一种含有芪贞增免颗粒免疫增强药效物质基础的药物组合物及其制备方法和用途

摘要

本发明属于中兽药技术领域，具体涉及一种含有芪贞增免颗粒免疫增强药效物质基础的药物组合物及其制备方法和用途。所述药物组合物包含以下组分中的一种或多种：黄芪甲苷、槲皮素、羽扇豆醇、芦丁、芹菜素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、红景天苷或女贞酸。本发明药物组合物用于增强畜禽免疫力的药效物质基础明确，化学结构明确，组分固定且质量可控，为中药活性成分组合物的安全性和有效性奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于中兽药技术领域，具体涉及一种含有芪贞增免颗粒免疫增强药效物质基础的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

芪贞增免颗粒已收载于国家标准，是一种临床上常用于治疗畜禽免疫力低下的兽药，其主要成分包括黄芪、淫羊藿和女贞子，其中黄芪健脾补肺，益气固表为主药，淫羊藿补肾壮阳，女贞子滋阴补肾、养肝明目，共为辅佐，全方滋阴补肾，益气固表，增强机体免疫力。

目前已有学者考察了芪贞增免颗粒对正常小鼠免疫细胞因子的调节作用，结果表明其能够显著提高小鼠学区中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的分泌(参见，例如，叶志惠等，“两种中药颗粒剂对正常小鼠免疫细胞因子调节作用的研究”，中国兽药杂质，第53卷，第7期，2019年7月，第56-60页)。也就是说，芪贞增免颗粒增强机体免疫力的作用已被现代药理学方法所确证。

但是，目前尚无针对“芪贞增免颗粒”免疫增强药效物质基础的相关研究。对于“药效物质基础”的筛选经过“去粗取精，去伪存真”的过程，去除了中药及其复方中的无效甚至有害成分，使其疗效更为突出，毒副作用更低。“药效物质基础”的发现使得中药及其复方能够更加安全、有效和质量可控，使患者用药安全，并让药物对患者产生的效益最大化。

因此，非常有必要对经典兽药“芪贞增免颗粒”免疫增强药效物质基础进行研究。

发明内容

本发明填补了现有技术中的相关技术空白，开发出了一种含有芪贞增免颗粒免疫增强药效物质基础的药物组合物及其制备方法和用途。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种用于增强畜禽免疫力的药物组合物，所述药物组合物含有芪贞增免颗粒免疫增强药效物质基础，所述芪贞增免颗粒由以重量份数计170-190份黄芪、80-100份淫羊藿、80-100份女贞子制成。

作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述芪贞增免颗粒由以重量份数计180份黄芪、90份淫羊藿、90份女贞子制成。

作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述药物组合物是将所述芪贞增免颗粒以75％的乙醇溶液进行回流提取，减压浓缩至稠浸膏，再将总浸膏以水分散至全溶状态，过D101大孔树脂，用浓度为80％的乙醇溶液进行洗脱后得到的80％乙醇洗脱部位浓缩物。

作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述药物组合物包含以下组分中的一种或多种：黄芪甲苷、槲皮素、羽扇豆醇、芦丁、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷或女贞酸。

作为可选的方式，在上述药物组合物中，所述药物组合物由黄芪甲苷、槲皮素、羽扇豆醇、芦丁、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷和女贞酸组成。

作为可选的方式，在上述药物组合物中，以重量份数计所述药物组合物由1-20份黄芪甲苷、0.5-5份槲皮素、0.05-0.05份羽扇豆醇、0.5-5份芦丁、0.1-0.5份芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、3-10份红景天苷和0.1-0.5份女贞酸组成。

在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

将所述芪贞增免颗粒以75％的乙醇溶液进行回流提取，减压浓缩至稠浸膏，再将总浸膏以水分散至全溶状态，过D101大孔树脂，用浓度为80％的乙醇溶液进行洗脱，得到的80％乙醇洗脱部位浓缩物即为所述药物组合物。

作为可选的方式，在上述制备方法中，所述回流提取进行三次，每次2小时，以水分散至全溶状态步骤中加入的醇的量不超过总体系的10％。

作为可选的方式，在上述制备方法中，三次回流提取的料液比分别为1：10、1：12、1：12。

在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的药物组合物或者采用上述第二个方面所述的制备方法制备得到的药物组合物在制备用于增强畜禽免疫力的药物中的用途。

作为可选的方式，在上述用途中，所述药物的剂型选自：颗粒剂、口服液、粉剂或散剂。

优选地，所述药物的剂型为颗粒剂。

作为可选的方式，在上述用途中，所述药物用于预防或治疗以下畜禽的免疫力低下：鸡、鸭、鹅、猪、牛或羊。

优选地，所述药物用于预防或治疗鸡免疫力低下。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明首次针对“芪贞增免颗粒”免疫增强药效物质基础进行研究，填补了相关领域的技术空白，并且开发出了一种含有芪贞增免颗粒免疫增强药效物质基础的药物组合物及其制备方法和用途。本发明药物组合物用于增强畜禽免疫力的药效物质基础明确，化学结构明确，组分固定且质量可控，为中药活性成分组合物的安全性和有效性奠定基础。

附图说明

图1对照品薄层色谱鉴别。

图2二氯甲烷：甲醇＝3：1展开部分对照品。

图3二氯甲烷：甲醇＝20：1展开部分对照品。

图4：各提取段与芪贞增免颗粒对照药材以二氯甲烷：甲醇＝3：1展开。

图5各提取段与芪贞增免颗粒对照药材以二氯甲烷：甲醇＝5：1展开。

图6各提取段与芪贞增免颗粒对照药材以二氯甲烷：甲醇＝3：1展开。

图7各组小鼠耳肿胀率。

图8各组小鼠血清中IL-2、IgG、IgM、IFN-γ细胞因子的含量。

图9MTT法测定芪贞增免颗粒全成分对巨噬细胞的安全浓度。

图10不同剂量LPS对RAW264.7巨噬细胞炎症因子产生的影响。

图11芪贞增免颗粒全成分及拆分组分对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子产生的影响。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例：

1.“芪贞增免颗粒”各种提取物有效部位的制备

取10g“芪贞增免颗粒”样品，以75％的乙醇溶液进行回流提取共三次(料液比分别为1：10，1：12，1：12；每次提取时间为2h)，减压浓酸至稠浸膏，称重。将总浸膏以水分散至全溶状态(加入的醇的量不可超过总体系的10％)。过D101大孔树脂，用不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，分别收集水段，10％，30％，50％，80％，95％的洗脱部位浓缩、挥干，称重，备用。

“芪贞增免颗粒”由沈阳伟嘉生物技术有限公司生产，由黄芪180kg女贞子90kg淫羊藿90kg组成，制备工艺为以上三味，加水煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.30-1.35(80℃)的清膏，按清膏量，加蔗糖3份，糊精1份，混匀、制粒，低温干燥制成300kg颗粒。

2.芪贞增免颗粒拆分组分化学成分薄层色谱分析

2.1实验方法

经查阅资料，黄芪三萜皂苷类主成分为黄芪甲苷和齐墩果酸，含有槲皮素、乙酰齐墩果酸，但非主成分。女贞子三萜类主成分为齐墩果酸和乌索酸，环烯醚萜类主成分为红景天苷，芦丁、木犀草素、女贞酸、羽扇豆醇、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷均为女贞子非主成分。

分别吸取对照药材溶液、各段供试品溶液，分别点于同一自制硅胶G薄层色谱板上，用二氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，喷以5％香草醛硫酸溶液观察。

2.2实验结果

醇提得总浸膏为7.4023g，出膏率为74％。10％、30％、50％、80％、95％乙醇洗脱液经减压，浓缩，挥干分别得浸膏309.2mg、273.6mg、369.9mg、222.8mg、170.2mg，水段未挥干。

以展开剂比例为二氯甲烷：甲醇＝5：1对11种对照品进行薄层鉴别，结果图1所示。由图可知，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、女贞酸Rf值间于0.3-0.5，故选用展开剂比例为二氯甲烷：甲醇＝5：1。对其他对照品经过多次摸索寻找最佳展开剂比例条件，结果如图2-图3所示。黄芪甲苷、槲皮素、芦丁以二氯甲烷：甲醇＝3：1展开，Rf值处于0.4左右。乌索酸、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、羽扇豆醇、木犀草素以二氯甲烷：甲醇＝20：1展开，Rf值处于0.5左右。

黄芪甲苷、槲皮素、芦丁与各提取段以二氯甲烷：甲醇＝3：1展开剂比例展开。由图4推测看出，乙酸乙酯层、80％乙醇段可能含有黄芪甲苷；乙酸乙酯层、正丁醇层、80％段可能含有槲皮素和芦丁。芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、女贞酸与各提取段以二氯甲烷：甲醇＝5：1展开剂比例展开。由图5推测看出，正丁醇层、30％乙醇段、50％乙醇段、80乙醇段可能含有芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、女贞酸。乌索酸、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、羽扇豆醇、木犀草素与各提取段以二氯甲烷：甲醇＝20：1展开剂比例展开。由图6推测看出，乙酸乙酯层、95％乙醇段可能含有乙酰齐墩果酸；正丁醇层、80％乙醇段可能含有羽扇豆醇；乙酸乙酯层可能含有齐墩果酸和乌索酸；95％乙醇段、正丁醇层可能含有木犀草素。

薄层色谱分析各个拆分组分化学成分结果表明：30％乙醇段、50％乙醇段可能含有芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷、女贞酸；80％乙醇段可能含有黄芪甲苷、槲皮素、羽扇豆醇、芦丁、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷和女贞酸。95％乙醇段可能含有乙酰齐墩果酸。

3.芪贞增免颗粒拆分组分对免疫低下小鼠免疫功能的影响实验

3.1材料

3.1.1药品及试剂

环磷酰胺，无菌生理盐水，印度墨汁，1％碳酸钠溶液；2,4-二硝基氟苯；IL-2、IgG、IgM、IFN-γ细胞因子试剂盒。

芪贞增免颗粒提取物、拆分组分(30％、50％、80％，采用第1部分所述方法制备)。

3.1.2试验动物

ICR小鼠84只，20±2g，雌雄各半。

3.2方法

3.2.1对小鼠非特异性免疫功能的影响(碳粒廓清法)

分组：将48只小鼠随机分为6组，每组8只，分别为：空白对照组(CT)、模型对照组(M)、全成分组(Q)、30％组(Q30)、50％组(Q50)、80％组(Q80)。

给药与造模：除空白对照组和模型对照组，其他组别每日按照表1相应剂量灌胃给药(表1)，连续给药4天。除空白对照组，其余5组在试验第2天和第4天腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺。

于试验第5天，尾静脉注射25％印度墨汁200μL，注射后分别于2min(t

表1.碳廓清试验动物给药剂量表

3.2.2对小鼠细胞免疫影响的检测(迟发型超敏反应DTH)

将36只小鼠随机分为6组，每组6只，分别为：空白对照组(CT)、模型对照组(M)、全成分组(Q)、30％组(Q30)、50％组(Q50)、80％(Q80)组。给药剂量见表2。连续给药7天。除空白对照组，其余5组在试验第4天和第6天腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺。

表2.细胞免疫试验动物给药剂量表

各组小鼠从试验第2天起于腹部皮肤处均匀涂抹1％二甲硝基氟苯(DNFB)50μL，每日一次连续2d。全部小鼠于试验第7天时，将1％二硝基氟苯10μL均匀涂于小鼠右耳背侧进行抗原激发，24h后摘除眼球取血，脱颈处死，剪下左右两耳，用6mm打孔器在两耳相同部位打取耳片称重，左右耳片重量之差为耳肿胀度。ELISA法测定血清中IL-2、IgG、IgM、IFN-γ的含量。同时摘取小鼠胸腺、脾脏，精确称重，按下列公式计算脾脏指数和胸腺指数。

肿胀度＝右耳质量-左耳质量

肿胀率＝(右耳-左耳)/左耳×100％

3.3结果

3.3.1药物对小鼠脏器指数的影响

各组小鼠的脏器指数变化见表3。与空白对照组相比，模型组的脾脏指数和胸腺指数极显著低于空白对照组，说明本次环磷酰胺造小鼠免疫低下模型成功。与模型组对比，造模后给药的各组脏器指数与模型对照组没有显著差异，说明本次各组药物不能改善环磷酰胺所致的小鼠免疫器官萎缩。

表3.药物对免疫抑制小鼠脏器指数的影响

注：与空白对照组比较，

3.3.2药物对小鼠非特异性免疫功能的影响

药物对小鼠非特异性免疫功能(碳粒廓清试验)结果见表4。由结果可知，与空白对照组相比，模型对照组的廓清指数和吞噬指数极显著低于空白对照组，说明环磷酰胺造模成功。与模型对照组相比，芪贞增免颗粒全成分组的廓清指数和吞噬指数均高于模型对照组，说明芪贞增免颗粒全成分能够提高免疫低下小鼠机体的吞噬功能。其中在三个拆分组分中，50％组和80％组的廓清指数和吞噬指数明显高于30％组，且接近全成分组。

表4.药物对免疫抑制小鼠吞噬功能的影响

注：与空白对照组比较，

3.3.3药物对小鼠细胞免疫功能的影响

各组小鼠的耳肿胀率见图7。与空白组(CT)相比，模型组(M)的肿胀率显著低于空白组(CT)，说明环磷酰胺造免疫低下模型成功。与模型组相比，芪贞增免颗粒全成分组(Q)显著降低了小鼠耳肿胀率，而在三个拆分组分中，30％组(Q30)和50％组(Q50)均呈现出降低小鼠耳肿胀率的效果，其中50％组的耳肿胀率接近全成分组。

各组小鼠血清中IL-2、IgG、IgM、IFN-γ细胞因子的含量如图8所示。IL-2和IgM的含量各组没有明显差异；IgG和IFN-γ的模型组均低于正常组，说明本次环磷酰胺所致的免疫低下可使机体IgG和IFN-γ细胞因子的水平降低；与模型组对比，芪贞增免颗粒全成分组的IgG和IFN-γ均高于模型组，说明芪贞增免颗粒可提高免疫低下小鼠的该两种细胞因子的水平；在拆分组分中，IFN-γ的结果中三种拆分组分无明显差异，均无提高IFN-γ的效果，而IgG的结果中三种拆分组分均有提高IgG水平的效果，其中50％组和80％组IgG的水平高于30％组。

3.4结论

芪贞增免颗粒全成分能够提高免疫低下小鼠机体的吞噬功能，与前期试验结果对应。在拆分组分中，50％组和80％组具有较高吞噬指数。芪贞增免颗粒全成分能够缓解小鼠在细胞免疫功能试验中的耳肿胀程度，与前期试验结果对应。在拆分组分中50％组的耳肿胀率最接近全程分组，说明50％组可能含有抑制炎症反应的活性成分。芪贞增免颗粒全成分能够提高免疫低下机体IgG和IFN-γ细胞因子的水平，与前期结果对应。在拆分组分中，50％组和80％组能够显著提高IgG的水平。

4.芪贞增免颗粒拆分组分对LPS诱导的RAW巨噬细胞TNF-α炎症因子产生的影响

4.1材料

RAW264.7巨噬细胞，LPS，TNF-α细胞因子ELISA试剂盒，DMEM培养液，胎牛血清。芪贞增免颗粒，拆分组分(30％、50％、80％，采用第1部分所述方法制备)。

4.2方法

4.2.1药物对RAW246.7巨噬细胞安全浓度的测定

将RAW246.7巨噬细胞调整为1×10

4.2.2不同剂量LPS对RAW246.7巨噬细胞炎症因子产生的影响

将RAW246.7巨噬细胞调整为3×10

4.2.3药物及拆分组分对LPS诱导的RAW巨噬细胞TNF-α炎症因子产生的影响

将RAW246.7巨噬细胞调整为5×10

4.3结果

4.3.1药物对RAW246.7巨噬细胞安全浓度的测定

药物对RAW246.7巨噬细胞安全浓度的测定结果如图9所示。结果可知，芪贞增免颗粒全成分在浓度为7.81-2000μg/mL的范围内对细胞毒性较小，当浓度在500-1000μg/mL时对巨噬细胞的增殖有一定的刺激作用。芪贞增免颗粒的最大安全浓度为2000μg/mL。

4.3.2不同剂量LPS对RAW264.7巨噬细胞炎症因子产生的影响

不同剂量LPS对RAW264.7巨噬细胞炎症因子产生的影响结果如图10。结果可知，四个浓度的LPS刺激后细胞上清液中TNF-α的含量没有显著差异。

4.3.3芪贞增免颗粒及拆分组分对LPS诱导的RAW巨噬细胞TNF-α炎症因子产生的影响

芪贞增免颗粒及拆分组分对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子产生的影响如图11所示。与空白组(CT)相比，LPS刺激24后能明显提高模型组(MT)TNF-α的含量，而芪贞增免颗粒全成分能进一步提高细胞上清液中TNF-α的水平。其中，芪贞增免颗粒拆分组分80％组与另外两组拆分组分相比有更高的TNF-α的水平并接近全成分组。

4.4结论

本次试验结果得到芪贞增免颗粒对RAW巨噬细胞的最大安全浓度为2000μg/mL，并且在500-1000μg/mL的浓度范围内对巨噬细胞的增殖有一定的刺激作用，因此在接下来的试验中选用1000μg/mL作为芪贞增免颗粒全成分的参考剂量，以此为基础计算对应的拆分组分剂量。最后试验结果得到80％组的芪贞增免颗粒拆分组分能明显提高LPS刺激后细胞的TNF-α表达量。为了摸清LPS对RAW264.7巨噬细胞在24h内的最佳刺激浓度，本次试验在进行拆分组分的试验之前对LPS的刺激剂量进行梯度的摸索，结果发现提高LPS的浓度并不能显著影响细胞上清液中TNF-α的含量，最后选择1μg/mL作为正式试验的LPS刺激浓度。芪贞增免颗粒拆分组分80％组与另外两组拆分组分相比有更高的TNF-α的水平，并接近全成分组。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。