植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法及冷冻切片方法

摘要

本申请公开一种用于植物的冷冻切片方法，改进了固定液的配方，以及优化了包埋之前的处理，使得植物细胞在冷冻过程产生的冰晶减少，降低了冷冻过程对细胞造成的损伤，提高了植物组织切片的完整性。本申请还公开一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，重点对抗原修复条件、抗体稀释度、孵育时间、洗涤方式以及抗体稀释液的选择进行优化，系统地建立了检测植物体内植物生长物质分布的免疫荧光定位方法，提高了植物体内植物生长物质免疫荧光定位的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。

说明书

技术领域

本申请涉及植物生理学领域，尤其涉及一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法及冷冻切片方法。

背景技术

目前，冷冻切片技术在动物和人体研究中已有着成熟的冰冻切片条件，成为病理学以及临床医学等方面用来研究和观察组织的形态结构变化的主要手段，但由于植物细胞有中央大液泡，含水量较大，具有细胞壁，以及同一植物不同组织部位质地差异也较大，与动物样品相比更容易在冰冻过程中形成冰晶，挤压周围的细胞器，进而损伤植物细胞的细微结构，对植物组织细胞的观察产生影响。

发明内容

本申请的目的是，为克服现有技术的不足，提出一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，以及适应该定位方法的用于植物的冷冻切片方法。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种用于植物的冷冻切片方法，其包括如下步骤：

从植物体上选取任一植物器官的组织；

利用含EDC的固定液进行植物组织的固定；

利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织；

利用OTC包埋剂包埋所述浸洗后的植物组织；

利用冷冻切片机制备5～40μm厚的植物组织切片。

可选择地，所述植物器官包括：花、叶、茎、茎尖、根或根尖。

具体地，所述植物组织来源于花、叶、茎尖或根尖时，所制备的植物组织切片的厚度不超过20μm；所述植物组织来源于茎或根时，所制备的植物组织切片的厚度不超过40μm。

进一步地，所述固定液包括：2％EDC、3％多聚甲醇、0.5％戊二醇、4％蔗糖、10mmol/L磷酸缓冲液，pH＝7.0。

更进一步地，所述利用含EDC的固定液进行植物组织的固定，包括：在4℃的条件下，利用所述含EDC的固定液浸泡植物组织。

可选择地，所述利用所述含EDC的固定液浸泡植物组织，包括：所述植物组织离体后投入所述含EDC的固定液进行冰浴抽气固定0.5～1.5h，更换新鲜的所述含EDC的固定液之后在4℃的条件下浸泡4～5h。

进一步地，所述利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织，包括：配制含4％蔗糖的10mmol/L磷酸缓冲液，调整pH至7.0；浸洗固定后的植物组织1～2h。

优选地，所述利用含蔗糖的磷酸缓冲液浸洗固定后的植物组织之前，将所述固定后的植物组织切割至毫米尺寸。

更进一步地，所述利用OTC包埋剂包埋所述浸洗后的植物组织，包括：

利用可剥离容器容置外裹所述OTC包埋剂的植物组织；

利用液氮浇注所述可剥离容器至整体固化成包埋块；

将所述包埋块移入冷冻切片机的内腔至所述包埋块温度平衡；

剥离所述可剥离容器之后将所述包埋块固定在所述冷冻切片机的样品托上。

可选择地，所述可剥离容器包括纸盒、薄膜盒中的任意一种。

可选择地，所述液氮浇注的时间为15～30s。

进一步可选择地，所述包埋块固定在所述冷冻切片机的样品托上之前，包括：将所述包埋块置于室温使表面软化，用所述OTC包埋剂粘结所述包埋块和样品托。

进一步地，利用经0.01％多聚赖氨酸处理过的载玻片承载所述植物组织切片。

更进一步地，所述植物组织切片在37℃的条件下烘干，用于保存或进行后续的处理。

第二方面，本申请提供一种植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，其包括如下步骤：

制备任一植物器官的植物组织切片；

基于链霉亲和素对所述植物组织切片中的植物生长物质进行免疫荧光染色；

其中，所述植物组织切片采用如前所述的用于植物的冷冻切片方法获得。

可选择地，所述植物包括豆科植物。

进一步可选择地，所述植物包括花生，所述植物器官包括花生的叶、根、近叶段茎和近根段茎。

进一步可选择地，所述植物生长物质包括脱落酸或脱落酸衍生物。

进一步地，所述进行免疫荧光染色，包括：

对植物组织切片进行抗原修复；

分别利用所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体对所述植物组织切片进行孵育；

对孵育后的植物组织切片进行显色之后，观察并记录结果。

可选择地，所述对植物组织切片进行抗原修复，包括以下任意一种方式：

1mol/L盐酸室温处理20min；

0.1％的胰蛋白酶37℃处理10min；

微波修复10min；

直接加热煮沸20min。

进一步地，所述分别利用所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体对所述植物组织切片进行孵育，包括：

分别确认所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体的稀释倍数；

分别确认所述植物生长物质对应的单克隆抗体和与所述单克隆抗体的对应的亲和纯化抗体的孵育温度和孵育时间；

确认每次孵育之后对植物组织切片的洗涤方式。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

(1)本申请的用于植物的冷冻切片方法，改进了固定液的配方，以及优化了包埋之前的处理，使得植物细胞在冷冻过程产生的冰晶减少，降低了冷冻过程对细胞造成的损伤，提高了植物组织切片的完整性。

(2)本申请的用于植物的冷冻切片方法，与石蜡切片、树脂切片相比较，制片时间短，不仅切片的结构完整性高，切片内的活性物质损失少。

(3)本申请的用于植物冷冻切片方法，适用于植物大部分的器官组织，还可以根据器官组织的含水量和软硬程度调整切片前的处理方式和切片的厚度，使得不同器官的植物组织切片有适宜的切片参数。

(4)本申请的植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，采用了冷冻切片技术最大程度地保留了植物组织切片内的活性物质，有利于对易失活的物质进行组织内的免疫定位。

(5)本申请的植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，重点对抗原修复条件、抗体稀释度、孵育时间、洗涤方式以及抗体稀释液的选择进行优化，系统地建立了检测植物体内植物生长物质分布的免疫荧光定位方法，提高了植物体内植物生长物质免疫荧光定位的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。

附图说明

图1为本申请的方法中针对植物组织固定条件的验证结果，其中A表示采用了含2％EDC固定液处理后的花生叶片切片，B表示采用了不含EDC固定液处理后的花生叶片切片。

图2为本申请的方法中针对植物组织包埋条件的验证结果，其中A表示采用了OTC包埋剂包埋，B表示采用了石蜡包埋，C表示采用了树脂包埋。

图3为本申请的方法中针对抗原修复方法的验证结果，其中A表示采用了1mol/L盐酸室温处理20min，B表示0.1％的胰蛋白酶37℃处理10min，C表示微波修复10min，D表示直接加热煮沸20min。

图4为本申请的方法中针对一抗稀释倍数的验证结果，其中A表示采用了1：100的稀释倍数，B表示1：200的稀释倍数，C表示1：400的稀释倍数。

图5为本申请的方法中针对一抗孵育条件的验证结果，其中A表示4℃孵育过夜，B表示37℃孵育30min。

图6为本申请的方法中针对洗涤条件的验证结果，其中A表示采用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液作为洗涤溶液，B表示采用0.01mol/L pH7.6的TRIS-HCl缓冲液作为洗涤溶液。

图7为本申请的方法中针对洗涤条件的验证结果，其中A表示100r/min摇动漂洗的洗涤方式，B表示直接冲洗的洗涤方式。

图8为本申请的方法中针对二抗稀释倍数的验证结果，其中A表示采用了1：100的稀释倍数，B表示采用了1：400的稀释倍数，C表示采用了1：1600的稀释倍数。

图9为本申请的方法中针对二抗孵育条件的验证结果，其中A表示在室温孵育2h，B表示在37℃孵育30min。

图10为采用本申请的方法验证水分胁迫下四叶期花生各器官ABA的分布。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

植物细胞有中央大液泡,含水量较大,与动物样品相比更容易在冰冻过程中形成冰晶，挤压周围的细胞器，进而损伤植物细胞的细微结构，对植物组织细胞的观察产生影响。植物细胞具有细胞壁,使得植物组织在冰冻后硬度变大且易破碎,致使很多情况下难以切出结构完整的切片。不同物种的植物，甚至在同一物种植物的不同器官和组织中，其质地及含水量差异较大，需要筛选植物冰冻切片条件，将不同质地的植物材料制作成组织切片，使其满足于后续的实验需要，例如在切片厚度的设置上要综合考量切片质量与切片难易程度两种因素,通常切片越薄则切片质量越高,但组织细胞容易破碎,切片难度较大。花、叶片、茎尖等较为幼嫩的组织切片可以较薄,一般为5～20um；根、茎等含水量较低、硬度较大的组织切片可以稍厚,但最好不超过40um,否则切片透明度很差，为后续实验的进行带来困难。

下文以对豆科植物体内的脱落酸(ABA)进行免疫荧光定位为例对本申请的方法展开叙述。

豆科(Leguminosae)是被子植物中的第三大科，种类丰富,形态多样,是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一(谢玉英,2007)，在共生固氮、水土保持、改善土壤肥力等方面具有重要作用(罗文新,1994)。植物在生长发育过程中会受到各种各样的胁迫，研究发现，植物生长物质中的脱落酸(ABA)是植物体内重要的逆境响应激素，既是环境胁迫信号的诱导产物，又是胁迫信号的传导者，使环境信号迅速级联放大(Hu et al.,2016)。此外脱落酸(ABA)作为一种植物激素，还在植物胚胎发育、种子萌发、成熟与休眠、果实成熟等许多方面具有广泛的生理效应(Nambara et al.,2005)，目前对脱落酸的研究，主要集中在与脱落酸相关基因响应胁迫的应答和脱落酸含量的测定，而对脱落酸在植物组织的分布状况研究较少，严重限制了对ABA的生物合成以及其对环境信号的响应的认识。到目前为止，显示ABA在植物组织中位置方法主要涉及间接方法，如监测ABA诱导基因的表达，这既反映了组织的反应性，也反映了ABA的存在(Ishitani et al.,1997；Xiong et al.,1999；Christmannet al.,2005年；Duan et al.,2013)，或ABA生物合成基因的表达，这表明ABA生物合成的可能性(Frey et al.,2012)；直接方法包括ABA生物传感器(Jones et al.,2014；Waadt et al.,2014)和ABA免疫定位方法(Zhang et.,1996；Schraut et al.，2004；Peng et al.,2006),其中现有的ABA免疫定位的方法在拟南芥(Ondzighi-Assoume etal.,2016)、玉米(Schraut et al.，2004；Lu et al.,2019)等模式植物和重要作物上已有应用，而在豆科植物上的应用鲜见报道，且现有方法在ABA免疫定位的特异性与灵敏度上仍有待提高。

本实施例中，定位花生组织中脱落酸的方法，包括如下步骤：

一.固定

选取花生耐旱品种粤油7(Yueyou 7)为实验品种。选取饱满花生种子浸泡过夜，播种于盛有蛭石、珍珠岩和土壤(1:1:2)的花盆中，置于培养箱中培养，培养条件为：相对湿度60％，16h光照(26℃)/8h黑暗(22℃)，隔天浇1/4MS营养液。培养豆科植物生长至幼苗期，取顶叶(第一个功能叶)分别置于含2％EDC的固定液(3％多聚甲醇，0.5％戊二醇，4％蔗糖，10mmol/LPBS，pH＝7.0)和不含2％EDC的固定液中冰浴抽气固定1h，更换新鲜的固定剂，4℃，4-5h。EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)属于可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取。

表1 1/4MS营养液(PH＝5.8-6.0)单位：mg/L

表2 10mmol/L PBS(磷酸缓冲液)(PH＝7.0)

参考图1，结果表明，将花生叶片纵切样品置于含2％EDC的固定液中冰浴抽气固定1h后进行冰冻包埋，切片样品结构完整性高，叶脉细胞排列有序，叶肉细胞排列紧致，样品外周细胞壁无破损出现(图1-A)；而样品在置于不含2％EDC的固定液后切片样品结构破损严重，叶脉细胞排列无序且大面积缺失，叶肉细胞排列松散且破坏严重，样品外周细胞壁严重破损(图2-B)。

二、制片

将固定好的植物材料切成毫米尺寸的样品，具体可以是长2mm×宽1mm，经含4％蔗糖的10mmol/L PBS(pH＝7.0)浸洗1-2h,将清洗后的样品分别用OTC包埋剂(optimalcutting temperature compound，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)、石蜡、树脂包埋于适当大小的纸盒内，用液氮迅速冷冻，冷冻时间约为20s，随后尽快将样品移至温度平衡(-20℃)的冰冻切片机(Leica CM3050S,Germany)腔内；样品短时间置室温，用包埋剂粘在样品托上LEICA(CM1850)冷冻切片机冰冻切片，将切片粘贴于0.01％多聚赖氨酸处理过的载玻片上，切片厚度为10-12μm。其中，纸盒作为可剥离容器便于容纳外裹包埋剂的样品，且纸盒的外轮廓也便于包埋剂固化后对包埋块的修整，本领域技术人员知晓规则形状的包埋块有利于切片机连续工作，制备出顺序排列的植物组织切片。另一种可能的实现方式是，用薄膜制备容纳包埋块的容器，在包埋块固化之后便于剥离薄膜且不残留。制备包埋块时，先用液氮迅速冷冻再移入冰冻切片机进行温度平衡，有利于减少植物细胞内部大粒冰晶的产生。

参考图2，结果表明，花生样品经OCT包埋处理切片后，叶脉细胞排列有序，叶肉细胞排列紧致，细胞清晰可见且无杂质(图2-A)；样品经石蜡包埋后，叶脉和叶肉细胞由于受脱水影响使切片组织过于硬化和干燥化(图2-B)；而用树脂包埋法处理后，切片中叶脉和叶肉细胞中含有不规则结晶分布，且细胞结构较不完整(图2-C)。

三、免疫染色

(1)将切片在37℃烘箱中干燥5-7h后，在10mmol/L PBS(PH＝7.0)中清洗3次，5min/次；用蒸馏水或10mmol/L PBS(PH＝7.0)配制新鲜的3％H

参考图3，结果表明，花生样品在经过0.1％的胰蛋白酶37℃处理10min后，抗原的活性修复较强，免疫组化染色较特异，且细胞结构较完整(图3-B)；而经过微波修复和直接加热煮沸这两种处理后，样品切片细胞中无特异染色出现(图3-C,D)；经1mol/L盐酸室温处理后，样品切片细胞中有微弱特异染色出现，且细胞结构较不完整(图3-A)。

(2)采用棋盘滴定法将ABA单克隆抗体(一抗)按1∶100，1∶200，1∶400，3个梯度稀释，滴加到切片上，分别进行4℃孵育过夜和37℃孵育30min，其中抗体稀释液分别用10％的小牛血清,PBS和含0.5％TritonX-100的PBS。

参考图4，结果表明，当一抗稀释度(鼠抗ABA)为1：100时，样品切片细胞中无特异染色出现(图4-A)；而当一抗稀释度(鼠抗ABA)为1：200时，免疫组化阳性反应着色最强、背景着色最弱(图4-B)；当一抗稀释度升至1：400时，样品切片细胞中免疫组化呈现非特异性染色(图4-C)。

参考图5，当花生ABA免疫酶定位中一抗(鼠抗ABA)进行4℃孵育过夜后，样品切片细胞中免疫组化呈现较微弱特异性染色(图5-A)；而当一抗(鼠抗ABA)进行37℃,30min孵育后样品切片细胞中呈现较强特异性染色(图5-B)。

(3)将孵育后的样品切片分别用0.01mol/L的TRIS-HCl(pH＝7.6)缓冲液或0.01mol/L PBS(pH＝7.4)的进行100r/min摇动漂洗或直接冲洗，将生物素化二抗按1∶100，1∶400，1∶1600，3个梯度稀释，滴加到切片上，37℃孵育30min或室温2h，分别用10mmol/LTRIS-HCl(pH＝7.6)缓冲液或10mmol/L PBS(pH＝7.4)的PBS进行100r/min摇动漂洗或直接冲洗。

参考图6，结果表明，当样品切片免疫杂交后用10mmol/L PBS(pH＝7.4)缓冲液洗去多余的抗体，染色后样品切片细胞中呈现较强特异性染色(图6-A)；而用10mmol/L TRIS-HCl(pH＝7.6)缓冲液洗涤后染色，发现样品切片细胞中免疫组化呈现较微弱特异性染色，且分布较不规则(图6-B)。

参考图7，样品切片免疫杂交后用10mmol/L PBS(pH＝7.4)缓冲液进行100r/min摇动漂洗后染色，发现样品切片细胞中呈现较强特异性染色，且细胞结构完整，排列有序(图7-A)；而当样品经10mmol/L PBS(pH＝7.4)缓冲液直接冲洗染色后，样品切片细胞中免疫组化呈现较微弱特异性染色，且分布较不规则，细胞结构破损严重(图7-B)。

参考图8，当二抗稀释度(生物素化二抗)为1：100时，样品切片细胞中无特异染色出现(图8-A)；而当二抗稀释度(生物素化二抗)为1：400时，免疫组化阳性反应着色最强、背景着色最弱(图8-B)；当二抗稀释度升至1：1600时，样品切片细胞中免疫组化呈现较微弱特异性染色(图8-C)。

参考图9，当花生ABA免疫酶定位中二抗(生物素化二抗)进行室温2h孵育后，样品切片细胞中免疫组化呈现较微弱特异性染色(图9-A)；而当二抗进行37℃,30min孵育后样品切片细胞中呈现较强特异性染色(图9-B)。

(4)在清洗后的样品上滴加相应的SABC试剂(链霉亲和素-生物素-酶复合物)，37℃孵育20min，用加0.02％Tween20的10mmol/L PBS(pH＝7.0)洗4次，10mmol/L PBS(pH＝7.0)洗2次，5min/次；AEC显色显微镜下掌握显色程度；蒸馏水充分洗涤停显；再用双蒸水清洗3次，在配置CoolSNAP CCD的倒置显微镜下观察并照相。

综上，针对花生顶叶的ABA免疫荧光定位方法如下：

1)从幼苗期的花生上取顶叶作为制片的植物器官；

2)利用含2％EDC的固定液对顶叶进行冰浴抽气固定1h，更换新鲜的固定剂之后，4℃下浸泡4-5h，实现植物组织的固定；

3)将固定好的植物组织切成长2mm×宽1mm；

4)利用含4％蔗糖的10mmol/L PBS(pH＝7.0)浸洗1-2h切割后的植物组织；

5)清洗前述的缓冲液之后，利用OTC包埋剂包埋所述植物组织形成包埋块，具体是用液氮迅速冷冻，冷冻时间约为20s，随后尽快将样品移至温度平衡(-20℃)的冰冻切片机腔内；样品短时间置室温，使得包埋块表面适当软化，再用包埋剂粘在样品托上；

6)利用冷冻切片机冰冻切片，将切片粘贴于0.01％多聚赖氨酸处理过的载玻片上，切片厚度为10-12μm；

7)基于链霉亲和素对所述植物组织切片中的植物生长物质进行免疫荧光染色。其中，采用0.1％的胰蛋白酶37℃处理10min进行抗原修复；一抗的稀释浓度为1：200，37℃孵育30min；二抗的稀释浓度为1：400，37℃孵育30min；洗涤时，用10mmol/L PBS(pH＝7.4)缓冲液以100r/min摇动漂洗。

按照上述的实验思路，可以确认花生其他组织的ABA免疫荧光方法的具体步骤和实施条件。参考图10，针对花生的近叶段茎、近根段茎和根，获得了清晰的免疫荧光定位结果。进一步地，按照上述的实验思路，可以确认其他植物的其他器官组织的冷冻切片的条件，以及针对其他特定成分的免疫荧光定位的条件。

本实施例以豆科植物为实验材料，通过对检测样品的固定条件和包埋条件以及免疫荧光定位反应条件(抗原修复条件、抗体稀释度、孵育时间、洗涤方式以及抗体稀释液的选择)进行优化，系统地建立了检测植物体内ABA分布的免疫荧光定位方法，提高了植物体内ABA免疫荧光定位的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少，利用该方法可以确定豆科植物中脱落酸的合成和分布位置以及运输方式,为研究与脱落酸相关基因响应胁迫的应答、脱落酸对植物生理的作用方式以及评价豆科植物的抗逆性提供新方法、新思路。

综上所述，本申请用于植物的冷冻切片方法，改进了固定液的配方，以及优化了包埋之前的处理，使得植物细胞在冷冻过程产生的冰晶减少，降低了冷冻过程对细胞造成的损伤，提高了植物组织切片的完整性。本申请的植物体内的植物生长物质免疫荧光定位方法，重点对抗原修复条件、抗体稀释度、孵育时间、洗涤方式以及抗体稀释液的选择进行优化，系统地建立了检测植物体内植物生长物质分布的免疫荧光定位方法，提高了植物体内植物生长物质免疫荧光定位的灵敏性和特异性,背景清晰,耗时少。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

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