一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，该方法包含：(1)肉质花梗外植体的选取；(2)外植体的灭菌：将所述肉质花梗清洗并灭菌；(3)外植体的预培养；(4)外植体的浸染；(5)外植体与菌液共培养；(6)外植体延迟培养：(7)外植体筛选培养；(8)抗性芽的生根培养；(9)再生植株的阳性检测：通过PCR和GUS染色双重检测均为阳性的植株，为西兰花遗传转化阳性苗。本发明的方法，肉质花梗能在较短时间内再生出芽，遗传转化植株阳性率为22～25％，转化所需时间短，转化结果稳定，试验可重复性高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种西兰花高效遗传转化方法，具体涉及一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法。

背景技术

西兰花(Brassica oleracea L.var.italica)是十字花科芸薹属甘蓝种中以由花蕾、花梗、肉质花梗和部分茎组成的花球为食用产品的一个变种，因其营养丰富且富含萝卜硫素而深受人们的青睐。随着全球变暖，反常天气越来越影响西兰花田间生产。研究培育抗病虫害、耐高温或严寒、耐旱等西兰花品种对农业安全生产极为重要。以农杆菌介导的遗传转化技术是外源优异基因的快速转入和靶标内源基因定点突变的重要手段，也是基因功能验证中极为重要的一个环节。因此，建立西兰花高效的遗传转化方法，对西兰花分子育种及基因功能研究都具有重要意义。

目前，西兰花遗传转化成功的报道较少，并且都存在转化效率较低，实验可重复性较差等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，解决了西兰花遗传转化的问题，肉质花梗能在较短的时间内再生出芽，遗传转化植株阳性率为22～25％，转化所需时间短，转化结果稳定，试验可重复性高。

为了达到上述目的，本发明提供了一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，该方法包含：

(1)肉质花梗外植体的选取：将成熟西兰花的花球去除上部花蕾，选取横径在0.3～1.8cm的肉质花梗作为外植体；对于外植体，若外植体横径小于 0.3cm，外植体太嫩，对农杆菌的耐受能力弱，并且切口与浸染液的接触面积太小，显著降低遗传转化阳性率；而外植体横径大于1.8cm，切口面积太大，培养过程中会产生大量的醌类物质，使切口褐化加速，显著降低芽再生效率。因此，横径在0.3～1.8cm的花梗外植体，具有较高的芽再生能力，同时对农杆菌的耐受能力较强(而且农杆菌浸染20～30min时，外植体褐化程度很低)，最适合于农杆菌介导的遗传转化；

(2)外植体的灭菌：将所述肉质花梗清洗并灭菌；

(3)外植体的预培养：将灭菌后的肉质花梗吸干表面水分，并切除肉质花梗两端的伤口，并将外植体切成长度为0.5～1.5cm的小段，25℃下在外植体预培养基中预培养3～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体预培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6-BA、0.01～0.05mg/L NAA、0.4～0.5mg/LTrans-ZT，pH为5.6～6.0；

(4)外植体的浸染：将预培养的外植体置于外植体浸染液中进行浸染；其中，所述外植体浸染液的配制，包含：将构建有目的基因载体pCambia1301 的农杆菌菌株GV3101于28℃震荡培养过夜至菌液OD

(5)外植体与菌液共培养：将经过浸染的外植体表面的液体吸干，将外植体共培养基表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体放置在滤纸上，在黑暗条件下共培养3d；其中，所述外植体共培养基包含：MS培养基、30 g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6-BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT，pH为5.6～6.0；共培养的培养基表层要平铺无菌滤纸，可以有效降低外植体的污染率，共培养阶段是农杆菌侵染外植体切口细胞的重要阶段，菌在干燥环境下的活力会大大降低甚至死亡，高湿度有利于保持农杆菌的活性，提高侵染阳性率，所以共培养基中琼脂的浓度要比其他类型培养基小，这样培养基中的含水量较大；本发明能够在较长的时间(3d)进行农杆菌侵染，但又不会对外植体损伤，能够提高再生植株的阳性率；

(6)外植体延迟培养：将经过共培养的外植体，转移至外植体延迟培养基中，在25℃延迟培养5～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体延迟培养基包含：MS培养基、蔗糖30g/L、9g/L琼脂、1.5～2.0mg/L 6-BA、0.01～0.05mg/LNAA、0.4～0.5mg/LTrans-ZT、300mg/L特美汀，pH为5.6～6.0；

(7)外植体筛选培养：将经过延迟培养的外植体转移至外植体筛选培养基中，在25℃进行筛选培养，光照时间为16h/d，每隔10～15d将外植体转移至新的外植体筛选培养基上，直至长出抗性芽；其中，所述外植体筛选培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、1.5～2mg/L 6-BA、0.01～0.05 mg/LNAA、300mg/L特美汀和5～50mg/L潮霉素，pH为5.6～6.0；

(8)抗性芽的生根培养：将再生的抗性芽从生长点下部切下，转移至芽生根培养基中，培养至长出根；其中，所述芽生根培养基包含：MS培养基、 0.05～0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、300mg/L特美汀和5mg/L潮霉素，pH为5.6～6.0；

(9)再生植株的阳性检测：通过PCR和GUS染色双重检测均为阳性的植株，为西兰花遗传转化阳性苗；其中，所述PCR，以生根后抗性苗叶片的基因组DNA为模板，采用的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，PCR产物的条带在658bp处，则结果为阳性；所述GUS染色，叶片白色背景上有蓝色小点或蓝色为阳性。

优选地，所述西兰花选择植株和花球生长健康的西兰花。

优选地，所述肉质花梗灭菌采用2～4％次氯酸钠溶液。

优选地，所述肉质花梗灭菌：将肉质花梗切成5cm以内的小段采用2～4％次氯酸钠溶液灭菌，并采用无菌水清洗。

优选地，所述肉质花梗灭菌时间为10～15min。

优选地，所述外植体的浸染，浸染的时间为10～30min。

优选地，所述PCR反应体系为：模板、2×PCRmix、上游引物、下游引物和水。

优选地，所述PCR反应程序为：94℃，3min；94℃30s，55℃15s，72℃ 15s，30个循环；72℃延伸7min，16℃保持。

优选地，所述GUS染色，为：取PCR检测阳性植株的叶片，加入GUS 染色工作液使其完全浸没叶片，置于抽真空罐中抽真空5min，然后于30℃保温2h；将叶片转入70％乙醇中脱色3～4次，至阴性对照呈白色，所述阴性对照为PCR检测不含658bp条带的植株的叶片；肉眼观察叶片白色背景上有蓝色小点为阳性植株。

本发明的以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法，解决了西兰花遗传转化的问题，具有以下优点：

本发明首次建立了以西兰花肉质花梗为外植体的高效遗传转化体系，结合PCR检测和GUS染色结果，遗传转化植株阳性率约为22～25％(优于已经报道的西兰花遗传转化所需时间及转化效率)。本发明可以实现2～3个月内再生出转基因阳性苗，转化所需时间短，转化结果稳定，试验可重复性高，对西兰花分子育种及基因功能研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的方法获得的西兰花肉质花梗再生芽的照片。

图2为本发明的方法检测获得的再生抗性苗(A)和非抗性苗(B)的结果。

图3为本发明的方法对西兰花肉质花梗再生抗性植株目标基因的PCR检测(A)和GUS染色(B)检测结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.培养基的配制

包括遗传转化各阶段的培养基，其组分详见下面的配方。注：基本培养基(MS+蔗糖+琼脂)配置后均需要121℃高压灭菌20min，各类激素、特美汀和潮霉素在基本培养基高温灭菌后冷却至60℃左右再加入。

(1)外植体预培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.01mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L(反-玉米素，CAS号：1637-39-4，购自麦克林)，pH 5.8；

(2)外植体共培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.01mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L，pH 5.8；

(3)外植体延迟培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.01mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L+特美汀300mg/L，pH 5.8；

(4)外植体筛选培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.01mg/L+特美汀300mg/L+潮霉素50mg/L，pH 5.8；

(5)芽生根培养基：MS培养基+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8 g/L+特美汀300mg/L+潮霉素5mg/L，pH 5.8。

2.西兰花基因表达载体构建

(1)基因克隆

根据TO1000SOC1基因序列(SEQ ID NO.1)设计引物，引物序列如下：

SOC1-KpnI-F(SEQ ID NO.2)：

GCGGGTCGACGGTACCATGGTGAGGGGGAAAACTC；

SOC1-KpnI-R(SEQ ID NO.3)：

TAGACATATGGGTACCTCACTTTCTTGAAGAACAAGG。

从西兰花嫩芽中提取RNA，反转录成cDNA(采用Vazyme公司HiScript 1st StrandcDNA Synthesis Kit)，具体操作如下：

(1.1)RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下表1所示的混合液，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

表1为RNA模板变性的混合液成分

(1.2)第一链cDNA合成

将步骤(1.1)的混合液与2×RT Mix和HiScript II Enzyme Mix混合，具体如表2，用移液器轻轻吹打混匀，50℃反应45min，85℃反应5min。

表2为cDNA合成的混合液成分

(1.3)PCR扩增

以cDNA为模板，采用上述引物SOC1-KpnI-F和SOC1-KpnI-R进行PCR 扩增(采用Vazyme公司phanta max super-fidelity DNA Polymerase)。

PCR反应体系(总体积50μL)如下表3：

PCR反应程序为：95℃30s；(95℃15s，退火温度55℃15s，延伸72℃ 1min)×39循环；最后延伸72℃，5min。

将PCR产物进行凝胶电泳，结果显示扩增到单一条带(642bp)，大小正确。

(2)载体构建

用KpnI单酶切使载体pCambia1301(VT1842，购自优宝生物，其结构如图3所示)线性化(采用Thermo公司或Takara公司相应限制性内切酶产品)，酶切反应体系如下表4所示。

表4为酶切反应体系

将酶切产物纯化后与上述PCR产物进行重组反应(重组反应试剂盒为 Vazyme公司ClonExpress-II One Step Cloning Kit)，重组连接反应体系(总体积10μl)如下表5所示。

表5为重组连接反应体系

上述反应液使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，放置于37℃反应30min，随后立即置于冰上冷却。

(3)重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞

重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞的具体转化步骤，如下所示：

(3.1)在100μL大肠杆菌感受态细胞中加入10μL上述重组连接反应的产物；

(3.2)冰浴30min；

(3.3)42℃热激60～90s；

(3.4)冰浴2min；

(3.5)加入800μL LB液体培养基；

(3.6)37℃摇床培养30min；

(3.7)6000rpm离心3min，弃上清，涂布Kana(50mg/L)抗性培养基平板；

(3.8)37℃倒置培养12～16h后，挑取抗性菌落；

(3.9)在96孔板中，每孔加入100μL LB(含Kana)液体培养基；

(3.10)各平板取4～8个菌落，在37℃、180rpm扩大培养2h；

(3.11)取1μL菌液进行PCR阳性检测；

(3.12)挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时对扩增产物测序，扩增和测序的引物为插入目的基因两侧的载体序列，为：

35S-F(SEQ ID NO.4)：

5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’；

2301-F(SEQ ID NO.5)：

5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’。

(4)阳性质粒转化农杆菌感受态细胞(GV3101)

将PCR扩增产物测序后，含有目的基因的阳性质粒转化到农杆菌 GV3101感受态细胞中，具体转化步骤如下所示：

(4.1)冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞100μL；

(4.2)加入3μL带有目的片段的pCambia1301质粒DNA，冰上放置 30min，液氮中冷冻1min，然后37℃水浴3min；

(4.3)加入900μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm/min,振荡培养3h；

(4.4)10000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μLYEP回溶菌体；

(4.5)将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养12-16h。

(4.6)PCR鉴定阳性菌落，PCR引物同上，为：35S-F和2301-F。

(5)载体测序结果分析

将测序结果进行比对，结果显示：目的基因已插入载体，表达载体构建准确。

3.农杆菌介导的西兰花遗传转化再生植株的获得

(1)肉质花梗外植体的选取

选择植株和花球生长健康的西兰花作为供体植株，取直径10cm左右的花球，去除上部花蕾，选取横径在0.3～1.8cm的肉质花梗作为外植体。

(2)外植体的灭菌

将肉质花梗切成5cm以内的小段方便消毒清洗，先用纯净水清洗3次，然后将其放入2％次氯酸钠溶液中，在摇床轻微摇晃(60rpm)进行表面消毒 15min，再在超净台上用无菌水清洗4次后，备用。

(3)外植体的预培养

在超净台上，将灭菌后的肉质花梗置于无菌滤纸上，吸干表面水分，并切除肉质花梗两端的伤口。最后，将外植体切成长约0.5～1.5cm的小段，在外植体预培养基中预培养3d(25℃，光照16h/d)。

(4)外植体浸染液的配制

将构建有目的基因SOC1(SEQ ID NO.1)载体(pCambia1301)的农杆菌菌株GV3101于28℃震荡培养过夜至菌液OD

(5)外植体的浸染

用无菌长柄镊子，将预培养3d后、无污染的外植体轻放于步骤(4)制备的菌液中10min。

(6)外植体与菌液共培养

用无菌长柄镊子，将浸染后的外植体轻放于无菌滤纸上，吸干表面菌液。将外植体共培养基表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体竖直放置在滤纸上，黑暗条件下共培养3d。放置的无菌滤纸能够吸收外植体侵染后残留的农杆菌，降低外植体的污染率。

(7)外植体延迟培养

将上述共培养3d后的外植体，转移至外植体延迟培养基中，延迟培养7 d(25℃，光照16h/d)。

(8)外植体筛选培养

待上述延迟培养结束后，将外植体转移至外植体筛选培养基(25℃，光照16h/d)，每隔15d将外植体转移至新的外植体筛选培养基上，直至长出抗性芽(20天左右)。最终，未污染的外植体共计121个，其中有69个外植体再生出抗性芽。

(9)抗性芽的生根培养

将再生芽从生长点下部切下，转移至芽生根培养基中，培养至长出根，最终获得的生根良好的抗性植株共计88株。

4.再生植株的阳性检测

(1)抗性再生植株的PCR检测

将目标基因(SOC1)构建到载体(pCambia1301)中后，依据目标基因和载体序列设计PCR引物，引物序列如下：

上游引物SOC1TransPF1(SEQ ID NO.6)：

GCGGGTCGACGGTACC(5’-3’)；

下游引物SOC1TransPR1(SEQ ID NO.7)：

TCACTTTCTTGAAGAACAAGGTAACC(5’-3’)。

以生根后抗性苗叶片的基因组DNA为模板，以未转化的植株叶片DNA 为阴性对照，重组质粒pCambia1301为阳性对照，进行PCR扩增。

PCR程序为：94℃，3min；94℃30s,55℃15s,72℃15s,30个循环；72℃延伸7min，16℃保持。

PCR反应体系为：1μL模板、10μL 2×PCR mix、1μL 10μM上游引物、 1μL 10μM下游引物和7μL水。

待PCR反应完成后，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阴性对照没有目的条带，阳性对照有一条明亮的目的条带(658bp，SEQ ID NO.8)，转化后的抗性苗叶片基因组DNA有658bp条带的即为阳性植株，没有条带的即为未转化成功的植株。结果显示，在生根良好的抗性植株88株中，PCR 检测具有658bp目的条带的植株有30株。

(2)PCR检测阳性植株叶片的GUS染色

按照GUS染色液试剂盒(购自北京Leagene公司，CAS号为18656-96-7) 的说明书配制GUS染色工作液。

剪取88株PCR检测阳性植株的幼嫩叶片于指管中，加入适量GUS染色工作液使其完全浸没叶片，置于抽真空罐中抽真空5min，然后于30℃保温2h；将叶片转入70％乙醇中脱色3～4次，至阴性对照(未转化的植株叶片)呈白色；肉眼观察，叶片白色背景上有蓝色小点(GUS表达位点)即为阳性植株。结果显示，PCR检测具有目的条带的30株植株中GUS染色具有蓝色小点的有27株。

用本发明的方法在短时间内获得了西兰花遗传转化阳性苗27个株系 (PCR检测和GUS染色检测双阳性即为遗传转化成功的阳性苗)，用于实验的未污染的外植体共计121个，遗传转化效率为27/121*100％＝22.31％。

实施例2

1.培养基的配制

与实施例1的基本相同，区别在于各组分的浓度，本实施例中遗传转化各阶段的培养基的配方具体如下：

(1)外植体预培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L，pH 6.0；

(2)外植体共培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.05mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L，pH 6.0；

(3)外植体延迟培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L+300mg/L特美汀，pH 6.0；

(4)外植体筛选培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.05mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L+特美汀300mg/L+潮霉素5 mg/L，pH 6.0；

(5)芽生根培养基：MS培养基+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+ 特美汀300mg/L+潮霉素5mg/L，pH 6.0；

2.农杆菌介导的西兰花遗传转化再生植株的获得

(1)肉质花梗外植体的选取

选择植株和花球生长健康的西兰花作为供体植株，取直径12cm左右的花球。去除上部花蕾，选取横径在0.3-2.0cm的肉质花梗作为外植体。

(2)外植体的灭菌

将肉质花梗切成5cm以内的小段方便消毒清洗，先用纯净水清洗3次，然后将其放入4％次氯酸钠溶液中，在摇床轻微摇晃(60rpm)进行表面消毒 10min，再在超净台上用无菌水清洗4次后，备用；

(3)外植体的预培养

在超净台上，将灭菌后的肉质花梗置于无菌滤纸上，吸干表面水分，并切除肉质花梗两端灭菌液浸泡过的伤口。最后，将外植体切成长约0.5～1.5cm 的小段，在外植体预培养基中预培养7d(25℃，光照16h/d)。

(4)外植体浸染液的配制

将构建有目的基因载体(pCambia1301)的农杆菌菌株GV3101于28℃震荡培养过夜，至菌液OD

(5)外植体的浸染

用无菌长柄镊子，将预培养7d后、无污染的外植体轻放于菌液中浸染 30分钟。

(6)外植体与菌液共培养

用无菌长柄镊子，将浸染后的外植体轻放于无菌滤纸上，吸干表面菌液。将共培养基表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体竖直放置在滤纸上，在黑暗条件下共培养3d。

(7)外植体延迟培养

共培养3d后的外植体，转移至外植体延迟培养基中，延迟培养5d(25℃，光照16h/d)。

(8)外植体筛选培养

延迟培养结束后，将外植体转移至外植体筛选培养基上，筛选培养4周 (25℃，光照16h/d)，其中每隔10d将外植体转移至新的外植体筛选培养基上，直至长出抗性芽。最终，未污染的外植体共计113个，其中有72个外植体再生出抗性芽。

(9)抗性芽的生根培养

将再生的抗性芽从生长点下部切下，转移至芽生根培养基中，培养至长出根，最终获得的生根良好的抗性植株共计80株。

3.再生植株的阳性检测

(1)抗性再生植株的PCR检测

采用与实施例1相同的方法检测，结果显示：在生根良好的抗性植株80 株中，PCR检测具有658bp目的条带的植株有33株。

(2)PCR检测阳性植株叶片的GUS染色

采用与实施例1相同的方法检测，结果显示：PCR检测具有目的条带的 33株植株中GUS染色具有蓝色小点的有29株。

用本发明的方法在短时间内获得了西兰花遗传转化阳性苗29个株系 (PCR和GUS染色双阳性即为遗传转化成功的阳性苗)，用于实验的未污染的外植体共计113个，遗传转化效率为29/113＝25.66％。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

对比实例1

采用与实施例1的西兰花遗传转化再生植株的操作步骤，只是培养基中的6-BA、NAA和Trans-ZT的浓度不同。

表6不同浓度的6-BA和NAA组合对西兰花肉质花梗再生芽效率的影响

表7添加不同浓度的Trans-ZT对西兰花肉质花梗再生芽效率及时间的影响

6-BA是人工化学合成的细胞分裂素，促进芽再生，而NAA是生长素，促进根的生长。本发明研究了不同浓度细胞分裂素和生长素组合，在不同浓度配比下西兰花肉质花梗外植体的出芽率是完全不同的。并且，通过添加一定浓度的Trans-ZT(反-玉米素，天然的细胞分裂素)，能够更快的诱导肉质花梗外植体芽的再生，缩短了芽再生时间，维持高频率的芽再生效果。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序 列 表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种以肉质花梗为外植体的西兰花高效遗传转化方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgaggg ggaaaactca gatgaagcga atagagaatg caacaagcag acaagtgact 60

ttctctaagc gaaggaatgg tttgttgaaa aaagcctttg agctctcagt gctttgtgat 120

gctgaagttt ctctgatcat cttctctcct aaggcaaaac tttatgaatt cgccagctcc 180

aatatgcaag ataccataga tcgttatctg aggcatacca aggatcgtgt cagcaccaaa 240

cctgtttctg aagaaaattt gcagcatttg aaacatgagg cagcaaacat gatgaagaaa 300

attgaacaac tcgaagcttc caaacgtaaa ctcttgggag aaggcatagg atcatgttcg 360

atagaggagc tgcagcaaat tgagcaacaa cttgagaaaa gtgtcaaatg tatccgagct 420

agaaagactc aagtgtttaa ggaacaaatt gagcagctca agcaaaagga gaaagctcta 480

gctgcagaaa acaagaagct cgctgaaaag tggggatctc atgaaatcga agtccggtcg 540

aataagaacc aagaaagtgg aagaggtgac gaagagagta gcccaagttc tgaagtagag 600

acagagttgt tcattgggtt accttgttct tcaagaaagt ga 642

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgggtcgac ggtaccatgg tgagggggaa aactc 35

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagacatatg ggtacctcac tttcttgaag aacaagg 37

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttccggct cgtatgttg 19

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgggtcgac ggtacc 16

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcactttctt gaagaacaag gtaacc 26

<210> 8

<211> 658

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgggtcgac ggtaccatgg tgagggggaa aactcagatg aagcgaatag agaatgcaac 60

aagcagacaa gtgactttct ctaagcgaag gaatggtttg ttgaaaaaag cctttgagct 120

ctcagtgctt tgtgatgctg aagtttctct gatcatcttc tctcctaagg caaaacttta 180

tgaattcgcc agctccaata tgcaagatac catagatcgt tatctgaggc ataccaagga 240

tcgtgtcagc accaaacctg tttctgaaga aaatttgcag catttgaaac atgaggcagc 300

aaacatgatg aagaaaattg aacaactcga agcttccaaa cgtaaactct tgggagaagg 360

cataggatca tgttcgatag aggagctgca gcaaattgag caacaacttg agaaaagtgt 420

caaatgtatc cgagctagaa agactcaagt gtttaaggaa caaattgagc agctcaagca 480

aaaggagaaa gctctagctg cagaaaacaa gaagctcgct gaaaagtggg gatctcatga 540

aatcgaagtc cggtcgaata agaaccaaga aagtggaaga ggtgacgaag agagtagccc 600

aagttctgaa gtagagacag agttgttcat tgggttacct tgttcttcaa gaaagtga 658