一种基于LC-MS的人血清中阿米卡星的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于LC‑MS的人血清中阿米卡星的检测方法包括以下步骤：获得待测样本，对待测生物样本进行检测；本发明所采用的阿米卡星检测方法正是基于LC‑MS的高灵敏度，高特异性的检测方法；方法所需时间短，仅需3min，对于大样本量的实验，极大的节约了时间。

说明书

技术领域

本发明属于床血药浓度监测控制技术领域，具体涉及一种基于LC-MS的人血清中阿米卡星的检测方法。

背景技术

阿米卡星作为一种临床上广泛使用的氨基糖苷类抗生素，现已存在很多检测方法：分光光度计法，荧光法，液相串联紫外检测器法，流动注射化学发光法，以及液相色谱串联质谱方法等对阿米卡星的血药浓度进行监测。液相色谱串联质谱方法对液相分离后，再对特征的子离子和母离子进行筛选后定量分析。其相对传统方法而言灵敏度高，特异性好，越来越广泛的被临床采用。

但目前液相色谱串联质谱方法还存在以下缺陷：第一，样本检测时间长，尤其对于大批量样本来说，累计效果会大大增加了检测时间；第二，阿米卡星是一类水溶性抗生素，很多方法采用正向相柱来检测阿米卡星样本。对于抗生素项目95％以上的药物都需要使用反相色谱柱，在项目的转换时，要消耗大量时间去更换并且平衡柱子；第三，一些加HFBA的方法，虽然可以降低其水溶性，使用反相色谱但对于联合用药患者，很有可能会对样本其他物质产生影响。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于LC-MS的人血清中阿米卡星的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种基于LC-MS的人血清中阿米卡星的检测方法：包括以下步骤：

S1，标准品溶液的制备：用空白基质稀释10mg/mL的阿米卡星溶液得到标准品储备液W1；将标准品储备液W1用空白基质进行逐级稀释分别得到标准品溶液W2-W8；其中，W2由700μL的W1和300μL的空白基质混合得到；W3由400μL的W1和600μL的空白基质混合得到；W4由200μL的W1和800μL的空白基质混合得到；W5由100μL的W1和900μL的空白基质混合得到；W6由160μL的W1和1840μL的空白基质混合得到；W7由500μL的W6和500μL的空白基质混合得到；W8由250μL的W6和750μL的空白基质混合得到；W9由150μL的W6和1050μL的空白基质混合得到；

S2，质控品的制备：利用空白基质依次稀释标准品储备液W1，分别得到低质控品(LQC)、中质控品(MQC)和高质控品(HQC)；

S3，样本处理：精密量取生物样本50μL置于洁净的EP管中，加入200μL的甲醇，充分混匀，4℃的条件下以12000rpm的转速离心5min，吸取上清液150μL置于洁净96孔板内即可得到待测生物样本；

S4，样品检测：吸取生物样本150μL置于洁净96孔板内，进行检测；其中，检测的色谱条件如下：

色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP柱，规格为100×2.1mm，2.6μm；

流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液；

采用梯度洗脱方式；

流速：0.5mL/min；柱温：40℃；

进样量：10μL；

优选地，步骤S1中空白基质为空白人血清基质；

优选地，步骤S1中所述标准品溶液W1-W9的各个浓度如下表：

优选地，步骤S2中所述质控品的制备过程以及得到的质控品浓度如下表：

优选的地，步骤S3中所述梯度洗脱的洗脱梯度如下：流动相A的体积分数+流动相B的体积分数＝100％，在0-0.3min时，流动相A的体积分数维持在5％-15％％；在0.3-1.5min时，流动相A的体积分数升到60％-80％；在1.5-2min时，流动相A的体积分数降到2％，并维持在2％直至3min停止；

优选地，所述步骤S3中生物样本为人血清或者人血浆。

优选地，所述步骤S4中质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度(TEM)：450℃；离子源雾化气(GS1)：50psi；离子源加热辅助气(GS2)：55psi；气帘气(CμR)：35psi；碰撞气(CAD)：8psi；扫描模式：MRM，化合物MRM参数如下表：

一种用于基于LC-MS的人血清中阿米卡星的检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括阿米卡星标准品、流动相A和流动相B；其中，流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所采用的阿米卡星检测方法正是基于LC-MS/MS的高灵敏度，高特异性的检测方法；方法所需时间短，仅需3min，对于大样本量的实验，极大的节约了时间；本发明所采用的色谱柱类型与其他化合物兼容类型强，采用反相色谱，与其他抗生素的柱子类型相符，不需要更换与平衡色谱柱，节约了时间；本发明的样本前处理简单，并且没有加入其他物质改变物质极性，仅通过调整液相反向色谱柱正向使用的方法进行样本检测。

附图说明

图1示出了实施例1阿米卡星标准品的MRM谱图；

图2示出了实施例1阿米卡星的标准曲线图。

图3对比例1的MRM谱图；

图4对比例2的MRM谱图；

图5对比例3的MRM谱图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实验仪器

Sciex4500

实施例1

一种基于LC-MS的人血清中阿米卡星的检测方法：

色谱条件如下：

色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP柱，规格为100×2.1mm，2.6μm；

流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度见表1；

表1，洗脱梯度

流速：0.5mL/min；柱温：40℃；

进样量：10μL；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度(TEM)：450℃；离子源雾化气(GS1)：50psi；离子源加热辅助气(GS2)：55psi；气帘气(CμR)：35psi；碰撞气(CAD)：8psi；扫描模式：MRM，化合物MRM参数如下表2：

表2，化合物MRM参数

标准品储备液W1的制备：向3.98mL的空白血清中加入20μL 10mg/mL的阿米卡星溶液，得到标准品储备液W1；

将标准品储备液W1用空白基质进行逐级稀释分别得到标准品溶液W2-W8，稀释过程与标准品溶液浓度见表3；

表3

质控品的制备：空白基质依次稀释W1，得到低质控品2.5μg/mL、中质控品10μg/mL和高质控品40μg/mL三个，配制过程见表4；

表4

阿米卡星的参考范围见表5

表5

样本处理：采用1.5mL的EP管来进行样品的制备；精密量取标准曲线样品，质控样品，人血清或者人血浆50μL置于洁净离心管中；加入200μL的甲醇，充分混匀3min，4℃条件12000rpm离心5min；吸取上清液150μL置洁净96孔板内即可进样，进行检测。

采用外标定量法，以标准品溶液的浓度为X轴，以标准品溶液的峰面积为Y轴，建立外标标准曲线见图2，标准曲线为y＝4.05527×10

待测样品1检测得到的样品浓度为20μg/mL。

组内精密度：组内精密度从一次测定高和低不同浓度的QC，每个浓度的样本数量要求不小于5个过程中获得。每一个水平的浓度QC样品的CV≤15％。

组间准确度：通过分析至少三天三个高和低两个浓度QC样品来得到。每一个水平的浓度QC样品的CV≤15％。

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，对比例1的洗脱梯度如下：

对标准品的检测结果见图3.

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的洗脱梯度如下：

对标准品的检测结果见图4。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于，对比例3的洗脱梯度如下：

对标准品的检测结果见图5.

从图3-4可知，当改变洗脱梯度后，会明显有杂质峰影响判断。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。