肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒及其使用方法

摘要

本发明公开了肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒及其使用方法，涉及蛋白质检测技术领域。本发明包括由十四炔酸与二甲基亚砜分装‑20℃冻存作为探针的第一溶液、采用裂解液的第二溶液、采用标记缓冲液的第三溶液、采用10mM的叠氮重氮生物素的第四溶液、采用50mM硫酸铜与0.08g至10ml的水构成的第五溶液、采用50mM的三(2‑羧乙基)膦与2.8665g‑10ml的水构成的第六溶液、采用封闭液的第七溶液。本发明肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒相对于普通方法能够富集到更多的肽段，且能够分析得到更多肉豆蔻酰修饰蛋白，能够获得明细程度及效果更优于常规方法的明细程度及效果，提高了灵敏度。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，特别是涉及肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒以及肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的使用方法。

背景技术

肉豆蔻酰化属于较大分子量的蛋白翻译后修饰类型，在NMT的催化下，蛋白N端的甘氨酸与肉豆蔻酸发生不可逆反应，形成结合。NMT与一组特定靶蛋白N端氨基酸残基结合，此处残基已经被鉴定为一种典型的基序，尽管存在某些氨基酸变异，也可能会阻止或促使其他部分发生该修饰。NMT的另外一个底物是肉豆蔻酰辅酶a硫酯，由细胞内的酰基辅酶a合成酶生产。在真核生物中，豆蔻酸盐是通过共翻译引入的，当蛋白水解消化后产生一个新的N端甘氨酸，脂化促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以及与转运和信号转到相关的膜蛋白之间的相互关联。

采用酶标记和生物化学反应标记，在体内和体外进行化学反应最大的挑战是化学反应的多样性，与目前所了解的生命系统中发生正交生物反应的官能团少之又少，这是阻碍此领域研究的发生的一个障碍，生命系统中发现的可发生反应的官能团也大都在反应体系中比较稳定。蛋白酰基化包括氘标记的肉豆蔻酸在内，均可通过SDS-PAGE分离蛋白质后进行放射自显影，然而为了安全和成本考虑，放射自显影可能需要数小时甚至更长的时间，相比较之下，凝胶内荧光成像只需要几秒钟，而且成本很低。荧光蛋白可以通过遗传方法被整合到感兴趣的蛋白中，但是这些蛋白质体积通常较大(通常＞10Kda)，这意味这可能会干扰蛋白质的功能。

此方法的实现必须能够对感兴趣蛋白进行标记，并且此蛋白必须是NMT的底物。所研究蛋白都是已知能够发生肉豆蔻酰化并且在蛋白N端有可发生肉豆蔻酰修饰的序列(MGXXXS/T(K))。那么对于一些N端参与部分下游生物学功能的蛋白质，此方法也是不能兼容的。现有相关技术不同的标记探针，只能适用一种检测手段，缺点是兼容性不足，可以解决的问题就是适配不同的方法进行检测。

发明内容

本发明提供了肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒及其使用方法，解决了以上问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒，包括：

第一溶液：为探针，由0.05M的十四炔酸与0.11g至10ml的二甲基亚砜分装-20℃冻存；

第二溶液：为裂解液，另需试剂0.1M的苯甲基磺酰氟以及BCA蛋白浓度测定试剂盒；

第三溶液：为标记缓冲液；

第四溶液：为10mM的叠氮重氮生物素；

第五溶液：为50mM硫酸铜与0.08g至10ml的水构成；

第六溶液：为50mM的三(2-羧乙基)膦与2.8665g-10ml的水构成；

第七溶液：为封闭液，由2mM的叔丁基三氯乙酰亚胺酯与0.01g-10ml的二甲基亚砜构成，分装-20℃冻存；

第八溶液：为0.5M乙二胺四乙酸以及1.68g-10ml水构成。

肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S01、细胞共培养标记蛋白：将12ul的第一溶液加入50ul 0.01M的氢氧化钠混合加热70℃，5分钟充分溶解，与12ml培养基混合，0.22um滤膜过滤后培养细胞4小时，阴性对照用二甲基亚砜代替；药物处理16小时，收集细胞到1.5ml离心管中，用冷磷酸盐缓冲液清洗两次；

S02、提取蛋白：细胞离心管中，加入500ul的第二溶液，10ul 0.1M的苯甲基磺酰氟，300瓦功率下超声，超声5秒且停5秒，持续两分钟，12000g离心上清；使用BCA法测定蛋白浓度，根据实验需要取适量蛋白进行IP处理；

S03、CM沉淀：IP后的蛋白取100ug用第二溶液补足体积至200ul，加入600ul甲醇，150ul氯仿，400ul二次蒸馏水，震荡混匀，13000rpm离心5分钟，取沉淀加入450ul甲醇，13000rpm离心5分钟，去除上清，风干2-3分钟，加入90ul的第三溶液，溶解；

S04、GUAAC click：加入1ul第四溶液、2ul第五溶液、2ul第六溶液以及5ul第七溶液，室温翻转1小时，加入2ul第八溶液涡旋混匀；

S05、CM沉淀：加入100ul第三溶液混匀，加入600ul甲醇、15-ul氯仿、400ul二次蒸馏水，震荡混匀，13000rpm离心5分钟，取沉淀加入450ul甲醇，13000rpm离心5分钟，去除上清，风干2-3分钟；加入50ul 1×蛋白加载缓冲区，煮沸5分钟，用于WEB检测。

进一步地，所述WEB检测具体包括如下步骤：

P01、将样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离，并将蛋白转到聚偏氟乙烯膜上；

P02、用1×TBS清洗膜两次，每次10分钟；

P03、用1×TBS-T配置工作浓度3％牛血清白蛋白，室温封闭聚偏氟乙烯膜1小时；

P04、用1×BS-T清洗聚偏氟乙烯膜10分钟；

P05、用1×BS-T配置工作浓度为3％的牛血清白蛋白，加入Streptavidin-HRP抗体，稀释比例1:5000-1：10000，于4℃下孵膜过夜；

P06、用1×TBS-T清洗聚偏氟乙烯膜3次，每次十分钟；

P07、用化学发光仪曝光检测。

本发明相对于现有技术包括有以下有益效果：

本技术方案的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒相对于普通方法能够富集到更多的肽段，且能够分析得到更多棕榈酰化修饰蛋白，能够获得明细程度及效果更优于常规方法的明细程度及效果，提高了灵敏度。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒与未使用本技术方案的试剂盒于质谱仪下基于一种序列下显示的质谱图；

图2为将本试剂盒处理后与常规方法处理后送至MS检测中心加测后的比对图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒及其使用方法，包括：

第一溶液：为探针，由0.05M的十四炔酸与0.11g至10ml的二甲基亚砜(DMSO)分装-20℃冻存；其中，十四炔酸的分子量为224.34；

第二溶液：为裂解液，另需试剂0.1M的苯甲基磺酰氟(M PMSF)以及BCA蛋白浓度测定试剂盒；

第三溶液：为标记缓冲液，具体为click缓冲液，700ul；

第四溶液：为10mM的叠氮重氮生物素(Azido-diazo-Biotin)，分子量为711.83；

第五溶液：为50mM硫酸铜(CuSO

第六溶液：为50mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)与2.8665g-10ml的水构成；取1ul 1M三(2-羧乙基)膦加入19ul水；

第七溶液：为封闭液，由2mM的叔丁基三氯乙酰亚胺酯(TBTA)与0.01g-10ml的二甲基亚砜(DMSO)构成，分装-20℃冻存；

第八溶液：为0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)以及1.68g-10ml水构成。

如下表1所示，为本发明具体实施例的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的1个样品及2个样品对应的名称及用量表；

表1：本发明肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的1个样品及2个样品对应的名称及用量表；

肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒的使用方法，该方法除了使用到上述肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒对应的溶液外，还另需其它试剂，包括0.01M的氢氧化钠(NaOH)，二甲基亚砜(DMSO)，0.1M苯甲基磺酰氟(M PMSF)，BCA蛋白浓度测定试剂盒，甲醇，氯仿，包括如下步骤：

S01、细胞共培养标记蛋白：将12ul的第一溶液加入50ul 0.01M的氢氧化钠混合加热70℃，5分钟充分溶解，与12ml培养基混合，0.22um滤膜过滤后培养细胞4小时，阴性对照用二甲基亚砜代替；药物处理16小时，收集细胞到1.5ml离心管中，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次；

S02、提取蛋白：细胞离心管中，加入500ul的第二溶液，10ul 0.1M的苯甲基磺酰氟，300瓦功率下超声，超声5秒且停5秒，持续两分钟，12000g离心上清；使用BCA法测定蛋白浓度，根据实验需要取适量蛋白进行IP处理；(注：此时蛋白溶液中含有8％SDS，如与IP试剂不兼容，可用IP适用缓冲液稀释。)

S03、CM沉淀：IP后的蛋白取100ug用第二溶液补足体积至200ul，加入600ul甲醇，150ul氯仿，400ul二次蒸馏水，震荡混匀，13000rpm离心5分钟，取沉淀加入450ul甲醇，13000rpm离心5分钟，去除上清，风干2-3分钟，加入90ul的第三溶液，溶解；

S04、GUAAC click：加入1ul第四溶液、2ul第五溶液、2ul第六溶液以及5ul第七溶液，室温翻转1小时，加入2ul第八溶液涡旋混匀；

S05、CM沉淀：加入100ul第三溶液混匀，加入600ul甲醇、15-ul氯仿、400ul二次蒸馏水，震荡混匀，13000rpm离心5分钟，取沉淀加入450ul甲醇，13000rpm离心5分钟，去除上清，风干2-3分钟；加入50ul 1×蛋白加载缓冲区，煮沸5分钟，用于WEB检测。

其中，上述WEB检测的具体包括如下步骤：

P01、将样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离，并将蛋白转到聚偏氟乙烯膜上；

P02、用1×TBS清洗膜两次，每次10分钟；

P03、用1×TBS-T配置工作浓度3％牛血清白蛋白，室温封闭聚偏氟乙烯膜1小时；

P04、用1×BS-T清洗聚偏氟乙烯膜10分钟；

P05、用1×BS-T配置工作浓度为3％的牛血清白蛋白，加入Streptavidin-HRP抗体，稀释比例1:5000-1：10000，于4℃下孵膜过夜；

P06、用1×TBS-T清洗聚偏氟乙烯膜3次，每次十分钟；

P07、用化学发光仪曝光检测

如图1所示，将没有用本试剂盒及常规的方法一并于质谱仪上基于一序列下进行质谱获得质谱图片，该图具体表现的内容是：

顺序：NVQFGLAYQEGR，N1脱酰胺(0.98402Da)，Q3脱酰胺(0.98402Da)，G5-肉豆蔻酰650(650.39000Da)，Q9脱酰胺(0.98402Da)

(Sequence:NVQFGLAYQEGR,N1-Deamidated(0.98402Da),Q3-Deamidated(0.98402Da),G5-Myristoyl650(650.39000Da),Q9-Deamidated(0.98402Da))

由图中，可知，基于鉴定质量上，用试剂盒富集的肽段，质谱图片段丰富，鉴定准确。

对于鉴定数量，对获取对应的数量，获得对应分析到的棕榈酰化修饰蛋白整理成表，对应的下面的表2为用了试剂盒的样品分析到3个肉豆蔻酰化肽段数量表；

表2：使用了本试剂盒的样品分析得到的棕榈酰化修饰蛋白数量表；

如图2所示，是将本试剂盒处理后与常规方法处理后送至MS检测中心加测后的比对图片，并由MS检测中心提供的免疫印迹法的检测结果照片；

由该图中可知，使用本技术方案试剂盒进行检测，所获得的明细程度及效果远高于常规方法的检测明细程度及效果。

本技术方案的肉豆蔻酰化IP富集点击化学试剂盒相对于普通方法能够富集到更多的肽段，且能够分析得到更多肉蔻酰化修饰蛋白，能够获得明细程度及效果更优于常规方法的明细程度及效果，提高了灵敏度。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。