氯硝柳胺在抗鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用

摘要

氯硝柳胺在抗鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用，本发明属于兽医医药技术领域，具体涉及抗鸡传染性支气管炎病毒药物的活性成分包括氯硝柳胺及其药学上可接受的盐，该盐可以为乙醇胺盐、磷酸盐，氯硝柳胺的有效浓度为1μg/mL～20μg/mL，本发明首次公开氯硝柳胺具有抑制IBV复制的作用，氯硝柳胺有效浓度为1～20μg/mL，在鸡传染性支气管炎的预防及治疗中有应用价值。本发明为开发氯硝柳胺防治动物疾病新的适应证提供了新的思路，在兽医领域尤其是鸡传染性支气管炎防治上具有重要的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及兽医医药技术领域，具体涉及氯硝柳胺在抗鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用。

背景技术

氯硝柳胺(Niclosamide，NIC)是传统的抗蠕虫药物，临床已使用50余年，常用于猪、禽多种绦虫病的治疗，也作为灭螺剂广泛用于人血吸虫病的防治，其抗寄生虫机制被认为是抑制线粒体的氧化磷酸化及厌氧菌的ATP的产生。近年来，由于新药研发投资大、周期长、风险高，老药新用已引起国内外高度重视。研究发现，氯硝柳胺除传统的抗蠕虫作用外，还具有抗革兰阳性菌、广泛抗肿瘤、广谱抗病毒及增强黏菌素等抗菌药的抗菌活性等作用。但对其抗病毒活性的研究多是人医方面的研究，如对人的免疫缺陷病毒、丙肝病毒(HCV)等病毒抑制作用的研究报道，在抗动物病毒方面，仅搜索到一篇关于氯硝柳胺对猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的抑制作用报道。氯硝柳胺具有毒性低、对人畜安全性高、价格低廉等优势，在动物疾病特别是细菌病、病毒病防治方面有巨大应用潜力。但氯硝柳胺的药理活性尤其是抗动物病毒方面的作用不明，限制了其在兽医上的新用途。

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitisvirus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性的病毒性传染病。IB以呼吸道症状、产蛋量下降或肾脏病变为主要特征，目前，发病率可达 20％～80％，在我国各养鸡密集省份及地区呈地方性流行，给我国的养鸡业造成了重大的经济损失。该病血清型较多，发病后尚无特效药物治疗。仅有报道表明，部分中草药对于该病有一定的预防和治疗效果。未见有氯硝柳胺抗IBV的研究报道及专利。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明提供氯硝柳胺在抗鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用。

本发明提供如下技术方案：氯硝柳胺在抗鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用。

优选地，所述抗鸡传染性支气管炎病毒药物的活性成分包括氯硝柳胺及其药学上可接受的盐。

优选地，所述盐可以为乙醇胺盐、磷酸盐。

优选地，所述抗鸡传染性支气管炎病毒药物的有效浓度为1μg/mL～ 20μg/mL。

优选地，所述抗鸡传染性支气管炎病毒药物的剂型包括可溶性粉、颗粒剂、乳剂、纳米乳、混悬剂、注射剂

优选地，所述抗鸡传染性支气管炎病毒药物的用法为：每公斤料加入200～ 800mg该药物拌料或每升水加入100～400mg该药物混饮，连用5～7天。

优选地，所述鸡传染性支气管炎包括：呼吸道型、肾型、生殖道型、肠型和肌肉型。

优选地，所述鸡传染性支气管炎病毒包括Massachusetts型、D41型、Holte 型、T型、Gray型和Ark型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)氯硝柳胺作为传统意义上的灭螺药和驱除绦虫的药物，本发明首次公开氯硝柳胺具有抑制IBV复制的作用，氯硝柳胺有效浓度为1～20μg/mL，在鸡传染性支气管炎的预防及治疗中有应用价值，为开发氯硝柳胺防治动物疾病新的适应证提供了新的思路，在兽医领域尤其是鸡传染性支气管炎防治上具有重要的应用潜力；

(2)本发明所涉及的鸡传染性支气管炎病毒包括Massachusetts型、D41 型、Holte型、T型、Gray型和Ark型等血清型的IBV；所涉及的鸡传染性支气管炎包括：呼吸道型、肾型、生殖道型、肠型和肌肉型等。

具体实施方式

下面对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

氯硝柳胺在抗鸡传染性支气管炎病毒药物中的应用，其中，抗鸡传染性支气管炎病毒药物的活性成分包括氯硝柳胺及其药学上可接受的盐，该盐可以为乙醇胺盐、磷酸盐，抗鸡传染性支气管炎病毒药物的有效浓度为1μg/mL～ 20μg/mL。

将氯硝柳胺及其药学上可接受的盐制成药物组合物，或制成药剂学上可接受的剂型，如可溶性粉、颗粒剂、乳剂、纳米乳、混悬剂、注射剂。

抗鸡传染性支气管炎病毒药物的用法为：每公斤料加入200～800mg该药物拌料或每升水加入100～400mg该药物混饮，连用5～7天。

所涉及的鸡传染性支气管炎包括：呼吸道型、肾型、生殖道型、肠型和肌肉型等。

所涉及的鸡传染性支气管炎病毒包括Massachusetts型、D41型、Holte型、 T型、Gray型和Ark型等血清型的IBV。

实施例1：氯硝柳胺对鸡传染性支气管炎病毒的抗病毒活性的影响

1.1材料

1.1.1药品

(1)氯硝柳胺：购于成都格雷西亚化学技术有限公司。

(2)鸡胚：9d的SPF鸡胚，购于山东家禽研究所。

(3)标准毒株传染性支气管炎病毒(IBV)；标准株Mass41：源自中国兽药监察所。

1.2方法

1.2.1传染性支气管炎病毒(IBV)的增殖尿囊腔法接种病毒：

将传染性支气管炎病毒IBV M41标准株按常规方法(尿囊腔法)接种9日龄SPF鸡胚，37℃恒温培养72h，收获尿囊液，连续鸡胚传代得IBV。

1.2.2鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备：

取9日龄SPF鸡胚于超净工作台中用碘酒和75％乙醇消毒，无菌取出鸡胚，置于培养皿中，分离头部、四肢和内脏，剪成小块，用PBS溶液洗3遍后加5～ 6倍量0.25％胰酶37℃消化15min，加入细胞生长液终止消化并离心5min，转速为1000rpm。弃上清，沉淀部分用PBS洗3次并吹打均匀，细胞计数并调整细胞密度至2×10

1.2.3IBV半数细胞感染量测定(TCID

取IBV尿囊液，10倍系列稀释，加入长满单层CEF的96孔板，测得IBV 对CEF的半数细胞感染量(TCID

1.2.4氯硝柳胺对鸡胚成纤维细胞最大安全浓度的测定：

用细胞维持液分别将氯硝柳胺稀释为200、100、50、20、10、5、2、1μg/ mL。

取单层CEF的96孔板弃培养液后分别加入各浓度的氯硝柳胺，每孔100μ L，每浓度6重复。置于CO

1.2.5氯硝柳胺体外抗IBV试验：

根据以上实验测出氯硝柳胺的最大安全浓度为50μg/mL。取长至单层的C EF细胞进行如下分组：

A组：预防组(先加药后接种病毒)，为检测氯硝柳胺是否能刺激CEF细胞产生抗IBV作用，CEF接种IBV前24h，加入用细胞维持液稀释为20、10、 5、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL的氯硝柳胺，每浓度做6个重复，每孔加10 0μL。置于CO

B组：治疗组(接种病毒后加药)，为检测氯硝柳胺能否抑制IBV在CEF 细胞中的复制，取CEF细胞加入IBV后培养4h，分别加入氯硝柳胺20、10、5、 2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，每个浓度6重复，每孔加100μL。

A组、B组均设下述对照组。

细胞对照组：仅细胞维持液200μL。

病毒对照组：细胞维持液100μL和100TCID50病毒液100μL。

空白对照组：无细胞调零孔(无细胞，仅加细胞生长液)。

所有分组均放在37℃，5％的CO

1.2.6数据处理：

计算平均值和标准差，数据以Means±SD表示，用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较。病毒抑制率通过方差分析比较不同加药方式间的差异性，显著性水平P＜0.05。

2结果

2.1氯硝柳胺对细胞的安全浓度：

氯硝柳胺浓度为1～50μg/mL的OD值与空白对照组的OD值无显著性差异，初步确定50μg/mL为氯硝柳胺最大安全浓度。

2.2氯硝柳胺体外抗IBV试验

氯硝柳胺体外抗IBV试验结果见表1。

表1.氯硝柳胺体外抗IBV实验各组细胞OD值(X＝±s)

注：与病毒对照组相比**p＜0.01，*p＜0.05。

由表1可知：在预防组、治疗组实验中，氯硝柳胺浓度为20、10、5、2、 1μg/mL时的OD值均明显高于病毒对照组(IBV感染细胞)的OD值(p＜0.05)，有浓度依赖性，因此氯硝柳胺有明显的抗IBV感染作用。同时，CEF细胞加入 IBV后培养4h，再加入不同浓度氯硝柳胺(10、5、2μg/mL)的OD值要高于高于病毒对照组(IBV感染细胞)的OD值(p＜0.05)，说明氯硝柳胺在细胞 IBV感染后仍有抑制病毒复制的作用，也说明其抗病毒活性并不限于干扰IBV 的吸附、粘附或进入细胞，还具有抑制病毒复制的活性。先给氯硝柳胺后再感染IBV的OD值要高于IBV感染后再给药的OD值，表明氯硝柳胺用药越早对鸡传染性支气管炎病毒IBV的作用更强。

3结论：

氯硝柳胺作为我国传统驱绦虫药，有抑制IBV复制作用，其有效浓度为1～ 20μg/mL，在鸡传染性支气管炎的预防及治疗中有应用价值，本实验的结果为氯硝柳胺新适应症的开发提供了实验依据。

实施例2：氯硝柳胺对人工感染鸡传染性支气管炎的治疗试验

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种仅发生于鸡的急性、高度接触性、传染性呼吸道疾病。以呼吸道症状、产蛋量下降或肾脏病变为主要特征，给养鸡业带来较大的经济损失。该病血清型较多，发病后尚无有效药物治疗。为探寻该病的防制策略，本试验根据前期发现氯硝柳胺具有抗支气管炎病毒作用，进行人工感染鸡传染性支气管炎的治疗试验。

1材料与方法

1.1试验用鸡：

健康的1日龄白羽肉鸡200只，常规饲养至12日龄供试验用，经琼扩试验检测IBV抗体为阴性；1日龄SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；

1.2攻毒：

用IBV M41强毒株，由中国兽药监察所提供，使用时将病毒1：10稀释后经气管接种试验鸡0.2mL/只。

1.3人工感染治疗试验：

鸡随机分为6组，每组40只。其中，试验1组为攻毒对照组：攻毒后不喂任何药物，隔离饲养。试验2组为药物预防组：攻毒前1天开始使用药物预防，按400mg/kg料拌料，连用7d。试验3～5组为攻毒治疗组(分别为高、中、低剂量组)：前4天分别按每L水400、200、100mg混饮氯硝柳胺(加助溶剂和碱溶解)，后3天分别按每公斤料800、400、200mg拌料；治疗组在攻毒48h 后出现症状时，开始按设计用量治疗，连用7d。试验6组为空白对照组，不攻毒，不喂任何药物，隔离饲养。

1.4疗效观察：

观察并记录用药前、后鸡只的临床症状，如精神状况、食欲、饮欲、流鼻涕、喷嚏、甩鼻、呼吸困难等，用药结束后继续观察5d，记录死亡数，统计发病率、治愈率、有效率、无效率。

治愈率：试验期间，经用药后临床症状消失，精神及采食情况恢复正常，判为治愈。每组治愈鸡数占每组试验鸡数的百分率为治愈率。

有效率：试验期间，除完全治愈的鸡只为有效外，凡试验期间未死亡，并且症状明显减轻，精神、饮欲、食欲有好转者也视为有效；每组有效鸡数占每组试验鸡数的百分比为有效率。

无效率：试验期间，治疗无效死亡或临床症状无改善者判为无效，每组无效鸡数占每组试验鸡数的百分比为无效率。

1.5数据统计：

用Excel 2013软件进行χ2检验分析。

2结果

试验1组及3～5组在攻毒48h，试验鸡全部出现明显的咳嗽、气喘和呼吸困难等症状，病鸡精神沉郁，食欲减少；羽毛蓬乱，翅膀下垂，闭目呆立，饮水欲增加，体温升高，流涕，喷嚏，咳嗽，夜间观察能听到明显的气管啰音，严重者张口呼吸。药物预防组(2组)精神状况明显好于治疗组；治疗各组服用不同剂量的氯硝柳胺，与病毒对照组(1组)比较，用药3d后鸡只病情逐渐缓解，精神渐显活泼，活动增加，食欲好转，咳嗽、打喷嚏症状减轻、频次减少、呼吸困难得到改善；其中，高剂量组、中剂量组治疗效果为佳，用药结束后病鸡的呼吸道症状明显减轻，夜间气管啰音消失，精神状态、饮水、采食基本恢复正常。

各组鸡的治愈率、有效率、无效率见表2。由表2可以看出，氯硝柳胺预防组、高剂量组、中剂量组与预防组的总有效率显著高于病毒对照组(P<0.05)，其中预防组总有效率最高为92.5％。

表2.疗效观察

注：NIC：niclosamide,氯硝柳胺；同列数据右肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

3结论：

氯硝柳胺对鸡传染性支气管炎有预防及治疗效果，其有效剂量是每升水 200～400mg混饮氯硝柳胺或按每公斤料400～800mg拌料，连用7天。

具体案例1

河南许昌长葛市某养鸡场，1600只蛋鸡在产蛋高峰后期发生严重呼吸道疾病，根据症状、病理剖检及试验室化验，确诊为传染性支气管炎，用氯硝柳胺治疗取得了较好的疗效。

1.疾病诊断

发病鸡主要临床症状表现为：怪叫，甩鼻，呼吸啰音，夜间尤为明显。病鸡高度沉郁，闭目缩颈，羽毛蓬松，排水样稀粪。食欲饮欲明显下降甚至废绝，产蛋率由92％下降到36％左右，蛋清稀薄如水。

剖检病死鸡，发现气管、支气管内有大量黏液，气囊混浊，个别有黄色于酪样物质附着。

经鸡胚接种和鸡传染性支气管炎检测试剂盒行ELISA检测，确诊为传染性支气管炎。

2.分组与治疗

将呼吸道症状较重的病鸡400只挑出，单独分两排(两组)鸡笼隔离饲养，每排200只鸡为一组，第一组为氯硝柳胺(NIC)治疗组，氯硝柳胺按每公斤料800mg拌料拌，同时用替米考星(TIM)溶液(25％)饮水(按每L水75 毫克)控制混合的支原体感染，连用药物7天。对食欲饮欲基本废绝的严重病鸡，用药第1-2天人工喂服含药的饲料及饮水。

3.疗效观察

开始用药后的第10天即停药后的第3天，观察鸡只的呼吸、采食、饮水、粪便、精神状态，记录死亡数和存活鸡只数，计算死亡率和存活率，并进行统计学处理。

4.试验结果

用药5d后，NIC治疗组鸡只呼吸道症状明显减轻，精神状态明显好转，采食量饮水量大于对照组，连用7d后症状基本消失，产蛋率也开始上升。开始用药后的第10天，治疗组与对照组的死亡率与存活率结果见表3。卡方检验表明， NIC治疗组的死亡率极显著低于对照组，存活率显著高于对照组(P<0.001)，说明氯硝柳胺在鸡产蛋期发生的传染性支气管炎有较好疗效。

表3.NIC对产蛋鸡1B的治疗效果

注：NIC：氯硝柳胺TIM：替米考星；**：P<0.001

4.结论

氯硝柳胺按每公斤料800mg拌料，连用7天，对产蛋期蛋鸡传染性支气管炎有明显的治疗效果。

具体案例2

郑州市西郊某养殖场共养蛋用雏鸡5000余只，雏鸡7日龄时免疫接种新支二联疫苗，18日龄接种IBD弱毒疫苗，21日龄接种ND IV系疫苗和IBD弱毒疫苗，同时肌肉注射了ND-IBD-IBV三联油乳剂灭活疫苗。鸡群生长到40日龄时陆续出现呼吸道疾病，主要表现为流鼻涕、咳嗽、气喘。初期少数出现发病，随后迅速波及全群。

1.临床症状：

发病初期患病鸡的眼眶湿润，眼结膜潮红流泪，精神状态逐渐变差，羽毛杂乱，双翅下垂并伴随呼吸道症状。发病2～3d后呼吸啰音、呼吸极度困难。患病饮水欲望增加，采食量逐渐下降，缩头呆立。并排出大量水样稀便。在发病4～5d后逐步进入到死亡高峰期，随后逐渐下降。

2.病理学变化：

解剖死鸡发现尸体严重脱水消瘦，肌肉发绀。鼻腔、气管有大量粘液，猴头充血，腺胃显著肿大，肾脏明显肿大，有大量尿酸盐沉积，呈花斑肾。输尿管亦有大量白色的尿酸盐沉积。

3.实验室诊断：

采集病死鸡的气管、肺、肾脏等病变脏器组织，反复冻融，充分研磨后，接种到11日龄IBV抗体呈阴性的鸡胚尿囊腔当中，接种4～5d后可以发现鸡胚生长发育停止，萎缩成团，尿囊液显著增多，羊水明显减少，绒毛显著增厚。鸡胚解剖可发现肾脏有尿酸盐沉积。选择使用鸡传染性支气管炎检测试剂盒进行ELISA检测，检测结果为阳性，初步判定为鸡传染性支气管炎病毒感染。结合养殖场的发病情况和严格的诊断，最终确诊为鸡肾型传染性支气管炎(肾型传支)。

4.分组与用药治疗：

将食欲饮水完全废绝、没有治疗价值的鸡立即扑杀，进行严格的无害化处理。其余的全群鸡按笼分为3组：氯硝柳胺治疗组(氯硝柳胺按每公斤料700 mg拌料拌，连用7天)、常规方法治疗组(即0.1％小苏打饮水，连用7天) 和不用药对照组。

5.疗效观察

开始用药后的第10天即停药后的第3天，观察鸡只的呼吸、采食、饮水、粪便、精神状态，记录死亡数和存活鸡只数，计算死亡率和存活率，并进行统计学处理。

6.试验结果与分析

开始用药后的第10天，NIC治疗组、小苏打对照组与不用药对照组的死亡率与存活率结果见表4。卡方检验表明，NIC治疗组的死亡率极显著低于小苏打对照组及不用药对照组(P<0.001)，小苏打组的死亡率极显著低于不用药对照组(P<0.001)；同样地，NIC治疗组的存活率显著高于小苏打对照组及不用药对照组(P<0.001)，小苏打组的存活率显著高于不用药对照组(P<0.001)，说明氯硝柳胺蛋用雏鸡的肾型传染性支气管炎有较好疗效。

小苏打饮水被公认为治疗肾型传支的有效方法，本试验证明，0.1％小苏打饮水，连用7天，可降低病鸡的死亡率、提高存活率，但仍有约21％的死亡率，因此并非是理想的治疗方法。NIC治疗不仅存活率显著高于不用药对照，也显著高于小苏打饮水对照，表明对肾型传支有很好的效果，有良好的应用潜力。

表4.NIC对蛋用雏鸡1B的疗效

注：NIC：氯硝柳胺；**：与不用药对照组差异极显著(P<0.001)，

6.结论

NIC但肾型传支有肯定的治疗效果，其用法为：按每公斤饲料拌NIC700 毫克，连用7天。

具体案例3

河南省确山县某蛋鸡养殖场1万只产蛋鸡，2020年10月开始出现发生以呼吸障碍为主要特征的呼吸道传染病，发病鸡主要表现为咳嗽，呼吸困难，气管有呼噜音，打喷嚏，病鸡精神沉郁，食欲下降，产蛋率下降，产软壳蛋和畸形蛋，发病1周左右死亡，已有273只鸡死亡。对病死鸡剖检可见主要病变部位在气管和支气管，气管和支气管有出血，有渗出液，蛋鸡卵泡充血、出血，鼻腔和鼻窦有浆液性渗出物。综合发病情况、临床症状和病理变化，该病例疑似鸡传染性支气管炎病毒感染。进一步确诊鸡传染性支气管炎病毒引起的鸡呼吸道型传染性支气管炎，用氯硝柳胺治疗取得了预期的结果。

1材料与方法

1.1病料样品的采集：

无菌采集病死鸡的气管、支气管等病变组织。

1.2鸡胚接种与病变观察：

将病料按1：3加入灭菌的生理盐水，研磨成组织匀浆，12000r/min离心5 min，上清液用0.45μm的滤器过滤除菌，接种11日龄SPF鸡胚10个，弃去接种后24h死亡的鸡胚，以后每天照鸡胚2次，死胚放置4℃保存，待鸡胚全部死亡后无菌收集尿囊液，-80℃保存备用。另观察死亡鸡胚的病变情况。

1.3分离毒株的RT-PCR检测：

参考有关文献对分离毒株进行一步法RT-PCR检测，RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳观察。

1.4分离毒株的序列分析：

将分离毒株的RT-PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，将测序获得的核苷酸序列与GenBank中登录的核苷酸序列进行比对分析。

1.5治疗：将食欲、饮欲废绝没有治疗价值的鸡扑杀并无害化处理。挑选有明显呼吸道症状鸡800只，单独隔离饲养，随机分为氯硝柳胺治疗组(400 只鸡按每公斤料600mg拌料拌，连用7天)，和不治疗对照组(400只鸡)。到用药结束第3天时，统计两组的死亡率和存活率。

2结果与分析

2.1鸡胚接种与病变观察结果：

病料样品接种的11日龄SPF鸡胚，在接种24～48h内鸡胚全部死亡，剖检死亡鸡胚可见胚体蜷缩、矮小，具有“侏儒胚”的典型症状。收集死亡鸡胚尿囊液作为分离毒株。

2.2分离毒株的PCR检测结果：

分离毒株的RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳可见459bp的特异性条带，大小与预期大小一致。

2.3分离毒株的序列分析结果：

分离毒株的RT-PCR扩增产物测序后，核苷酸序列比对分析表明，其为鸡传染性支气管炎病毒特异性核苷酸序列，证实分离毒株为鸡传染性支气管炎病毒。

2.4治疗结果：

氯硝柳胺治疗组，死亡23只，死亡率5.75％，仅有极少数鸡仍有呼吸道症状，绝大部分患病鸡恢复健康，产蛋率逐步上升，存活率为94.25％(表5)；不用药对照组死亡112只，死亡率28％，约有12％的鸡只仍有呼吸道症状，存活率为72％。统计分析表明：氯硝柳胺治疗组的存活率极显著高于不用药对照组(P＜0.05)。

表5.NIC对呼吸道型传支的疗效

3.结论

氯硝柳胺(每公斤料600mg拌料拌，连用7天)对呼吸道型传染性支气管炎也有较好疗效。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围。