差异；散粉期，玉米突变体Ms42花药不能外露，花药更小；通过显微解剖，发现玉米突变体Ms42花药出现严重的萎缩。

2、花药育性鉴定

取玉米突变体Ms42或野生型的花药，碾碎(目的为获得花粉粒)，用1％I2-KI溶液染色。

结果表明，野生型的花粉粒为黑色且饱满，玉米突变体Ms42的花粉粒未被染成黑色且不规则(不是饱满状态)(见图1)。玉米突变体Ms42表现完全的雄性不育。

3、本发明的发明人用野生型的花粉对玉米突变体Ms42或野生型的雌穗进行授粉，观察结实情况。

结果表明，二者可以正常结实。

由此可见，玉米突变体Ms42的雌性育性正常，即雌配子发育正常。

二、玉米突变体Ms42遗传分析及与玉米雄性核不育相关的Ms42基因的图位克隆

1、为进一步研究玉米突变体Ms42的特性并获得目的基因，本发明的发明人以玉米突变体Ms42作为母本，以玉米自交系B73为父本进行杂交，得到杂交F1种子。

2、种植杂交F1种子，得到杂交F1植株。观90察杂交F1植株是否雄性可育。

结果表明，杂交F1植株表现出1:1育性分离(雄性可育：雄性不育＝134:142，χ2<χ2(0.05,1)＝3.84)。符合单基因显性突变的遗传定律。

由此可见，玉米突变体Ms42的雄性不育表型由一个显性基因控制。

3、本发明的发明人使用图位克隆方法来分离导致不育表型的基因。具体如下：

(1)将玉米突变体Ms42分别与玉米自交系B73和Zheng58杂交，产生了两个大的F1分离群体。连锁分析将位点定位在6号染色体的长臂上，通过使用两个背景分离群体的5000多株F1植物，将其进一步限定在两个InDel标记M2和M6之间的115kb区域。

(2)根据MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)的B73 v4参考基因组注释，在此区域内包含6个候选基因。(见图2中A)。

(3)为了进一步验证突变的基因，本发明的发明人分别使用雄性不育的亲本植物(即玉米突变体Ms42)和雄性可育的亲本植物(即玉米自交系B73)的减数分裂雄蕊提取RNA通过RNA-Seq分析这些基因的编码序列。

结果表明，雄性可育亲本和雄性不育亲本中存在一个候选基因。雄性不育亲本中该候选基因命名为Ms42基因，Ms42基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质Ms42。雄性可育亲本中，该候选基因命名为ms42基因，ms42基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白质ms42。Ms42基因和ms42基因的不同之处在于：ms42基因第一个外显子的1072和1094位核苷酸处为鸟嘌呤(G)，而Ms42基因第一个外显子的1072和1094位核苷酸处为腺嘌呤(A)；两个单碱基突变分别导致了从谷氨酸(Glu)到赖氨酸(Lys)和从甘氨酸(Gly)到天冬氨酸(Asp)的两个氨基酸替换(图2中B和C)。发明人推测是ms42基因的这两个位点突变导致了玉米突变体Ms42玉米显性雄性不育的表型。

实施例2、培育雄性可育玉米突变株及其验证

选择一个靶点进行实验。靶点序列为：5’-GTCCGCGCAGAAAAAACGCGG-3’(即SEQ IDNo：2或SEQ ID No：4自5’末端起第297-316位)，对应靶基因为Ms42基因或ms42基因。

一、重组质粒的获得

1、人工合成引物42CAS9-F：5’-GGCGTCCGCGCAGAAAAAACGCG-3’和引物42CAS9-R：5’-AAACCGCGTTTTTTCTGCGCGGA-3’，用去离子水分别将引物42CAS9-F和引物42CAS9-R稀释至100μM，得到引物42CAS9-F稀释液和引物42CAS9-R稀释液；然后进行退火反应，形成退火靶点片段。

退火程序为：95℃10min，89℃7-8min，83℃7-8min，77℃7-8min，71℃7-8min，16℃保存。

2、将pBUE411-BG载体和退火靶点片段连接，得到重组质粒。

连接体系为15μL，由2μL退火靶点片段、2μL pBUE411-BG载体、1.5μL 10×NEB T4Buffer、1.5μL 10×BSA、1μL限制性内切酶BsaI、1μL T4 Ligase和6μL ddH

连接程序为：37℃5h；50℃5min；80℃10min。

二、突变株的获得

1、将重组质粒通过液氮冷冻法转至根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌转化至玉米突变体Ms42，经过筛选、分化和生根后，获得T

3、分别以T

4、分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与SEQ ID No：2所示的Ms42基因Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。

获得3个纯合突变株系(即在玉米两条染色体的同一位置发生相同的突变，本质就是Ms42基因和ms42基因均发生了移码，不再编码蛋白质Ms42和蛋白质ms42)，分别命名为Ms42-In1(即In1)、Ms42-In2(即In2)和Ms42-De2(即De2)。Ms42-In1和Ms42-In2在Ms42基因和ms42基因的编码区分别发生了“A”1个核苷酸的插入和“TT”2个核苷酸的插入，从而引起了移码；Ms42-De2在Ms42基因和ms42基因的编码区发生了“TT”2个核苷酸的缺失，从而引起了移码。突变类型具体见图3中A。

5、采用Western blot方法检测玉米自交系B73(简称WT)、Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2中蛋白质Ms42或蛋白质ms42的表达量，其中一抗为ms42特异性抗体(将ms42蛋白按照ABclonal公司流程进行免疫纯化抗体的制备)和Actin抗体(EASYBIO公司的产品，产品目录号为BE7008)，ms42特异性抗体用于检测蛋白质Ms42和蛋白质ms42，Actin抗体用于检测内参蛋白ZmActin蛋白。具体方法为：分别取玉米自交系B73、Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2的未成熟雄穗，液氮研磨提取总蛋白，之后采用ms42特异性抗体和Actin抗体westernblot检测。

检测结果见图3中B。结果表明，玉米自交系B73植株中可以检测到Ms42蛋白或ms42蛋白的条带，而Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2中无法检测到Ms42蛋白或ms42蛋白的条带。因此，3个纯合突变株系Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2均不编码蛋白质Ms42和蛋白质ms42。

三、突变株的表型鉴定和花药育性鉴定

1、观察玉米突变体Ms42、Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2散粉期的表型。

观察结果见图4中第一行。结果表明，散粉期，玉米突变体Ms42表现出完全的雄性不育表型、花药不能外露，Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2雄性可育，花药发育正常。玉米突变体Ms42、Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2的营养生长状态均无显著差异。

2、取玉米突变体Ms42、Ms42-In1、Ms42-In2或Ms42-De2的花药，碾碎(目的为获得花粉粒)，用1％I2-KI溶液染色。

结果见图4中第二行。结果表明，玉米突变体Ms42的花粉粒未被染成黑色且不规则(不是饱满状态)，Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2的花粉粒为黑色且饱满。

由此可见，玉米突变体Ms42表现完全的雄性不育，Ms42-In1、Ms42-In2和Ms42-De2恢复为雄性可育。

Cas9培育雄性可育玉米突变株实验结果证实Ms42基因两个位点突变导致了玉米的显性雄性不育表型。

实施例3、蛋白质ms42对花粉耐热性的影响

实验一、

分别将散粉期的玉米自交系B73(以下简称WT)和实施例2获得的Ms42-In1植株置于低热胁迫LHS(32℃处理14小时)、中度热胁迫MHS(35℃处理14小时)或高热胁迫HHS(35℃处理24小时)，观察表型并进行花药育性鉴定。进行花药育性鉴定的方法为：取花药，碾碎(目的为获得花粉粒)，用1％I2-KI溶液染色；被染成黑色的花粉粒可育，未被染成黑色的花粉粒不育；最后统计花粉育性，花粉育性＝被染成黑色的花粉粒数/(被染成黑色的花粉粒数+未被染成黑色的花粉粒数)×100％

玉米自交系B73和Ms42-In1均雄性可育。但玉米自交系B73可以表达蛋白质ms42，Ms42-In1不能表达蛋白质ms42，蛋白检测结果见图3中B。

高热胁迫处理后的表型见图5中右侧。结果表明，高热胁迫处理后，与WT相比，Ms42-In1花药不能外露；即高热胁迫处理后，Ms42-In1表现完全的雄性不育(Ms42-In1的花粉不耐热)。

花药育性鉴定结果见图5中左侧和图6。结果表明，LHS处理下，Ms42-In1与WT的花粉育性无显著差异；但在MHS和HHS处理下，与WT相比，Ms42-In1的花粉活力均显著下降(即Ms42-In1的花粉不耐热)。由此可见，Ms42-In1的花粉发育对高温胁迫比WT更敏感。

实验二、

(1)将植物表达载体pBCXUN-UbiP的限制性内切酶AscI和KpnI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:4所示的DNA分子(即ms42基因)，得到重组质粒pBCXUN-ms42。

植物表达载体pBCXUN-UbiP为将pBCXUN载体(记载于如下文献中：Chen Songbiao，Songkumarn Pattavipha，Liu Jianli，et al.A versatile zero background T-vectorsystem for gene cloning and functional genomics.[J].Plant Physiol.，2009，150:1111-21.)中的HYG基因替换为Bar基因得到的重组质粒。植物表达载体pBCXUN-UbiP中，启动子为Ubiquitin启动子，终止子为T-nos终止子。植物表达载体pBCXUN-UbiP具有抗膦丝菌素抗性(又称草胺磷抗性)。

(2)将重组质粒pBCXUN-ms42通过液氮冷冻法转至根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

(3)将重组农杆菌转化至玉米自交系B73(简称WT)，经过筛选、分化和生根后，获得拟转ms42基因玉米。具体转化方法参考如下文献：魏晓禹，邵诗迪，孙苏等，农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立，吉林农业大学学报，2017(06)640-647；黄璐，卫志明，农杆菌介导的玉米遗传转化[J]，实验生物学报，1999(04).

(4)分别提取各个拟转ms42基因玉米叶片的基因组DNA并作为模板，采用5’-CCTGAGCTGCTGAACCGTCT-3’和5’-TCGTCCATGCCGTCCTCGT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(5)完成步骤(4)后，将各个PCR扩增产物进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果以某拟转ms42基因玉米的基因组DNA为模板得到的PCR扩增产物中含有约473bp的DNA片段，则该拟转ms42基因玉米为转ms42基因玉米(阳性植株)；否则不为转ms42基因玉米。

结果表明，共获得转ms42基因玉米为10株，依次命名为ms42-OE1和ms42-OE10。

(6)提取玉米(ms42-OE1、ms42-OE2或玉米自交系B73)未成熟雄穗的总RNA，之后反转录为cDNA，实时定量PCR检测cDNA中ms42基因的相对表达量(以ZmActin(Zm00001d010159)基因为内参基因)。

检测ms42基因的引物为F：5’-TTCGATCCTCTGTCCCACGAG-3’和R：5’-AGACCGGCAACAGGATTCAATC-3’。

检测ZmActin基因的引物为5’-TCACCCTGTGCTGCTGACCG-3’和5’-GAACCGTGTGGCTCACACCA-3’。

实验重复三次取平均值。检测结果见图7中A。结果表明，与玉米自交系B73相比，ms42-OE1和ms42-OE2中ms42基因的相对表达量均显著增加。

分别将散粉期的玉米自交系B73(以下简称WT)、ms42-OE1和ms42-OE2植株置于常规处理NT(28℃处理16小时或24小时)或更高热胁迫HHT(38℃处理16小时或24小时)，观察表型并进行花药育性鉴定。进行花药育性鉴定的方法为：取花药，碾碎(目的为获得花粉粒)，用1％I2-KI溶液染色；被染成黑色的花粉粒可育，未被染成黑色的花粉粒不育；最后统计花粉育性，花粉育性＝被染成黑色的花粉粒数/(被染成黑色的花粉粒数+未被染成黑色的花粉粒数)×100％

花药育性鉴定结果见图7中B。花粉育性统计结果见图7中C。结果表明，常规处理时，WT、ms42-OE1和ms42-OE2的花粉育性无显著差异；38℃高热胁迫处理16小时或24小时后，与WT相比，ms42-OE1和ms42-OE2的花粉育性均显著提高。由此可见，与WT相比，ms42-OE1和ms42-OE2的花粉更具有耐热性。

上述结果表明，ms42基因在提高花粉耐热性中具有重要的价值。由于花粉不耐热则花粉育性消失，因此，ms42基因在维持玉米雄性可育中具有重要的价值。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国农业大学

<120>调控玉米花粉育性和花粉耐热性的方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>912

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1 5 10 15

Ala His Glu Ile Ala Val Glu Ala Gly His Ala Gln Leu Thr Pro Leu

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Pro Pro Asp Ser Val Pro Ala Ser Thr Ala Leu Ile Lys Val Ile Arg

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Gln Gln Val Phe Val Ala Glu Pro Ser Val Pro Asp Thr Val Ser Ile

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Leu Arg Gly Leu Lys Lys Lys Tyr Glu Gly His His Asp Val Arg Ile

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Gln Asp Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Gln Leu Ser Ala Arg Tyr Ile

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<212>DNA

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ccgccggact ccgtcccggc gtccacggca ctgatcaagg tcatccgccg ggcgcagtcc 300

gcgcagaaaa aacgcgggga ctctcacctc gccgtcgacc agctgctgct cggcctgctc 360

gaggactcgc agatctccga ctgcctcaag gaggccggcg tgtccgcggc gcgggtgcgc 420

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actaacttcc aggcgctcaa gacatacggc cgggacctcg tcgagcaggc cgggaagctt 540

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cggctcaagg ccgtgctcaa ggaggtggaa gaggccgagg ggaaggtcat tctcttcatc 840

gacgagatac acctcgtcct gggcgcgggc aggacggagg gttccatgga cgcggccaac 900

ctgttcaagc caatgctggc gaggggacag ctcaggtgca tcggcgccac cacgctggag 960

gagtaccgca agtacgtgga gaaggacgca gcgttcgagc ggcggttcca gcaggtgttc 1020

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gcgaggtaca tcatgggtcg gcacctgcct gacaaagcca tagacctggt ggacgaggcc 1200

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atcgacgaga actgcacggt ctacatcgac gccgcgcccg gtaaggacga actggtctac 2580

agggtggacc ggagcggcgg tctggtgaac gctgagacgg ggatgaagtc ggacatcctg 2640

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