一种靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移小分子多肽及应用

摘要

本发明公开了一种靶向Smad4/PELO相互作用的抑制前列腺癌细胞转移的小分子多肽，该靶向Smad4/PELO相互作用的抑制前列腺癌细胞转移的小分子多肽的氨基酸序列为：FCDYMFQQA。其能特异性地阻断Smad4与PELO的相互作用，抑制前列腺癌细胞的迁移及侵袭能力，小鼠实验也证实了该靶向Smad4/PELO相互作用的抑制前列腺癌细胞转移的小分子多肽可抑制前列腺癌细胞在体内的肺转移和肝转移，并提高裸鼠的生存率，达到抵抗肿瘤转移的效果，因此，可将其用于制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂，用于诊断或治疗前列腺癌。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及一种靶向Smad4/PELO相互作用的抗肿瘤转移小分子多肽及应用。

背景技术

TGF-β信号通路的失调涉及到许多肿瘤类型的发生，进展和治疗的抗性。Smad4是TGF-β信号通路的关键节点分子，介导了肿瘤细胞的增殖，分化及凋亡等生物学过程。TGF-β信号通路具有双重作用，在肿瘤生长的早期发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，当进展到后期则促进肿瘤细胞的转移。目前，许多研究通过靶向Smad4试图解开TGF-β复杂信号传导机制及其在前列腺癌发生发展中的肿瘤抑制和肿瘤促进作用的双重作用。

目前，已有小分子抑制剂通过阻断TGF-β信号达到治疗相关肿瘤的效果，如LY215799、LY364947、LY580276等，但目前上市的小分子药物主要针对胞内段，存在毒性大，靶点过多等缺点，而蛋白药物可以通过阻断TGF-β信号达到抑制受体信号的作用，通过中和TGF-β配体达到治疗肿瘤疾病的效果，具有良好的生物相容性，如2G7(中和抗体)、GC 1008等抗体。但是，蛋白类药物的缺点是分子量较大，注射到人体内一般会有免疫原性。由于多肽类药物分子量小，在人体内不结存，免疫原性小且活性好，因此成为目前研究的热点。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移小分子多肽。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移的小分子多肽，其特征在于，氨基酸序列为：FCDYMFQQA。

根据申请人的试验表明，该靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移的小分子多肽，能够特异性地阻断Smad4与PELO的相互作用，抑制前列腺癌细胞的迁移及侵袭能力，小鼠实验也证实了该小分子多肽可抑制前列腺癌细胞在体内的肺转移和肝转移，并提高裸鼠的生存率，达到抵抗肿瘤转移的效果，因此，可将其用于制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂，用于诊断或治疗前列腺癌。

附图说明

图1是小分子多肽对Smad4/PELO相互作用亲和力影响的结果图。其中：图A为抑制PC3细胞中Smad4/PELO的相互作用；图B为抑制Du145细胞中Smad4与PELO的相互作用。

图2是本发明的靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移的小分子多肽对PC3和Du145细胞增殖的结果图。

图3是小分子多肽抑制PC3细胞迁移和侵袭的效果图；其中：图A、B为对PC3细胞株的迁移抑制效果图；图C、D为对PC3细胞株的侵袭抑制效果图。

图4是小分子多肽抑制Du145细胞迁移和侵袭的效果图；图A,B为对Du145细胞株的迁移抑制效果图，图C、D为对Du145细胞株的侵袭抑制效果图。

图5是小分子多肽抑制PC3细胞在小鼠体内的肺转移和肝转移实验结果图。

图6是小分子多肽提高裸鼠生存率的结果图。

图7是小分子多肽抑制PC3细胞在裸鼠肺脏和肝脏转移的病理效果图。以下结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明。

具体实施方式

需要说明的是，在以下的实施例中，所述的实验方法，如无特殊说明，均按照常规实验方法进行。

所使用的实验材料、试剂等如无特殊说明，均为商业途径获取。

首先，申请人在基于前期的IP-MS实验中，在前列腺癌细胞系PC3中筛选到Smad4的相互作用蛋白PELO，针对两者的相互作用位点，设计了一个小肽。通过IP实验检测到该小肽可明显阻断Smad4/PELO的相互作用。

其次，利用XTT法对前列腺癌细胞系进行检测，发现小肽对前列腺癌细胞没有明显抑制细胞增殖的效果。

随后，利用Transwell方法检测了小肽可显著抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

最后，进行了动物实验，通过对移植有PC3肿瘤细胞的裸鼠进行治疗，观察到该小分子多肽能够显著抑制前列腺癌细胞在裸鼠体内的肺转移和肝转移，进而提高裸鼠的生存率。证明了所设计的小分子多肽是一种靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移的小分子多肽。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1：小分子多肽的设计

申请人基于前期的IP-MS实验，利用Smad4的特异抗体在前列腺癌细胞PC3中进行免疫共沉淀实验，筛选到一系列Smad4的相互作用蛋白，其中包括核糖体挽救因子PELO，通过免疫共沉淀及GST-pull down的方法证实了Smad4和PELO确实存在直接的相互作用。并进一步确定了两者的相互作用结构域，针对两者的相互作用位点，设计了一个小肽，并将该小肽用于进一步的功能实验研究。

设计的小肽序列为：FCDYMFQQA。

实施例2：小分子多肽可阻断Smad4和PELO的相互作用。

(1)实验方法

利用Smad4的特异抗体分别在PC3和Du145细胞中进行了免疫共沉淀实验，相应种属的IgG作为阴性对照。随后再分别利用Smad4和PELO抗体进行Western blot检测。

(2)实验结果

结果如图1所示：小分子多肽在前列腺癌细胞系PC3和Du145中可明显阻断Smad4和PELO的相互作用。

实施例3：小分子多肽的细胞水平功能实验

(1)选择实验细胞株

首先在PC3和Du145细胞中进行XTT法筛选所合成的小分子多肽对肿瘤细胞的增殖是否具有抑制作用。

(2)实验方法

A、在添加10％(v/v)胎牛血清的1640培养基中培养PC3和Du145细胞至对数生长期，消化收集细胞，均匀铺在96孔板中，细胞密度为2000/孔，贴壁后加入多肽处理细胞，每个浓度梯度设置5个复孔；其中，多肽的终浓度为20μM，以不添加多肽为对照。

B、分别培养细胞3d和6d后，向每孔培养基中各加入10μl XTT试剂，37℃培养箱内孵育1-2h，在酶标仪下测量450nm波长的吸光度。

(3)实验结果

结果如图2所示：细胞增殖实验结果表明，小分子多肽对于PC3和Du145细胞的增殖没有明显的抑制作用。

实施例4：小分子多肽抑制前列腺癌细胞迁移的检测

(1)选择实验细胞株

选细胞株为人前列腺癌细胞Du145和PC3，以上两株细胞均购自ATCC。

(2)实验方法

胰蛋白酶消化细胞株，利用无血清培养基重悬细胞制备细胞悬液，细胞计数制成细胞密度为5×10

(3)实验结果

实验结果如图3-4所示：小分子多肽可明显抑制Du145和PC3细胞的迁移能力。

实施例5：小分子多肽抑制前列腺癌细胞侵袭的检测

(1)选择实验细胞株

选细胞株为人前列腺癌细胞Du145和PC3，以上两株细胞均购自ATCC。

(2)实验方法同上。

(3)实验结果

实验结果如图3-4所示：小分子多肽可显著抑制Du145和PC3细胞的侵袭能力。

实施例6：小分子多肽抑制肿瘤转移作用的体内动物实验

购买NSG裸鼠15只(6周龄，雄性)，SPF级条件饲养，恒定温度(22～24℃)，恒定湿度(50％～70％)，饲养笼、垫料、饲料和水均经高压蒸汽灭菌。

用1ml注射器通过小鼠尾静脉注射PC3细胞悬液200μL(约1×10

将裸鼠随机分为2组，①阴性对照组：PBS缓冲液0.2ml；n＝7②多肽组：10mg/kg；n＝8，进行给药处理：每三天进行一次尾静脉注射给药，连续给药7次；50天处死小鼠，观察肺转移和肝转移情况，并取小鼠的肺脏和肝脏做HE染色。

从30天开始，注射PBS缓冲液的阴性对照组小鼠开始死亡，记录小鼠死亡时间和数量。

结果如图5-7所示：根据统计结果，给药后小分子多肽能够显著抑制移前列腺癌细胞的肝转移和肺转移，并且能明显提高小鼠的生存率。

通过上述实施例1-6，证明了所设计的小分子多肽是一种靶向Smad4/PELO相互作用的抵抗肿瘤转移的小分子多肽，可将其用于制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂，用于诊断或治疗前列腺癌。

所制备的抗肿瘤药物中的小分子多肽的有效浓度为20μM。

当然，所制备的抗肿瘤药物中还含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体；所述的载体为药学上常用的缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。其剂型为针剂或粉针剂。

上述实施例为本发明较佳的例子，本发明不限于以上的实施例，本领域普通技术人员应当理解，在本发明的技术方案的实质与原理下所作的任何修饰、替代以及组合、均应视为本发明的保护范围。