一种用于检测耐药基因适应性代价的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

摘要

本发明提供了一种用于检测耐药基因适应性代价的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，通过Crisper技术在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因，并导入包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS的pAKM质粒，构建得到一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，其本身不存在适应性代价，可用于更加准确、稳定、快速、高效地检测目标耐药基因在待测菌株中的适应性代价，适用于耐药基因(含整合子等耐药可移动原件)的适应性代价分析。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种用于检测耐药基因适应性代价的基因工程菌及其构建方法，尤其涉及一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌及其构建方法。

背景技术

细菌耐药性往往伴随适应性代价的出现，包括生长速率减缓和毒力下降等现象。在无抗菌药物或抗菌药物选择压力较低的环境中，适应性代价可致敏感菌株的数量超过耐药菌株。细菌耐药性致适应性代价影响细菌耐药性产生的速度，即减少抗菌药物的使用，可降低耐药菌株在环境中的比例，进而减缓或防止耐药性的产生。近年来，细菌耐药性问题日益严峻，且产生的速度和程度依然没有减缓的迹象。因此正确检测和评价细菌的适应性代价，可以为如何利用耐药性所致的适应性代价来减缓或阻止耐药性的产生提供参考。

因此急需建立一种更准确高效的适应性代价检测方法，但是由于适应性代价只能通过相对值来进行表征，所以还需尽快建立一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，所述的检测对照菌必须具备易于准确分辨的标志分子，且本身不存在适应性代价，并能排除环境等因素带来的不良影响，才能准确稳定检测出目标耐药基因在待测菌株中的适应性代价。

通过基因工程方法构建含靶标序列的试验菌株，通过含靶标序列试验菌株和不含靶标序列的对照菌株间的竞争试验(competition experiments)，利用流式细胞术等方法分析菌株相对频率(relative frequency)，计算选择系数(selection coefficient)，从而判断菌株的适应性代价，是迄今最高效的适应性代价研究方法(Lacotte et al.,2017；Roch et al.,2017；Starikova et al.,2012&2013)。不同表达株的选择系数由对应表达株出现的频率与对应传代时间的线性回归斜率决定(Lenski et al.,1991)。文献(Lacotteet al.,2017)“Class 1integrons are low-cost structures in Escherichia coli”，公开了一种通过位点特异性重组的方法，在大肠杆菌E.coli MG1655ΔlacZ的λatt位点插入kan-frt-gfpmut3基因盒构建检测对照菌，将I型整合子插入质粒pZA2并导入大肠杆菌E.coli MG1655ΔlacZ构建检测试验菌，利用上述方法分析I型整合子的整合酶活性、Pc启动子多态性、基因盒个数及大小，SOS应答反应调控等因素对选择系数的影响，从而推断出I型整合子在大肠杆菌中是低适应性代价的结构。

整合子因其在细菌耐药性的产生和传播中发挥着至关重要的作用而备受关注。它是通过位点特异性基因重组来捕获、剪切或整合基因盒，使耐药基因能够在细菌间进行水平转移的一类可移动遗传元件。较常见的整合子有I型整合子和II型整合子。II型整合子在水产品致病菌或条件致病菌耐药基因传播扩散中的作用十分重要。但II型整合子结构中各重要元件发挥功能所产生的适应性代价及该结构在应对不同环境时所产生的适应度代价仍需进一步研究阐明。

为此，本研究小组将文献(Lacotte et al.,2017)方法应到I型整合子和II型整合子适应性代价的检测，但在适应性代价检测过程中，出现荧光信号较弱、不稳定，检测精确度差，重复性差等问题，尤其是II型整合子，检测结果非常不稳定，因此该方法检测I型整合子和 II型整合子或耐药基因的适应性代价存在一定缺陷。

文献(Lacotte et al.,2017)方法插入到大肠杆菌λatt位点的基因盒包含卡那霉素抗性基因kan、短重复序列frt和绿色荧光蛋白基因gfpmut3，插入的序列较大；使用的质粒空载体为pZA2，大小为2.1kb。插入的基因盒序列较大，插入的方法不容易被原始菌株接受，本身存在适应性代价，使用的空质粒偏大等，可能是导致适应性代价检测过程中，出现荧光信号较弱、不稳定，检测精确度差，重复性差等问题的原因。

截至目前还未见适用于各类耐药基因(含整合子等耐药可移动原件)的适应性代价分析的，本身不存在适应性代价，荧光信号稳定，检测精确度高，重复性高的检测对照菌的相关报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测耐药基因适应性代价的基因工程菌，通过在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因，并导入包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因 kan和多克隆位点MCS的pAKM质粒，构建得到一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，在attb位点插入的sfgfp基因不会给菌株带来适应性代价，且pAKM质粒大小为 2.0kb，给试验菌株带来的适应性代价很小，可用于准确、稳定、高效地检测目标耐药基因在待测菌株中的适应性代价，而且适用于各类耐药基因(含整合子等耐药可移动原件)的适应性代价分析。

一方面，本发明提供了一种用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，所述检测对照菌包含大肠杆菌的基因组；所述的大肠杆菌基因组的attb位点包含sfgfp基因；所述的大肠杆菌基因组还包含pAKM质粒，所述pAKM质粒包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS。

本发明的研究小组经过大量的实验研究，令人惊喜地发现，在attb位点包含sfgfp基因的大肠杆菌，荧光信号稳定，且不会给大肠杆菌带来适应性代价，解决了过去因质粒上表达荧光或在λatt位点插入km-frt-gfpmut3基因盒表达荧光的信号不稳定，且检测结果不稳定，不能用于检测耐药基因适应性代价的不足，从而可作为检测耐药基因适应性代价的基因工程菌。

实验证明，采用其他荧光基因，如gfp、Egfp、ACgfp、zsgreen等插入大肠杆菌构建的基因工程菌，均存在荧光信号不稳定，或给大肠杆菌带来适应性代价，从而不能用于作为检测耐药基因适应性代价的基因工程菌。

本发明通过构建包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS的 pAKM质粒，并导入大肠杆菌，从而作为质控，有效抵消了检测结果不稳定的影响因素，进一步实现了适应性代价的准确稳定高效检测。

本发明构建的用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，其本身不存在适应性代价，可用于准确、稳定、高效地检测目标耐药基因在待测菌株中的适应性代价，而且既适用于I 型整合子又适用于II型整合子的适应性代价分析。

进一步地，所述sfgfp基因是通过Crisper技术插入大肠杆菌的attb位点；所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ；所述包含sfgfp基因的attb位点的序列如Seq IDNO.1所示；所述sfgfp基因的序列如Seq ID NO.2所示；所述检测对照菌的保藏编号为CCTCCNO:M2021051。

研究小组经过大量实验证明，利用Crisper技术在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因获得的工程菌，本身完全不存在适应性代价，而且在适应性代价检测实验中表现更稳定，重现性好，明显优于采用其他方法(如同源重组等)获得的基因工程菌，更适合于用作检测耐药基因适应性代价的检测对照菌。

基于Crisper技术，可实现只插入sfgfp基因，无抗性基因kan、短重复序列frt等序列，插入的序列更少，插入位点为attb，对原始菌株的适应性代价基本不存在。

本实验室采用的大肠杆菌为大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ，但并不表示采用其他大肠杆菌不能用于构建所述检测对照菌，理论上说，本发明采用任何大肠杆菌均可用于构建所述的检测对照菌。

本发明的用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌于2021年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021051，分类命名为大肠杆菌Escherichia coli JH-1，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮政编码430072。

进一步地，所述pAKM质粒的序列如Seq ID NO.3所示；所述p15a低拷贝复制子的序列如 Seq ID NO.4所示；所述卡那霉素抗性基因kan的序列如Seq ID NO.5所示；所述多克隆位点 MCS的序列如Seq ID NO.6所示。

另一方面，本发明提供了一种如上所述的检测对照菌的构建方法，包括以下步骤：

1)利用Crisper技术在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因，获得大肠杆菌工程菌；

2)构建带有p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS的pAKM质粒；

3)将pAKM质粒导入步骤1)获得的大肠杆菌工程菌。

进一步地，所述步骤1)包括分别扩增大肠杆菌基因组的attb位点的上游同源臂、下游同源臂及sfgfp质粒片段，经融合PCR扩增后，通过Crisper技术整合至大肠杆菌基因组。

进一步地，所述上游同源臂的正向扩增引物1655attb-up-F具有如序列表Seq IDNO.7所示的序列，反向扩增引物1655-attb-UP R具有如序列表Seq ID NO.8所示的序列；下游同源臂的正向扩增引物1655attb-downF具有如序列表Seq ID NO.9所示的序列，反向扩增引物1655attb-down-R具有如序列表Seq ID NO.10所示的序列；sfgfp的正向扩增引物Sfgfp-attb-F具有如序列表Seq ID NO.11所示的序列，反向扩增引物SfGFP-attb-R具有如序列表Seq ID NO.12 所示的序列。

进一步地，通过Crisper技术，实现大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ菌株制备电转化感受态转化敲除质粒及修复同源臂。

进一步地，所述方法还包括Crisper技术整合获得菌株的鉴定。

用于整合鉴定的正向引物1655attbJDUP-F具有如序列表Seq ID NO.13所示的序列，反向引物1655attbJDdown-R具有如序列表Seq ID NO.14所示的序列。

进一步地，步骤3)所述将pAKM质粒导入大肠杆菌工程菌的方法为热激法。

再一方面，本发明还提供了一种耐药基因适应性代价的检测方法，包括以下步骤：

a)将待检测适应性代价的目标耐药基因或耐药整合子等耐药可移动原件插入pAKM质粒的 MCS位点，构建pAKM重组质粒；

b)将pAKM重组质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ，构建检测试验菌；

c)将如上所述的检测对照菌和步骤b)获得的检测试验菌进行竞争试验，通过流式细胞技术分析获得竞争实验中检测试验菌和检测对照菌的相对频数，分析获得目标耐药基因的适应性代价。

进一步地，步骤c)所述的分析的具体方法为：以时间(天)为自变量x，检测试验菌与试验对照菌株相对频数的自然对数ln[freq

再一方面，本发明提供了一种在attb位点包含sfgfp基因的大肠杆菌在适应性代价检测或制备用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌上的用途，所述大肠杆菌利用Crisper技术在 attb位点插入sfgfp基因。

再一方面，本发明提供了Crisper技术在制备用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌上的用途。

再一方面，本发明提供了一种pAKM质粒在制备用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌上的用途，所述pAKM质粒包含p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、通过sfgfp基因和Crisper技术，以及pAKM质粒的运用，构建了一种本身不存在适应性代价、可用于更准确、稳定、高效地检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

2、提供了一种更准确快速高效的适应性代价检测方法；

3、既适用于I型整合子又适用于II型整合子的适应性代价分析，适用于各类耐药基因(含整合子等耐药可移动原件)的适应性代价分析。

附图说明

图1为实施例1中大肠杆菌attb位点上下游片段扩增1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图

图2为实施例1中融合PCR扩增获得的修复同源臂质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图

图3为实施例1中的原始大肠杆菌划线平板照片

图4为实施例1中的大肠杆菌工程菌划线平板照片

图5为实施例1中的鉴定经Crisper整合获得的大肠杆菌工程菌和原始大肠杆菌1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图

图6为实施例2中的PAKM质粒图谱

图7为实施例3中的耐药基因aadA1适应性代价的自变量与应变量关系示意图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。

实施例1大肠杆菌工程菌E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp的构建

本实施例提供的大肠杆菌工程菌E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp的构建方法包括以下步骤：

一)引物设计(5’-3’)

1655attb-up-F：ATGCCACCATCAAGGGAAAGCC

1655-attb-UP R：TATTATCAGTATATCACGAACAAAAAAGAGCAGCTTATAGCAATT

Sfgfp-attb-F：AATCCGTTGAAGCCTGCTTTTTTGATCTCTCCTTCACAGATTCCC

SfGFP-attb-R：CCCGTTTCGCTCAAGTTAGTATATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGT

1655attb-downF: ACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATATACTAACTTGAGCGAAACGGG

1655attb-down-R：GCATCTGGCGTGGGATGATGTTCCT

1655attbJDUP-F:TGCGCCGCGACCAGAAACGATAT

1655attbJDdown-R:GGTCGAAACCACTCATCCGGTGA

二)基因组改造修复同源臂构建

①以大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ(实验室根据来源于美国典型菌种保藏中心ATCC 的大肠杆菌E.coli MG1655进行lacZ缺失突变获得)的基因组DNA为模板，设计上下游引物1655attb-UP-F/1655-attb-UP R 1655attb-downF/1655attb-down-R进行扩增，其中PCR体系如下：

1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如图1所示，其中M指分子量marker，1指大肠杆菌E.coli MG1655 attb下游同源臂(down片段)，2指大肠杆菌E.coli MG1655attb上游同源臂片段(UP片段)。

②以pUC19-c-sfgfp(本实验室构建)为模板，设计引物Sfgfp-attb-F/SfGFP-attb-R进行扩增，其中PCR体系如下：

1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如图1所示，其中M指分子量marker，3指sfGFP片段。

③扩增好的片段经PCR产物纯化试剂盒回收后按照如下体系进行融合PCR扩增，PCR 体系如下：

扩增条件：94℃5min,2Cycle(94℃30sec、50℃30sec、72℃40sec),30cycle(94℃30sec、50℃30sec、72℃40sec),10℃hold on。

1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如图2所示，其中M指分子量marker，2指融合PCR 扩增获得的修复同源臂。

三)Crisper整合

通过在线设计网站CRISPER direct在线设计gRNA，构建pCas9/gRNA载体。将修复DNA 模板插入pTarget载体。制备大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ菌株电转化感受态细胞，将 pCas9/gRNA载体和修复同源臂载体pTarget转化到大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ，并利用终浓度为10mmol/L的阿拉伯糖诱导质粒pCas/gRNA表达，介导sfgfp基因插入。获得重组工程菌后，消除pCas/gRNA质粒和pTarget质粒。

制备大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ菌株电转化感受态细胞，具体操作方法如下：

①将3ml过夜培养的新鲜大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ菌液接种到300ml LB无抗生素培养基；

②37℃，300rpm摇床培养约3h，使得菌液OD

③将培养好的菌液在冰上预冷20min后转移到无菌的、预冷的100ml圆底离心管，4℃， 4000×g，离心15min；

④小心弃去上清部分；加入10％的冰预冷甘油80ml，轻柔摇晃重悬沉淀；

⑤4℃，4000×g，离心15min，小心弃去上清部分；

⑥加入10％的冰预冷甘油40ml，轻柔摇晃重悬沉淀；

⑦4℃，4000×g，离心15min，小心弃去上清部分；

⑧加入10％的冰预冷甘油3.2ml，轻柔摇晃重悬沉淀；

⑨4℃，4000×g，离心15min，小心弃去上清部分；轻柔地将沉淀重悬于0.32ml的10％的冰预冷甘油；

⑩将0.32ml体积分装成分管40μl，储存与-80℃备用。

四)整合鉴定

将经Crisper整合获得的大肠杆菌工程菌和原始大肠杆菌分别涂布平板鉴定，原始大肠杆菌划线平板如图3所示，大肠杆菌工程菌划线平板如图4所示。并设计用于整合鉴定的引物 1655attbJDUP-F/1655attbJDdown-R，鉴定经Crisper整合获得的大肠杆菌工程菌和原始大肠杆菌，结果如图5所示，其中该对引物插入不成功鉴定是1752bp，插入成功是3019bp。

实施例2用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌E.coli MG1655△lacZattb::sfgfp/pAKM的构建

本实施例采用实施例1获得的大肠杆菌工程菌，进一步转入pAKM质粒，构建用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp/pAKM，具体构建方法包括以下步骤：

一)构建带有p15a低拷贝复制子、卡那霉素抗性基因kan和多克隆位点MCS的pAKM质粒

本实施例提供的pAKM质粒设计后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成获得，pAKM质粒图谱如图6所示。

二)将pAKM质粒转入实施例1构建的大肠杆菌工程菌E.coli MG1655△lacZattb::sfgfp

pAKM质粒通过电转化法导入E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp感受态细胞，具体步骤如下：

①将制备好的50μl大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp电转化感受态细胞，从-80 ℃超低温冰箱取出，置于冰盒中解冻至完全融化；

②同时预冷电击杯和备用的1.5ml离心管；

③将10μl连接产物转移到大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp电转化感受态细胞中，混匀；

④设置电击参数：电压为2.5kV，电容为25μFD，电阻为200Ω；

⑤将连接产物与大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp电转化感受态细胞混合物轻柔转移到冰预冷的电击杯中，将电击杯置放在电击槽；

⑥盖好盖子后，电击；

⑦听到蜂鸣后迅速将电击杯取出并立即加入1ml SOC培养基，快速轻柔混匀；

⑧将电击杯中培养液转移到无菌试管，37℃摇床200rpm，培养2h；

⑨取50-100μl培养液均匀涂布于LB固体培养基上进行筛选，LB平板含50mg/lKan， 37℃培养12-16h；

⑩挑取白色单菌落置于3mL LB液体培养基(含50mg/L的Kan)，37℃、200rpm台式恒温振荡器培养3h，取菌液进行菌液PCR筛选、确证pAKM质粒已转入大肠杆菌工程菌E.coliMG1655△lacZ attb::sfgfp。

实施例3耐药基因aadA1适应性代价的检测分析

本实施例采用实施例2提供的E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌，同时制备构建检测试验菌：先将待检测适应性代价的目标耐药基因aadA1和组成型表达启动子插入pAKM质粒的MCS位点，构建质粒pAKM-aadA1；然后将质粒pAKM-aadA1导入大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ，构建检测试验菌；再分别将检测对照菌和检测试验菌进行竞争试验，通过流式细胞技术(BD Accuri C6，购自美国)，分析获得竞争实验中检测试验菌和检测对照菌的相对频数，计算分析获得目标耐药基因的适应性代价。

具体计算分析的方法为：以时间(天)为自变量x，检测试验菌与试验对照菌株相对频数的自然对数ln[freq

检测结果如表1所示：

表1、耐药基因aadA1适应性代价的检测结果

自变量与应变量的关系曲线如图6所示，拟合一元线性回归方程为：y＝kx+b，k为-0.0309，b为0.0061。

检测试验菌相对检测对照菌株的选择系数S＝k/ln(1/d)，得到S为-0.0067，证明基因aadA1 给大肠杆菌带来适应性代价。

实施例4不同构建方法获得的大肠杆菌工程菌的本身适应性代价检测

本实施例分别采用Crisper技术和同源重组方法将sfgfp基因插入大肠杆菌构建大肠杆菌工程菌，并参照实施例2将质粒pAKM导入工程菌。获得的工程菌分别与原始大肠杆菌进行竞争试验，检测对照菌本身是否存在适应性代价检测。

共分以下两组进行：

第一组：采用实施例1提供的Crisper技术获得的大肠杆菌工程菌，转入质粒pAKM(pAKM质粒大小2.0bp)；

第二组：利用位点特异性重组方法将sfgfp导入大肠杆菌构建大肠杆菌工程菌；位点特异性重组方法参照(Cherepanov and Wackernagel,1995)和(Lacotte et al.,2017)方法，插入基因盒为kan-frt-sfgfp，转入质粒为pZA2(pZA2质粒大小为2.1bp)。

检测对照菌本身适应性代价检测方法如下：分别采用以上两组工程菌与原始大肠杆菌进行竞争试验，通过流式细胞技术(BD Accuri C6，购自美国)，分析获得竞争试验中试验菌株和原始大肠杆菌的相对频数，通过线性回归数据分析上述两组工程菌的适应性代价，具体方法如实施例3，每组重复5次，检测结果如表2所示。

表2、不同构建方法获得的工程菌的自身适应性代价检测

由表2可见，第一组利用Crisper技术在大肠杆菌的attb位点插入sfgfp基因获得的工程菌，相对于原始大肠杆菌的选择系数为-0.00002±0.00013，说明采用Crisper技术在attb位点插入 sfgfp基因不会带来适应性代价；第二组中，采用文献(Lacotte et al.,2017)方法插入sfgfp基因获得的工程菌，相对于原始大肠杆菌的选择系数为-0.00036±0.00019，说明采用文献 (Lacotte et al.,2017)方法在attb位点插入sfgfp基因给大肠杆菌带来较小适应性代价。

这可能是由于采用Crisper技术插入基因时，插入过程更温和，插入的基因更容易被原始菌株所接受，而且只插入sfgfp基因，无需其他额外序列，插入的序列更少，因此给原始菌株带来的适应性代价基本可忽略。说明采用文献(Lacotte et al.,2017)方法，插入过程容易引起原始菌株的排异，而且除插入了sfgfp基因，还插入了抗性筛选基因kan和短重复序列frt，插入序列较大，且转入的质粒pZA2比pAKM大，给大肠杆菌带来一定的适应性代价。

实施例5 I型和II型耐药整合子适应性代价检测分析

本实施例参照实施例3的方法，将待检测适应性代价的I型耐药整合子 (intI1-dfrA17-aadA5)和II型耐药整合子(intI2*-dfrA1-sat2-aadA1)插入pAKM质粒的MCS 位点，构建质粒pAKM-I1和pAKM-I2；然后将质粒pAKM-I1和pAKM-I2分别导入大肠杆菌MG1655△lacZ，构建两组检测试验菌；

本实施例采用如实施例1提供的竞争试验检测对照菌，分别进行I型和II型耐药整合子的适应性代价检测，构建的检测对照菌为：采用实施例1提供的Crisper技术获得的大肠杆菌工程菌，进一步采用实施例2提供的方法，获得E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

采用以上两组检测对照菌，进行I型和II型耐药整合子的适应性代价检测，具体检测方法为：将对照菌分别与两组检测试验菌进行竞争试验，通过流式细胞技术(BD AccuriC6，购自美国)，分析获得竞争实验中检测对照菌和检测试验菌的相对频数，通过线性回归数据分析获得目标耐药基因的适应性代价，具体方法如实施例3，每组重复5次，检测结果如表 3所示。

表3、对I型耐药整合子和II型耐药整合子适应性代价检测结果

由表3中检测结果可见，采用本发明提供的检测对照菌能检测I型和II型耐药整合子在大肠杆菌中的适应性代价，且检测结果稳定，五次重复检测偏差小，检测数据可靠。参照此方法，可以研究：(1)I型和II型耐药整合子中各重要元件的差异(如整合酶活性、Pc启动子强弱、基因盒个数和大小等)会对其适应性代价产生的影响；(2)研究携带I型和II 型耐药整合子的多重耐药大肠杆菌在不同环境以及含微量乃至痕量抗生素等条件下的适应度代价。这对进一步揭示整合子介导的耐药基因水平传播机制，为食源性致病菌耐药性的风险评估和防控技术提供参考。

实施例6不同荧光基因对适应性代价检测的影响

本实施例采用实施例1提供的Crisper技术分别在大肠杆菌的attb位点插入不同荧光基因，从而构建用于检测适应性代价的检测对照菌，进行目标耐药基因的适应性代价检测，共分五组：

第一组：采用实施例2获得的E.coli MG1655△lacZ attb::sfgfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

第二组：采用实施例1提供的方法，并将其中的sfgfp改用gfp基因，进一步采用实施例2提供的方法，获得E.coli MG1655△lacZ attb::gfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

第三组：采用实施例1提供的方法，并将其中的sfgfp改用Egfp基因，进一步采用实施例2提供的方法，获得E.coli MG1655△lacZ attb::Egfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

第四组：采用实施例1提供的方法，并将其中的sfgfp改用ACgfp基因，进一步采用实施例2提供的方法，获得E.coli MG1655△lacZ attb::ACgfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

第五组：采用实施例1提供的方法，并将其中的sfgfp改为zsgreen基因，进一步采用实施例2提供的方法，获得E.coli MG1655△lacZ attb::ACgfp/pAKM作为用于检测耐药基因适应性代价的检测对照菌；

先将待检测适应性代价的II型耐药整合子(intI2*-dfrA1-sat2-aadA1)插入pAKM质粒的MCS位点，构建质粒pAKM-I2；然后将质粒pAKM-I2导入大肠杆菌E.coli MG1655△lacZ，构建检测试验菌；再分别将以上五组对照菌和检测试验菌进行竞争试验，通过流式细胞技术 (BD Accuri C6，购自美国)，分析获得竞争实验中检测对照菌和检测试验菌的相对频数，通过线性回归数据分析获得目标耐药基因的适应性代价，具体方法如实施例3，检测结果如表4所示。

表4、不同的荧光基因对适应性代价检测的影响

由表4可见，采用第一组提供的检测对照菌进行目标基因的适应性代价检测时，检测结果非常稳定，五次重复检测几乎无偏差；而采用第二组至第五组提供的检测对照菌进行检测时，检测结果不稳定，可见检测对照菌的构建过程中，荧光基因的选择同样是非常关键的，对于精确检测适应性代价影响非常大，本发明提供的采用Crisper技术插入sfgfp构建的检测对照菌可以更加稳定、精确、高效地检测目标耐药基因的适应性代价。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种用于检测耐药基因适应性代价的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttggacagcg tagccggtgc aaacacatac gcttcttgct gagtacgtga gttcaccacg 60

cggaattcgg tgttatcgaa caccactgcg ccgcgaccag aaacgatatc cacatcccct 120

tcaatgtagc tgttggtcac cagcgtacgc ggctgacgat tcgtttccag acggttctgc 180

acaccgctgt tggtgacaaa gaaggtgttc tgacgaccga gaatgttaac gttgttaatc 240

tgtacctggt caccatcagt acgcagtgcc accgccggat ggttacctgc atctacgcta 300

tcgcccagcg tgttttcgat ggtcagattt tgcagttgca ggccattgtt ttgtgaccag 360

aagaccgcag agcagagaac accgatactg tcgctgcgtt tgctctggca gctatcgtac 420

atataccacg ctggtttacc tggcatatat ttgccgcgcg ggttgacgtc gtgacgccag 480

tcggcagggc tcatgccacc atcaagggaa agcccaatct tcacatcaat cggtttttca 540

cctgtaccgt acagagtaat tccacccgga gcggcaggga catataccgt tccctgatac 600

tcaccaggca tcacggcaat atactggcgc ttgttggtac gcttgataat tgccgcatct 660

accgccgcct gaatcgtgct atgcgttaca ccttgagtgc ccgccgggcc gacaacaaag 720

tcaggttgcg caggcagggt aatcggggaa ggattccacg ctgcagcacc tggtgtcagg 780

gatgcaaaat agtgttgagc atcgaaattc tgcgcttctt ttgccgacag aatcgggcga 840

gaagaggtac caggcgcggt ttgatcagaa ggacgttgat cgggcggggt tgagctacag 900

gcggtcagcg tcacgccaaa agccaatgcc agcgccagac gcgaaactga aaatgtgttc 960

acaggttgct ccgggctatg aaatagaaaa atgaatccgt tgaagcctgc ttttttgatc 1020

tctccttcac agattcccaa tctcttgtta aataacgaaa aagcatcaat taaaacggcg 1080

gcatgtcttt ctatattcca gcaatgtttt ataggggaca tattgatgaa gatgggtatc 1140

accttagtaa aaaaaaagaa ttgctataag ctgctctttt ttgttcgtga tatactgata 1200

ataaattgaa ttttcacact tctggaaaaa ggagatatac catggctatg agcaaaggag 1260

aagaactttt cactggagtt gtcccaattc ttgttgaatt agatggtgat gttaatgggc 1320

acaaattttc tgtccgtgga gagggtgaag gtgatgctac aaacggaaaa ctcaccctta 1380

aatttatttg cactactgga aaactacctg ttccgtggcc aacacttgtc actactctga 1440

cctatggtgt tcaatgcttt tcccgttatc cggatcacat gaaacggcat gactttttca 1500

agagtgccat gcccgaaggt tatgtacagg aacgcactat atctttcaaa gatgacggga 1560

cctacaagac gcgtgctgaa gtcaagtttg aaggtgatac ccttgttaat cgtatcgagt 1620

taaagggtat tgattttaaa gaagatggaa acattcttgg acacaaactc gagtacaact 1680

ttaactcaca caatgtatac atcacggcag acaaacaaaa gaatggaatc aaagctaact 1740

tcaaaattcg ccacaacgtt gaagatggtt ccgttcaact agcagaccat tatcaacaaa 1800

atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagacaa ccattacctg tcgacacaat 1860

ctgtcctttc gaaagatccc aacgaaaagc gtgaccacat ggtccttctt gagtttgtaa 1920

ctgctgctgg gattacacat ggcatggatg agctctacaa atagtctaga gtcgacctgc 1980

aggcatgcct cgagggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta 2040

aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg 2100

tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg 2160

ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg 2220

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 2280

aatatactaa cttgagcgaa acgggaaggt aaaaagacaa aaagttgttt ttaatacctt 2340

taagtgatac cagatgccat tgcgccatct ggcagagtga ttaactaaac atcgcagtaa 2400

tcgagccgct tgccagagag tggaaatgaa cgttaaaccc gaccatcgcg ccgctggcac 2460

cttcatcgac atcaatacgt tctatatcca gcgcgtgaac ggtaaaaatg tagcgatgag 2520

tttcgccttt cggcggtgct gcgccatcgt acccggtttt accaaagtcg gtacgcgtct 2580

gcaaaacgcc gtctggcatt gctaccagac cagagccaaa cccttgcggt aatacgcggg 2640

tatcagcggg taagttaaca actacccagt gccaccagcc ggagccggtt ggcgcatccg 2700

ggtcgtagca ggtgacaaca aaacttttcg ttcccgcagg aacatcatcc cacgccagat 2760

gcggtgaaat attatcgcca tcgtaaccca tgccgttaaa gacatgacga tgcggcaatt 2820

tatcgccatc gcgcagatcg ttactgatga gtttcatgaa ccctcctttc ttgtttgcag 2880

aaagtgtagc cagaaaccct cacgcggact tctcgttatt ggcaaaaaaa tgtttcatcc 2940

tgtaccgcgc ggttaaccgc tgcggtcaga cgctgcaact gttgcgggag aataatatag 3000

ggcggcatca ggtaaatcag tttgccaaaa ggccggatcc agacaccctg ttcgacaaag 3060

aatttttgca gcgccgccat attcaccgga tgagtggttt cgaccacgcc aatggccccc 3120

agtacgcgca catcggcaac catttcggca tcacgggcgg gggcaagttg ctcgcgcagc 3180

tgtacttcaa tatccgccac ctgttgctgc cagtcgccag attcgagaat cgccaggctg 3240

gcgtttgctg ccgcgcaggc cagcggattg cccataaaag ttggcccatg cata 3294

<210> 2

<211> 1267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caattaaaac 60

ggcggcatgt ctttctatat tccagcaatg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120

tatcacctta gtaaaaaaaa agaattgcta taagctgctc ttttttgttc gtgatatact 180

gataataaat tgaattttca cacttctgga aaaaggagat ataccatggc tatgagcaaa 240

ggagaagaac ttttcactgg agttgtccca attcttgttg aattagatgg tgatgttaat 300

gggcacaaat tttctgtccg tggagagggt gaaggtgatg ctacaaacgg aaaactcacc 360

cttaaattta tttgcactac tggaaaacta cctgttccgt ggccaacact tgtcactact 420

ctgacctatg gtgttcaatg cttttcccgt tatccggatc acatgaaacg gcatgacttt 480

ttcaagagtg ccatgcccga aggttatgta caggaacgca ctatatcttt caaagatgac 540

gggacctaca agacgcgtgc tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatcgtatc 600

gagttaaagg gtattgattt taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa actcgagtac 660

aactttaact cacacaatgt atacatcacg gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagct 720

aacttcaaaa ttcgccacaa cgttgaagat ggttccgttc aactagcaga ccattatcaa 780

caaaatactc caattggcga tggccctgtc cttttaccag acaaccatta cctgtcgaca 840

caatctgtcc tttcgaaaga tcccaacgaa aagcgtgacc acatggtcct tcttgagttt 900

gtaactgctg ctgggattac acatggcatg gatgagctct acaaatagtc tagagtcgac 960

ctgcaggcat gcctcgaggg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 1020

attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 1080

gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 1140

gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 1200

gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 1260

gacaaat 1267

<210> 3

<211> 2039

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 60

aagggatttt ggtcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt 120

gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctctaggc cgcgattaaa ttccaacatg 180

gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 240

atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 300

agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg 360

cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact 420

gcgatccccg ggaaaacagc attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat 480

attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt 540

ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt 600

ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg 660

aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc 720

tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 780

gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 840

tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 900

aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaag aattaattca tgagcggata 960

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 1020

agtgccacct gaacaactta tatcgtatgg ggctgacttc aggtgctaca tttgaagaga 1080

taaattgcac tgaaatctag aaatatttta tctgattaat aagatgatct tcttgagatc 1140

gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg cagggcggtt 1200

tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt ggaggagcgt 1260

aagagatctt ctgagatcgt ttggtctgcg cgtaatttct gctttgaaaa cgaaaaaccg 1320

ccttgcaggg cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac cgaggtaact 1380

gcttggagga gcgcagtcac caaaacttgt cctttcagtt tagccttaac cggcgcatga 1440

cttcaagact aactcctcta aatcaattac cagtggctgc tgccagtggt gcttttgcat 1500

gtctttccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcggactgaa 1560

cggggggttc gtgcatacag tccagcttgg agcgaactgc ctacccggaa ctgagtgtca 1620

ggcgtggaat gagacaaacg cggccataac agcggaatga caccggtaaa ccgaaaggca 1680

ggaacaggag agcgcacgag ggagccgcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 1740

gtcgggtttc gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc aggggggcgg 1800

agcctatgga aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt atcttcctgg 1860

catcttccag gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc agtcgaacga 1920

ccgagcgtag cgagtcagtg agcgaggaag cggaacatat gcctagggga tccggtaccg 1980

actagtgaat tcctcgaggt cgacctcaga agcttagatc tattaccctg ttatcccta 2039

<210> 4

<211> 680

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgagatcgt tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca 60

gggcggtttt tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta actggcttgg 120

aggagcgtaa gagatcttct gagatcgttt ggtctgcgcg taatttctgc tttgaaaacg 180

aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg 240

aggtaactgc ttggaggagc gcagtcacca aaacttgtcc tttcagttta gccttaaccg 300

gcgcatgact tcaagactaa ctcctctaaa tcaattacca gtggctgctg ccagtggtgc 360

ttttgcatgt ctttccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 420

ggactgaacg gggggttcgt gcatacagtc cagcttggag cgaactgcct acccggaact 480

gagtgtcagg cgtggaatga gacaaacgcg gccataacag cggaatgaca ccggtaaacc 540

gaaaggcagg aacaggagag cgcacgaggg agccgccagg gggaaacgcc tggtatcttt 600

atagtcctgt cgggtttcgc caccactgat ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag 660

gggggcggag cctatggaaa 680

<210> 5

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat 60

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300

atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540

gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816

<210> 6

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atatgcctag gggatccggt accgactagt gaattcctcg aggtcgacct cagaagctta 60

gatctattac cctgttat 78

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgccaccat caagggaaag cc 22

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tattatcagt atatcacgaa caaaaaagag cagcttatag caatt 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgctctcct gagtaggaca aatatactaa cttgagcgaa acggg 45

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcatctggcg tgggatgatg ttcct 25

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatccgttga agcctgcttt tttgatctct ccttcacaga ttccc 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccgtttcgc tcaagttagt atatttgtcc tactcaggag agcgt 45

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcgccgcga ccagaaacga tat 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtcgaaacc actcatccgg tga 23