维甲酸诱导基因I在癌症治疗中的应用

摘要

本发明涉及维甲酸诱导基因I在癌症治疗中的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开了维甲酸诱导基因I在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用；在制备用于肿瘤治疗的T细胞中的应用；在制备用于提高免疫力的药物中的应用；上述应用涉及抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

说明书

技术领域

本发明涉及维甲酸诱导基因I在癌症治疗中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

近年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，成为肿瘤治疗领域的热点和突破口。肿瘤免疫治疗代表了肿瘤细胞特异性靶向作用的一个选项，相对于传统放疗、化疗而言最大限度地减少了副作用。肿瘤免疫疗法包括免疫细胞治疗、免疫检查点抑制剂、细胞因子、细胞疫苗等。嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T 细胞)疗法是一种新型的细胞疗法，主要通过基因工程技术人工改造肿瘤患者的 T细胞，在体外大量培养后生成肿瘤特异性CAR-T细胞，再将其回输至患者体内用以攻击癌细胞，但是由于CART细胞在体内持续时间短、肿瘤抑制性微环境导致CART细胞浸润减少而限制了其应用。现有免疫检查点抑制剂主要包括抗PD-1 抗体、抗PD-L1抗体和CTLA-4抗体治疗肿瘤，但长期使用抗体治疗副作用比较大，易出现耐药性，抗肿瘤效果不显著。因此，免疫治疗亦亟需新的靶点来突破目前的困局。

维甲酸诱导基因-I(Rig-I)是Rig-I样受体(RLR)家族的创始成员，该家族是病毒RNA的病原体模式识别受体(PRR)的一个亚群。Rig-I以两种方式发挥作用：1.在被其同源RNA配体引发时，触发先天免疫反应，并在无外源RNA刺激条件下调节多种基本细胞过程。2.在第一个生物学环境中，在外源RNA配体引发后，先天免疫休眠的细胞质Rig-I将经历一系列结构改变，从而显露其用于去磷酸化和K63泛素化的N末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)，最终通过激活 TRAF、IRF3/7和NF-kΒ途径等，激活I/III型IFN或其他促炎细胞因子的转录激活。相反，越来越多的证据表明无病毒刺激下的Rig-I在功能上是惰性的，但在调节正常和恶性骨髓和肝细胞的增殖和分化、细菌的吞噬作用和免疫细胞的迁移等方面具有关键作用。除此以外，我们之前的研究也已经发现敲低RIG-I使调节性T细胞(Treg)的数量减少，功能受损。Tregs是抑制性肿瘤免疫微环境的重要组成部分，因此RIG-I可能通过改善肿瘤免疫微环境来发挥抗肿瘤作用。然而，关于RIG-I对CD8

发明内容

本发明的目的是为解决维甲酸诱导基因I在癌症治疗中如何应用的技术问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供维甲酸诱导基因I在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。

优选地，所述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达。

优选地，所述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

本发明提供维甲酸诱导基因I在制备用于肿瘤治疗的T细胞中的应用。

优选地，所述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达。

优选地，所述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

本发明提供维甲酸诱导基因I在制备用于提高免疫力的药物中的应用。

优选地，所述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达。

优选地，所述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

鉴于目前肿瘤免疫治疗中存在的瓶颈，本发明的目的在于提供了一种维甲酸诱导基因I(RIG-I)作为靶点在肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明的另一目的是提供一种T细胞，该T细胞通过敲低RIG-I后，肿瘤杀伤功能增强。

本发明的另一个目的是提供一种增强T细胞功能用于癌症治疗的方法。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明聚焦最前沿的肿瘤免疫治疗方法，以RIG-I为靶点，对CD8

附图说明

图1为实施例1中肿瘤大小及重量统计结果。

图2为实施例1中肿瘤组织浸润性淋巴细胞数量统计结果。

图3为实施例2中各组肿瘤生长结果。

图4为实施例3中RIG-I-shRNA质粒图谱。

图5为实施例3流式细胞技术检测shRNA的感染效率。

图6为实施例3Western blot检测RIG-I的敲低效果。

图7为实施例4流式细胞技术检测MC38-OVA细胞系的构建效率。

图8为实施例5细胞杀伤功能结果。

图9为实施例6动物实验设计流程图。

图10为实施例6肿瘤大小统计结果。

图11为实施例7肿瘤组织中CD8

图12为实施例7敲低RIG-I后肿瘤组织中CD8

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

本发明所采取的技术方案是提供维甲酸诱导基因I在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。

上述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达。

上述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

本发明提供维甲酸诱导基因I在制备用于肿瘤治疗的T细胞中的应用。

上述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达。

上述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

本发明提供维甲酸诱导基因I在制备用于提高免疫力的药物中的应用。

上述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达。

上述应用包括抑制维甲酸诱导基因I表达，提高CD8

本发明的目的在于提供了一种维甲酸诱导基因I(RIG-I)作为靶点在肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明的另一目的是提供一种T细胞，该T细胞通过敲低RIG-I后，肿瘤杀伤功能增强。

本发明的另一个目的是提供一种增强T细胞功能用于癌症治疗的方法。

实施例1

RIG-I敲除小鼠中，肿瘤细胞生长明显减缓，肿瘤浸润性效应T细胞增多。

1.1动物模型建立：

复苏肿瘤细胞株MC38(结肠癌细胞系，贴壁细胞)，传2-3代，观察细胞状态；

若细胞状态良好，则收集肿瘤细胞系，PBS洗2次，以一定的细胞浓度重悬细胞(每只小鼠细胞悬液注射量为200μl，细胞总量2×10

用剃毛器将小鼠腹股沟处的毛发剃掉，便于之后皮下注射与肿瘤观察测量；

用1ml胰岛素针吸取混匀的肿瘤细胞系，在WT(wild type，野生型)或RIG-I 敲除雌性小鼠两乳头连线中点与右乳头的中间点斜45度进针，突破皮内阻力后将针头平行推入1-2cm，缓慢将肿瘤细胞注射入皮下；

如观察到注射点凸起包块则表示皮下注射成功，此时缓慢平行拔针，用干棉球按压进针口10s左右；

每天持续观察小鼠状态以及腹股沟处，若能用肉眼看到肿瘤凸起，则开始用游标卡尺测量肿瘤的长与宽；

每2-3d统计一次肿瘤大小，记录，直至肿瘤负荷过大导致小鼠运动受阻为止，处死小鼠，收集肿瘤细胞；

统计小鼠肿瘤生长曲线，肿瘤体积计算公式为体积＝长×宽2/2。

实验结果发现，RIG-I敲除小鼠，肿瘤生长明显减缓。

1.2分离肿瘤组织TILs(肿瘤浸润性淋巴细胞，Tumor InfiltratingLymphocytes,TILs)：

用剪刀沿着肿瘤边缘将肿瘤细胞从小鼠腹股沟处分离，小心将黏附的表皮与毛发去掉；

将肿瘤用PBS冲洗2次，置于5ml D-Hanks液中剪碎成小于1mm的碎片；

将剪好的肿瘤碎片转移至50ml离心管中，加入37℃预热的550μl50×胶原酶IV(终浓度0.5mg/ml)及25μlDNA酶I(200U/ml)，用37℃预热的D-Hanks 液将总体积补足25ml，37℃摇床15-30min(最低转速，将50ml离心管水平放置以充分混匀)；

反复吹吸肿瘤消化悬液，50g×10min室温离心，弃肿瘤碎片等沉淀，收集上清；5.200g×5min室温离心，弃上清收集肿瘤细胞，10mlwash buffer清洗一遍，200g×5min室温离心；

1×裂红液裂解红细胞，200g×5min室温离心，去上清收集肿瘤细胞沉淀；

肿瘤细胞用15ml40％percoll重悬并充分混匀后，直接用5ml移液枪插入管底并缓慢加入15ml80％percoll(缓慢加入，切忌产生气泡影响分层)；

500g×30min室温离心(升速：5；降速：5)；

1ml移液器小心吸出中间层淋巴细胞，用40μm滤器过滤至50ml离心管， Washbuffer冲洗滤器，500g×10min室温离心收集TILs；

1.3细胞表面抗体染色：

将上述分选的细胞，每1×10

按照流式抗体说明书加入5ulCD3、CD4或CD8抗体，充分混匀；

冰上避光静置20-30min，期间小心混匀一次；

2000rpm离心5min收集细胞沉淀，用100-200μl流式液重悬细胞；

40μm滤膜过滤，上机检测并计数。

结果表明，RIG-I敲除小鼠，CD3及CD8

如图1所示，RIG-I敲除小鼠肿瘤生长明显减缓，

如图2所示，RIG-I敲除后，肿瘤组织内CD3及CD8

实施例1总结：在已有的RIG-I敲除小鼠及野生型小鼠内构建肿瘤生长模型，观察肿瘤生长大小及进行称重，发现RIG-I缺失后，肿瘤生长减缓、重量减轻。对其肿瘤组织浸润性淋巴细胞进一步分析，发现RIG-I缺失后，CD3及CD8

实施例2

CD8

动物模型构建；

将1×10

结果表明，CD8+T细胞是RIG-I敲除小鼠体内的效应靶细胞

如图3所示，为小鼠抗体中和实验示意图及结果；

实验结果提示，只有将CD8

实施例2总结：分别将CD4、CD8或NK1.1中和抗体或IgG对照抗体腹膜内注射到荷瘤小鼠中，以清除小鼠体内的CD4/CD8/NK细胞，观察RIG-I敲除小鼠的肿瘤生长情况。结果表明，只有将CD8

实施例3

RIG-I敲低CD8 T细胞的构建

3.1RIG-I-shRNA转染CD8

RIG-I-shRNA慢病毒委托纽赫生物科技(上海)有限公司构建并包装。质粒构建信息如图4所示。合成sh1、sh2、sh3序列至pNHrv-U6-zsgreen-puro载体中，酶切位点：HpaI和XhoI。

pNHrv-U6-zsgreen-puro-mDdx58-sh1序列：

GTTAACCCACAGTTGATCCAAATGATACTCGAGTATCATTTGGATCAACTGTGGTTTTTTCTCGA G

pNHrv-U6-zsgreen-puro-mDdx58-sh2序列：

GTTAACCAAGCATTCAGAGACTATATCCTCGAGGATATAGTCTCTGAATGCTTGTTTTTTCTCGA G

pNHrv-U6-zsgreen-puro-mDdx58-sh3序列：

GTTAACACTGGAACAGGTCGTTTATAACTCGAGTTATAAACGACCTGTTCCAGTTTTTTTCTCGA G

3.2CD8

颈椎脱臼处死OT-1小鼠，分离小鼠脾脏并碾磨成单细胞悬液，使用45um Strainer过滤后，1000转离心5min后再次用含有10％FBS的DMEM培养液重悬。

使用CD8 T细胞阴选试剂盒(STEMCELL,19853)分选CD8 T细胞，约 5×10^5/mL重悬，加入anti-CD3(2μg/mL；clone 145-2C11；eBioscience) 及anti-CD28(2μg/mL；clone37.51；eBioscience)预包被细胞培养平板中刺激过夜。

细胞活化后，加入Rig-I shRNA或GFP的慢病毒，MOI＝20，感染后20h换液，约48h上机分选GFP阳性细胞检测敲低效率及进行后续实验。

3.3Western Blot：

将蛋白裂解液加入上述分选的细胞进行裂解，用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳、转模、封闭后，依次孵育一抗、二抗。最后在凝胶电泳成像系统中用ECL显色液进行曝片，曝光后用ImageJ软件定量蛋白表达量，不同组组织蛋白表达量分别与正常对照组进行比较，内参为β-actin。

流式结果显示RIG-I-shRNA2的转染效率，Western Blot结果也显示 RIG-I-shRNA2敲低RIGI的效率最高。

如图4所示为RIG-I-shRNA质粒构建图谱；

如图5所示为流式细胞术检测RIG-I-shRNA转染效率；

如图6所示为蛋白水平Western Blot检测RIG-I-shRNA敲低RIG-I的效果；

实施例3总结：实施例3为RIG-I敲低CD8 T细胞的构建：抑制或沉默RIG-I 表达的物质为抑制或沉默RIG-I表达的慢病毒Lenti-virus。采用流式细胞分选技术将OT-1小鼠脾脏中的CD8

实施例4

肿瘤稳转细胞株MC38-OVA构建：

将OVA cDNA克隆到共表达Puro的慢病毒质粒中以产生慢病毒。

每10cm培养皿中加入含有10ml含有10％FBS的DMEM培养液，加入1*10^6MC38 细胞后，放置在含有5％CO

流式细胞技术检测OVA的转染效率，表明MC38-OVA稳转细胞株构建完成。

如图7所示为流式细胞技术检测MC38-OVA细胞系的构建效率。

实施例4总结：实施例4为肿瘤细胞株MC38-OVA构建；

获得MC38-OVA细胞系。

实施例5

体外CD8

5.1CD8

颈椎脱臼处死OT-1小鼠，分离小鼠脾脏并碾磨成单细胞悬液，使用45um Strainer过滤后，1000转离心5min后再次用含有10％FBS的DMEM培养液重悬。

使用CD8 T细胞阴选试剂盒(STEMCELL,19853)分选CD8 T细胞，约 5×10^5/mL重悬，加入anti-CD3(2μg/mL；clone 145-2C11；eBioscience) 及anti-CD28(2μg/mL；clone37.51；eBioscience)预包被细胞培养平板中刺激过夜。

细胞活化后，加入Rig-I shRNA或GFP的慢病毒，MOI＝20，感染后20h换液，约48h上机分选GFP阳性细胞。

在上述转有Rig-I shRNA或GFP的慢病毒的CD8

5.2细胞凋亡检测步骤：

收集目的细胞，每1×10

每个样本加入5μl的Annexin-V-APC抗体，充分混匀后冰上静置20 min，期间小心混匀一次；

2000rpm离心5min收集细胞沉淀，再用1×Binding Buffer重悬洗涤一次；

每个样本加入5μl的7-AAD，充分混匀后于冰上放置15min，无需离心洗涤，可直接40μm滤膜过滤后上机检测。

细胞凋亡检测结果表明RIG-I敲低后的CD8

如图8所示为体外杀伤功能实验结果。

实施例5总结：实施例5为体外CD8

实施例6

体内实验验证RIG-I敲低后T细胞对肿瘤生长影响：

整体的动物实验流程图如图9所示。

动物模型建立：

复苏肿瘤细胞株MC38-OVA，传2-3代，观察细胞状态；

若细胞状态良好，则收集肿瘤细胞系，PBS洗2次，按照实施例1中的步骤以一定的细胞浓度重悬细胞(每只小鼠细胞悬液注射量为200μl，细胞总量 2×10

7天后将上述3构建好的2×10

每2-3d统计一次肿瘤大小，记录，直至肿瘤负荷过大导致小鼠运动受阻为止，处死小鼠，收集肿瘤细胞；

统计小鼠肿瘤生长曲线，肿瘤体积计算公式为体积＝长×宽2/2。

实验结果表明RIG-I敲低后，肿瘤生长明显减缓，肿瘤重量显著减轻。

如图9所示为小鼠模型构建流程图。

如图10所示为小鼠模型肿瘤大小统计结果。

实施例6总结：实施例6进行的体内实验验证RIG-I敲低后T细胞对肿瘤生长影响；采用皮下注射的方式，将2×10

实施例7

验证RIG-I敲低后对CD8

7.1分离肿瘤组织TILs：

按照上述实施例1中的方法分离肿瘤组织浸润性淋巴细胞。

7.2细胞表面抗体染色：将上述分选的细胞，每1×10

按照流式抗体说明书加入5ulCD107a抗体，充分混匀；

冰上避光静置20-30min，期间小心混匀一次；

2000rpm离心5min收集细胞沉淀，用100-200μl流式液重悬细胞；

40μm滤膜过滤，上机检测。

7.3胞内细胞因子检测：

将上述分选的CD8

收集目的细胞，加入固定透化液(按照1:3的比例配置固定透化液，即20μlFixation/Permeabilization Concentrate+60μl Fixation/PermeabilizationDiluent)，充分混匀，室温避光30-40min，期间小心混匀一次；

2000rpm离心5min收集细胞沉淀，用200μl透化液(1×Permeabilization Buffer)洗一次；

200μl透化液重悬细胞，按照流式抗体说明书加入5ul IFNγ抗体，混匀，室温静置30-40min，期间小心混匀一次；

2000rpm离心5min收集细胞沉淀，200μl透化液洗涤一次；

100-200μl流式液重悬，40μm滤膜过滤，上机检测。

实验结果表明RIG-I敲低后肿瘤组织中CD8

如图11所示为肿瘤组织中肿瘤浸润性淋巴细胞数量统计。

如图12所示为敲低RIG-I后肿瘤浸润性CD8

实施例7总结：实施例7验证了RIG-I敲低后对CD8

综上所述，本发明首次发现RIG-I可以作为肿瘤免疫治疗的一个新靶点，不仅因为RIG-I可以改变肿瘤免疫抑制性微环境，更在于RIG-I的缺失可以内源性加强CD8

本发明聚焦最前沿的肿瘤免疫治疗方法，以RIG-I为靶点，对CD8

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。