一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，该方法包含：(1)花梗外植体的选取：以松散型花椰菜作为供体植株，选取横径在0.3～0.8cm的花梗作为外植体；(2)外植体的灭菌；(3)外植体的预培养；(4)外植体的浸染；(5)外植体与菌液共培养；(6)外植体延迟培养；(7)外植体筛选培养；(8)抗性芽的生根培养；(9)再生植株的阳性检测。本发明的方法首次建立了以花椰菜花梗为外植体的高效遗传转化，结合PCR检测和GUS染色结果，遗传转化植株阳性率达到了10～15％，在花梗芽再生过程中，不需要愈伤组织的诱导，可以直接再生出芽，大大缩短了芽再生所需时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种花椰菜高效遗传转化方法，具体涉及一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法。

背景技术

花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis，2n＝2x＝18)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一种重要的特色蔬菜，在世界范围内被广泛种植和食用。然而，花椰菜起源于地中海沿岸，收集和鉴定的花椰菜种质资源非常有限，导致国内自主选育的花椰菜品种在花球商品性、病虫害抗性及高温或严寒气候的耐受性等方面存在缺陷。因此，如何利用基因工程手段，快速、定向遗传改良现有种质成为育种研究领域最重要的课题之一。

农杆菌介导的遗传转化技术可以实现外源优异基因的快速转入和整合以及靶标内源基因的定点突变，为优异种质的定向创制提供了快速、高效的解决方案。另一方面，随着甘蓝、青花菜和花椰菜等甘蓝类蔬菜作物基因组测序工作的完成，海量的基因组数据需要可靠的遗传转化体系来进行目标基因的功能验证。因此，建立一种简单高效的花椰菜遗传转化方法，对花椰菜分子育种及基因功能研究具有重要意义，同时也对其它甘蓝类蔬菜的分子功能研究提供借鉴。

至今，包括花椰菜在内的甘蓝类蔬菜关于遗传转化的研究主要集中在芽再生体系的建立及遗传转化条件的优化，遗传转化成功的报道较少，并且都存在转化效率较低，试验可重复性较差等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，解决了花椰菜遗传转化的问题，以花梗为外植体，不需要愈伤组织的诱导，可直接再生出芽，大大缩短了芽再生所需时间，而且遗传转化植株阳性率能够达到10～15％。

为了达到上述目的，本发明提供了一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，该方法包含：

(1)花梗外植体的选取：以松散型花椰菜作为供体植株，在花球成熟后 10～20d，花球抽枝10～15cm，选取幼嫩的花枝，去除顶端小花球，选取横径在0.3～0.8cm的花梗作为外植体；对于外植体，若外植体横径小于0.3cm，外植体太嫩，对农杆菌的耐受能力弱，并且切口与浸染液的接触面积太小，显著降低遗传转化阳性率；而外植体横径大于0.8cm，切口面积太大，培养过程中会产生大量的醌类物质，使切口褐化加速，显著降低芽再生效率。因此，横径在0.3～0.8cm的花梗外植体，具有较高的芽再生能力，同时对农杆菌的耐受能力较强(而且农杆菌浸染20～30min时，外植体褐化程度很低)，最适合于农杆菌介导的遗传转化；

(2)外植体的灭菌：将所述花梗清洗并灭菌；

(3)外植体的预培养：将灭菌后的花梗吸干表面水分，并切除花梗两端的伤口，并将外植体切成长度为0.5～0.8cm的小段，在外植体预培养基中将花梗形态学上端接触培养基，在23～25℃下预培养5～7d，光照时间为16h/d；其中，所述外植体预培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、2.0 mg/L 6-BA、0.02mg/L NAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT，pH为5.6～6.0；

(4)外植体的浸染：将预培养的外植体置于外植体浸染液中进行浸染；其中，所述外植体浸染液的配制，包含：将构建有目的基因载体pCambia1301 的农杆菌菌株GV3101，于28℃震荡培养过夜至菌液OD

(5)外植体与菌液共培养：将经过浸染的外植体表面的液体吸干，在外植体共培养基的表层添加一张无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体竖直放置在滤纸上，使花梗形态学上端接触培养基，在黑暗条件下共培养3d；其中，所述外植体共培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 6-BA、 0.02mg/L NAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT，pH为5.6～6.0；共培养的培养基表层要平铺无菌滤纸，可以有效降低外植体的污染率，共培养阶段是农杆菌侵染外植体切口细胞的重要阶段，菌在干燥环境下的活力会大大降低甚至死亡，高湿度有利于保持农杆菌的活性，提高侵染阳性率，所以共培养基中琼脂的浓度要比其他类型培养基小，这样培养基中的含水量较大；本发明能够在较长的时间(3d)进行农杆菌侵染，但又不会对外植体损伤，能够提高再生植株的阳性率；

(6)外植体延迟培养：将经过共培养的外植体，转移至外植体延迟培养基中，花梗形态学上端接触培养基，在23～25℃延迟培养8d，光照时间为 16h/d；其中，所述外植体延迟培养基包含：MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L 琼脂、2.0mg/L 6-BA、0.02mg/L NAA、0.4～0.5mg/L Trans-ZT、300mg/L特美汀，pH为5.6～6.0；

(7)外植体筛选培养：将经过延迟培养的外植体转移至外植体筛选培养基中，花梗形态学下端接触培养基，在23～25℃筛选培养，光照时间为16h/d，筛选培养13～15d，直至长出抗性芽；其中，所述外植体筛选培养基包含： MS培养基、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、2.0mg/L6-BA、0.02mg/L NAA、0.4～0.5 mg/LTrans-ZT、300mg/L特美汀、5mg/L潮霉素，pH为5.6～6.0；

由于生长素极性运输，花梗外植体只有形态学上段会直接出芽，而形态学下端不直接出芽，因此，在遗传转化过程中，在预培养、共培养和延迟培养时，花梗外植体的形态学上端接触培养基，吸收营养并保持一定的湿度，促进芽再生过程的快速启动。在筛选培养时，将花梗的形态学下端接触培养基，形态学上段暴露在空中，这样不仅避免了琼脂对再生芽的阻碍，同时也降低了由于接触琼脂形成的高湿环境诱导的玻璃芽的产生，大大促进了正常抗性芽的再生；

(8)抗性芽的生根培养：将再生的抗性芽从生长点下部切下，转移至芽生根培养基中，培养培养5～7d长出须根；其中，所述芽生根培养基包含： MS培养基、0.05～0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、300mg/L特美汀、 5mg/L潮霉素，pH为5.8～6.0；

(9)再生植株的阳性检测：通过PCR和GUS染色双重检测均为阳性的植株，为花椰菜遗传转化阳性苗；其中，所述PCR，以生根后抗性苗叶片的基因组DNA为模板，采用的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，PCR产物的条带在568bp处，则结果为阳性；所述GUS染色，叶片白色背景上有蓝色小点为阳性。

优选地，所述花梗灭菌采用的灭菌液包含：70％乙醇和4％次氯酸钠。

优选地，所述花梗灭菌：将花梗剪短为3～4cm用灭菌液灭菌，然后用无菌水清洗。

优选地，所述外植体的浸染时间为20～30min，摇床摇晃速度为50～60 rpm。

优选地，所述PCR程序为：94℃，4min；94℃30s，56℃20s，72℃30s， 32个循环；72℃延伸10min，10℃保持。

优选地，所述GUS染色，为：取PCR检测阳性植株的叶片，加入GUS 染色工作液使其完全浸没叶片，于25～35℃保温10～24h；将叶片转入70％乙醇中脱色3～4次，至阴性对照呈白色，所述阴性对照为PCR检测不含568 bp条带的植株的叶片；肉眼观察叶片白色背景上有蓝色小点为阳性植株。

本发明的以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法，解决了花椰菜遗传转化的问题，具有以下优点：

本发明首次建立了以花椰菜花梗为外植体的高效遗传转化方法，结合 PCR检测和GUS染色结果，遗传转化植株阳性率能够达到10～15％，显著高于现有的方法的阳性率，而且转化所需时间更短。花梗芽再生过程中，不需要愈伤组织的诱导，可以直接再生出芽，而且再生出芽的时间更短，从而大大缩短了芽再生所需时间。本发明可以实现35天内再生出转基因阳性苗，转化所需时间短，转化结果稳定，转化效率平均达到了12.1％，优于已经报道的花椰菜遗传转化所需时间及转化效率，试验可重复性高，对花椰菜分子育种及基因功能研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明选取的花椰菜花梗培育再生芽的照片。

图2为本发明花椰菜花梗抗性芽再生及再生植株目标基因PCR和GUS 染色检测。

图3为本发明采用的质粒pCambia1301-KY的结构示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、培养基配制

包括遗传转化各阶段的培养基，它们的组分及含量具体如下：

(1)外植体预培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L(反-玉米素，CAS号：1637-39-4，购自麦克林)，pH＝5.8，121℃高压灭菌20min；

(2)外植体共培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L，pH＝5.8，121℃高压灭菌20min；

(3)外植体延迟培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA0.02mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L+300mg/L特美汀，pH＝5.8，121℃高压灭菌20min(其中，抗生素特美汀是培养基高温灭菌后冷却到60℃时加入的)；

(4)外植体筛选培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.5mg/L+300mg/L特美汀+5mg/L潮霉素， pH＝5.8，121℃高压灭菌20min(其中，抗生素特美汀和潮霉素是培养基高温灭菌后冷却到60℃时加入的)；

(5)芽生根培养基：MS培养基+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9 g/L+300mg/L特美汀+5mg/L潮霉素，pH＝5.8，121℃高压灭菌20min。

2、花椰菜基因表达载体构建

(1)基因克隆

根据目的基因Bol15337序列(SEQ ID NO.4)设计引物，引物序列如下：

CZ-15337-KpnI-F(SEQ ID NO.5)：

GCGGGTCGACGGTACCATGGGAGAAAGAGTGATAGAG；

CZ-15337-KpnI-R(SEQ ID NO.6)：

TAGACATATGGGTACCTTAACGTCTTCGAGCTGCAG。

从植物样本(即松散型花椰菜的花球)中提取RNA，反转录成cDNA(采用Vazyme公司HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，具体操作如下：

(1.1)RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下表1所示的混合液，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

表1为RNA模板变性的混合液成分

(1.2)第一链cDNA合成

将步骤(1.1)的混合液与2×RT Mix和HiScript II Enzyme Mix混合，具体如表2，用移液器轻轻吹打混匀，50℃反应45min，85℃反应5min。

表2为cDNA合成的混合液成分

(1.3)PCR扩增

以cDNA为模板，采用上述引物CZ-15337-KpnI-F和CZ-15337-KpnI-R 进行PCR扩增(采用Vazyme公司phanta max super-fidelity DNA Polymerase)。

PCR反应体系(总体积50μL)如下表3：

PCR反应程序为：95℃30s；(95℃15s，退火温度45-55℃15s，延伸 72℃1min)×39循环；最后延伸72℃，5min。

将PCR产物进行凝胶电泳，结果显示扩增到单一条带(525bp)，大小正确。

(2)载体构建

用KpnI单酶切使载体pCambia1301(VT1842，购自优宝生物，其结构如图3所示)线性化(采用Thermo公司或Takara公司相应限制性内切酶产品)，酶切反应体系如下表4所示。

表4为酶切反应体系

将酶切产物纯化后与上述PCR产物进行重组反应(重组反应试剂盒为 Vazyme公司ClonExpress-II One Step Cloning Kit)，重组连接反应体系(总体积10μl)如下表5所示。

表5为重组连接反应体系

上述反应液使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，放置于37℃反应30min，随后立即置于冰上冷却。

(3)重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞

重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞的具体转化步骤，如下所示：

(3.1)在100μL大肠杆菌感受态细胞中加入10μL上述重组连接反应的产物；

(3.2)冰浴30min；

(3.3)42℃热激60～90s；

(3.4)冰浴2min；

(3.5)加入800μL LB液体培养基；

(3.6)37℃摇床培养30min；

(3.7)6000rpm离心3min，弃上清，涂布Kana(50mg/L)抗性培养基平板；

(3.8)37℃倒置培养12～16h后，挑取抗性菌落；

(3.9)在96孔板中，每孔加入100μL LB(含Kana)液体培养基；

(3.10)各平板取4～8个菌落，在37℃、180rpm扩大培养2h；

(3.11)取1μL菌液进行PCR阳性检测；

(3.12)挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时对扩增产物测序，扩增和测序的引物为插入目的基因两侧的载体序列，为：

35S-F：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(SEQ ID NO.1)；

2301-F：5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTG-3’(SEQ ID NO.7)。

(4)阳性质粒转化农杆菌感受态细胞(GV3101)

将PCR扩增产物测序后，含有目的基因的阳性质粒转化到农杆菌 GV3101感受态细胞中，具体转化步骤如下所示：

(4.1)冰上融化农杆菌GV3101感受态细胞100μL；

(4.2)加入3μL带有目的片段的pCambia1301质粒DNA，冰上放置30min，液氮中冷冻1min，然后37℃水浴3min；

(4.3)加入900μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm/min,振荡培养3h；

(4.4)10000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μLYEP回溶菌体；

(4.5)将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养12-16h。

(4.6)PCR鉴定阳性菌落，PCR引物同上，为：35S-F和2301-F。

3、农杆菌介导的花椰菜遗传转化再生植株的获得

(1)花梗外植体的选取

选择植株和花球生长健康的松散型花椰菜作为供体植株，在花球成熟后约10d，花球抽枝约10cm，选取幼嫩的花枝，去除顶端小花球，选取横径在0.3～0.5cm的花梗作为外植体。

(2)外植体的灭菌

选取的花梗剪短为3～4cm长，先用纯净水清洗3次，然后将其放入70％乙醇浸泡2min，最后放入4％次氯酸钠溶液中，摇床轻微摇晃(60rpm)进行表面消毒15min，再在超净台上用无菌水清洗4次后，备用。

(3)外植体的预培养

在超净台上，将灭菌后的花梗置于无菌滤纸上，吸干表面水分。接着，将外植体转移到无菌报纸上，切除花梗两端灭菌液浸泡过的伤口。最后，将外植体切成长约0.5cm的小段，竖直放置在外植体预培养基上，花梗形态学上端接触培养基，预培养5d(25℃，光照16h/d)。

(4)外植体浸染液的配制

将构建有目的基因(Bol15337基因)载体pCambia1301的农杆菌菌株 GV3101过夜摇菌，至菌液OD

(5)外植体的浸染

用无菌长柄镊子，将前述预培养5d后未污染的外植体轻放于上述外植体浸染液中，摇床轻微摇晃(60rpm)，浸染20min。

(6)外植体与菌液共培养

用无菌长柄镊子，将浸染后的外植体轻放于无菌滤纸上，吸干表面菌液。将外植体共培养基表层添加一张相同大小的无菌滤纸，待滤纸润湿后将外植体竖直放置在滤纸上，花梗形态学上端接触滤纸，黑暗条件下共培养3d，放置的无菌滤纸能够吸收外植体侵染后残留的农杆菌，降低外植体的污染率。

(7)外植体延迟培养

将共培养3d后的外植体转移至外植体延迟培养基中，花梗形态学上端接触培养基，延迟培养8d(25℃，光照16h/d)。

(8)外植体筛选培养

待延迟培养结束后，将外植体转移至外植体筛选培养基上，花梗形态学下端接触培养基。筛选培养15天后，直至长出抗性芽(25℃，光照16h/d)。最终，未污染的外植体共计209个，其中有82个外植体再生出抗性芽。

(9)抗性芽的生根培养

将再生的抗性芽从生长点下部切断，转移至芽生根培养基中，培养5～7d 既长出少量须根。

如图1所示，为本发明选取的花椰菜花梗培育再生芽的照片，A为花椰菜花球抽枝10～15cm的花梗；B为横径为0.2～1.7cm的花梗外植体；C为挑选横径为0.3～0.8cm的外植体进行后续实验；D为花梗外植体在分化培养基上培养15～20d后，出现芽点；E为花梗外植体在分化培养基上培养25～35 天后再生芽。

4、再生植株的阳性检测

(1)抗性再生植株的PCR检测

将目标基因(Bol15337)构建到载体pCambia1301中后，依据目标基因和载体序列设计PCR引物，引物序列如下：

上游引物Bol15337-F(SEQ ID NO.1，前述的35S-F)：

GACGCACAATCCCACTATCC；

下游引物Bol15337-R(SEQ ID NO.2)：

GCGACAGGAAGACCAAGATC。

以生根后抗性苗叶片的基因组DNA为模板，以等体积的无菌水和未转化植株叶片的基因组DNA为阴性对照，重组质粒pCambia1301(含有目标基因Bol15337的载体)为阳性对照。

PCR程序为：94℃，4min；94℃30s,56℃20s,72℃30s,32个循环；72℃延伸10min，10℃保持。

PCR体系为：模板1μL、mix 6μL(3G Tag MasterMix，购自诺唯赞，货号P115-02)、上游引物0.75μL、下游引物0.75μL和水1.5μL。

待PCR反应完成后，取5μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阴性对照没有目的条带，阳性对照有一条亮的目的条带(568bp，序列如SEQ ID NO.3 所示)，转化后的抗性苗叶片基因组DNA有568bp条带的为阳性植株，没有条带的为未转化成功的植株。

如图2所示，为本发明花椰菜花梗抗性芽再生及再生植株目标基因PCR 和GUS染色检测，A为花梗外植体再生出抗性植株；B为再生抗性植株生根良好；C为再生植株的PCR检测(上)和GUS染色检测(下)，在转化后的抗性苗叶片基因组DNA有568bp条带。

结果显示，最终获得的生根良好的抗性植株共计86株，PCR检测具有 568bp目的条带的植株有51株。

(2)PCR检测阳性植株叶片的GUS染色

按照GUS染色液试剂盒(购自北京Leagene公司，CAS号为18656-96-7)，说明书配制GUS染色工作液。

剪取51株PCR检测阳性植株的幼嫩叶片，加入适量GUS染色工作液使其完全浸没叶片，于23℃保温12h；将叶片转入70％乙醇中脱色4次，至阴性对照(未转化的植株叶片)呈白色；肉眼观察，共有21株叶片白色背景上有不同大小的蓝色块/点(GUS表达位点)。

用本发明的方法在56d内获得了花椰菜遗传转化阳性苗21个株系(PCR 和GUS染色双阳性即为遗传转化成功的阳性苗)，用于实验的未污染的外植体共计209个，遗传转化效率为21/209＝10.05％。

实施例2

1、培养基配制

包括遗传转化各阶段的培养基，它们的组分及含量具体如下：

(1)外植体预培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min；

(2)外植体共培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min；

(3)外植体延迟培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L+300mg/L特美汀，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min(其中，抗生素特美汀是培养基高温灭菌后冷却到60℃时加入的)；

(4)外植体筛选培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L+300mg/L特美汀+5mg/L潮霉素， pH＝5.9，121℃高压灭菌20min(其中，抗生素特美汀和潮霉素是培养基高温灭菌后冷却到60℃时加入的)；

(6)芽生根培养基：MS培养基+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9 g/L+300mg/L特美汀+5mg/L潮霉素，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min；

2、农杆菌介导的花椰菜遗传转化再生植株的获得

操作步骤与实施例1基本相同，区别在于：

选择植株和花球生长健康的松散型花椰菜作为供体植株，在花球成熟后约15d，花球抽枝约14cm，选取幼嫩的花枝，去除顶端小花球，选取横径在0.4～0.6cm的花梗作为外植体；

在外植体浸染液的配制时，农杆菌浓度为OD

本实施例中，未污染的外植体共计102个，其中有47个外植体再生出抗性芽。PCR和GUS染色双阳性植株共计14株，遗传转化效率为14/102＝ 13.73％。

实施例3

1、培养基配制

包括遗传转化各阶段的培养基，它们的组分及含量具体如下：

(1)外植体预培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min；

(2)外植体共培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+6-BA 2 mg/L+NAA 0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min；

(3)外植体延迟培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L+300mg/L特美汀，pH＝5.9， 121℃高压灭菌20min(其中抗生素特美汀是培养基高温灭菌后冷却到60℃时加入)；

(4)外植体筛选培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂9g/L+6-BA 2 mg/L+NAA0.02mg/L+Trans-ZT 0.4mg/L+300mg/L特美汀+5mg/L潮霉素，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min(其中抗生素特美汀和潮霉素是培养基高温灭菌后冷却到60℃时加入)；

(5)芽生根培养基：MS培养基+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 9g/L+300mg/L特美汀+5mg/L潮霉素，pH＝5.9，121℃高压灭菌20min；

2、农杆菌介导的花椰菜遗传转化再生植株的获得

操作步骤与实施例1基本相同，区别在于：

选择植株和花球生长健康的松散型花椰菜作为供体植株，在花球成熟后约18d，花球抽枝约15cm，选取幼嫩的花枝，去除顶端小花球，选取横径在 0.5-0.8cm的花梗作为外植体；

在外植体浸染液的配制时，农杆菌浓度为OD

本实施例中，未污染的外植体共计83个，其中有28个外植体再生出抗性芽。PCR和GUS染色双阳性植株共计9株，遗传转化效率为9/83＝10.84％。

对比例1

采用与实施例1的花椰菜遗传转化再生植株的操作步骤，只是培养基中的6-BA、NAA和Trans-ZT的浓度不同。

表6为不同浓度的6-BA和NAA组合对花椰菜花梗外植体芽再生效率的影响

表7为添加不同浓度的Trans-ZT对花椰菜花梗芽再生效率及再生时间的影响

6-BA是人工化学合成的细胞分裂素，促进芽再生，而NAA是生长素，促进根的生长。本发明研究了不同浓度细胞分裂素和生长素组合，在不同浓度配比下花椰菜花梗外植体的出芽率是完全不同的。并且，通过添加一定浓度的Trans-ZT(反-玉米素，天然的细胞分裂素)，能够更快的诱导花椰菜花梗外植体的芽的再生，显著缩短了芽再生时间，维持高频率的芽再生效果。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序 列 表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种以花梗为外植体的花椰菜高效遗传转化方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcgacaggaa gaccaagatc 20

<210> 3

<211> 568

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat 60

ttggagagga gctcccgcgg gtcgacggta ccatgggaga aagagtgata gagccattga 120

taatgggaag agtggtagga gatgttctcg atttcttcac tccaacaatt aaaatgaatg 180

tgagctacaa catgaagcaa gtctccaaca gccatgagct ttttccttcc tctgtctcct 240

ccaagcctag ggttgagatc catggtggtg atctcagatc cttcttcacc ttggtgatga 300

tagaccctga tgttccaggt cctagtgacc cctttctaaa agagcacctg cattggatag 360

taacaaacat ccccggtaca accgatgcta catttggaaa agaggtggtg agctatgagt 420

tgccaaggcc tagcataggg atacacaggt tcgtgtttgt tctgttcaag cagaagcaaa 480

gacgtgttat cttcccaaac attccttcga gagataactt caacactcga aaatttgcga 540

tcgagtatga tcttggtctt cctgtcgc 568

<210> 4

<211> 525

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgggagaaa gagtgataga gccattgata atgggaagag tggtaggaga tgttctcgat 60

ttcttcactc caacaattaa aatgaatgtg agctacaaca tgaagcaagt ctccaacagc 120

catgagcttt ttccttcctc tgtctcctcc aagcctaggg ttgagatcca tggtggtgat 180

ctcagatcct tcttcacctt ggtgatgata gaccctgatg ttccaggtcc tagtgacccc 240

tttctaaaag agcacctgca ttggatagta acaaacatcc ccggtacaac cgatgctaca 300

tttggaaaag aggtggtgag ctatgagttg ccaaggccta gcatagggat acacaggttc 360

gtgtttgttc tgttcaagca gaagcaaaga cgtgttatct tcccaaacat tccttcgaga 420

gataacttca acactcgaaa atttgcgatc gagtatgatc ttggtcttcc tgtcgctgct 480

gtcttcttta acgcccagag agaaactgca gctcgaagac gttaa 525

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gcgggtcgac ggtaccatgg gagaaagagt gatagag 37

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tagacatatg ggtaccttaa cgtcttcgag ctgcag 36

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gcttccggct cgtatgttg 19