一种检测亚硫酸氢根离子的荧光探针及其制备和在食品检测中的应用

摘要

本申请公开一种检测亚硫酸氢根离子的荧光探针及其制备和在食品检测中的应用，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：

说明书

技术领域

本申请涉及小分子荧光探针领域，尤其涉及一种高信噪比的亚硫酸氢根离子荧光探针及其制备和在食品检测中的应用。

背景技术

众所周知，亚硫酸氢根离子(HSO

然而，越来越多的证据表明，异常的亚硫酸氢根离子浓度与心血管疾病和许多神经系统疾病有关，严重的甚至危害到人的健康。许多国家都严格控制食品和药品中亚硫酸氢根离子的阈值。因此，开发具有良好选择性和高信噪比的亚硫酸氢根离子的监测方法是迫切需要的。

发明内容

本申请提供一种新型高信噪比的亚硫酸氢根离子荧光探针，与已报道的其他亚硫酸氢根离子探针不同的是，本申请所述的探针与亚硫酸氢根离子发生加成反应后，产物包含两个结构相似的萘胺衍生物，从而实现荧光强度双增强的效果，提高了探针检测亚硫酸氢根离子的信噪比。

一种检测亚硫酸根离子的荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：

一种如所述的荧光探针的制备方法，包括：

将化合物(2)、化合物(3)、乙醇及哌啶混合得混合物，在氮气保护下将混合物加热得反应液；将反应液旋干并分离纯化，得到结构式如式(I)所示的荧光探针；

可选的，所述化合物(2)、化合物(3)和哌啶的摩尔比为1：1～1.2：0.1。

可选的，氮气保护下将混合物加热的反应条件为：60～80℃反应6～10小时。

可选的，所述分离纯化方法可如下：将反应液减压浓缩，利用硅胶柱层析法进行分离纯化，所用洗脱液为体积比为20：1的二氯甲烷：甲醇，得到所述的荧光探针(I)。

本申请化合物(2)为购买所得。

本发明化合物(3)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Zhu L,Fu M,Yin B,et al.A red-emitting fluorescent probe for mitochondria-target microviscosityin living cells and blood viscosity detection in hyperglycemia mice[J].Dyesand Pigments,2020,172:107859)。

本申请的高信噪比荧光探针与亚硫酸氢根离子发生加成反应后，探针分子的共轭体系被破坏，生成具有两个萘胺类衍生物的产物，从而达到蓝色荧光信号由关到开的效果。因此，本申请的荧光探针可应用于定性或定量检测溶液的亚硫酸氢根离子浓度，检测反应的过程如下：

基于此功能特性，本申请还提供该荧光探针在检测亚硫酸氢根离子浓度中的用途：

一种如所述的荧光探针在制备检测亚硫酸氢根离子浓度的产品中的用途。

可选的，所述产品为试纸条或试剂盒。

一种检测亚硫酸根离子的试剂盒，包括如结构式(I)所示的荧光探针。

一种如所述的荧光探针或所述的试剂盒在食品亚硫酸氢根离子浓度检测中的用途。

一种食品中亚硫酸氢根离子浓度的定量检测方法，包括：

将所述的荧光荧光探针加入待测溶液，混合反应，反应结束后在激发波长为320nm、发射波长为475nm下检测反应液的荧光强度值，代入标准曲线，计算得到待测溶液中亚硫酸氢根离子浓度。

可选的，所述待测溶液中荧光探针的浓度与亚硫酸氢根离子浓度的比按5μM：0～3μM计。该配比范围下，荧光强度值与待测溶液中亚硫酸氢根离子浓度呈线性关系。

具体的，所述标准曲线的制备如下：

将5μM荧光探针分别与亚硫酸氢根离子在0～3μM内的溶液中，激发波长为320nm、发射波长为475nm下采集溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标、溶液亚硫酸氢根离子为横坐标，绘制即得线性标准曲线。

可选的，线性标准曲线的线性方程为：F＝254.19c+24.819(R

可选的，检测待测液亚硫酸根离子浓度时，溶液的pH值为7.4。

相比于其他检测方法，荧光探针由于其制备方法简单和检测速度快等优点，被用于食品中的亚硫酸氢根离子成分检测。研究并开发新型高信噪比的亚硫酸氢根离子的新型荧光探针，具有迫切的现实意义

相比于现有技术，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明提供的荧光探针制备方法简单；

(2)本申请的荧光特征提高了探针检测亚硫酸氢根离子的信噪比，并可用于检测食品样品中亚硫酸氢根离子的浓度；

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针(I)的核磁氢谱。

图2为实施例1制备的荧光探针(I)的核磁碳谱。

图3为实施例1制备的探针(I)在pH为7.4条件下与亚硫酸氢根离子反应的荧光强度随亚硫酸氢根离子浓度的变化图。

图4为实施例1制备的探针(I)在激发波长为320nm、发射波长为475nm时的标准曲线图。

图5为实施例1制备的探针(I)在激发波长为320nm、发射波长为475nm时的抗干扰能力测试图。。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

实施例1：高信噪比的荧光探针(I)的制备

将化合物(2)(0.5mmol)和化合物(3)(0.5mmol)置于圆底烧瓶中，随后加入5mL乙腈和哌啶(0.05mmol)，在氮气保护下将混合物加热8小时，反应温度为70℃。将反应液旋干并用硅胶柱层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷：甲醇为20:1(体积比)，制备得到高信噪比的荧光探针(I)(0.1g，产率为39.5％)。

合成路线：

该高信噪比荧光探针(I)的核磁氢谱如图1所示，核磁碳谱如图2所示。

实施例2：荧光探针(I)(实施例1制备)在pH为7.4条件下与亚硫酸氢根离子反应的荧光强度随亚硫酸氢根离子浓度的变化。

准确称取一定量的荧光探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.5mM的探针母液，移液枪吸取10μL加入到0.49mL含有不同浓度的亚硫酸氢根离子的PBS缓冲液(最终亚硫酸根离子的值分别0μM，0.6μM，0.8μM，1μM，1.5μM，2μM，2.5μM，3μM，4μM，5μM，8μM，10μM，15μM，20μM，30μM，40μM，50μM，80μM，100μM)，加入到96孔板中，采用多功能酶标仪测定化合物(I)的荧光发射光谱。

由图3可知，在以320nm波长激发时，在PBS缓冲液中，荧光探针(I)在420-560nm范围内无发射峰；随着亚硫酸氢根浓度升高，荧光探针(I)在420-560nm处的发射强度增强，说明探针对亚硫酸根离子具有识别能力。激发波长为320nm的条件下，随着溶液中亚硫酸氢根离子浓度由0μM提高至100μM时，475nm处的荧光强度值增强了约350倍，符合高信噪比检测的现象。

另外，激发波长为320nm的条件下，以475nm处的荧光强度值的数值为纵坐标，亚硫酸根离子浓度为横坐标，绘制即得线性标准曲线，标准曲线见图4。由线性关系图可以发现，在亚硫酸根离子浓度为0-3μM的范围内，两者具有很好的线性关系，线性方程：F＝254.19c+24.819(R

实施例3：荧光探针(I)(实施例1制备)的抗干扰能力的测试。

准确称取一定量的荧光探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.5mM的探针母液，移液枪吸取10μL加入到0.49mL含有不同被分析物的PBS溶液中(1-17分别为亚硫酸氢根离子、钾离子、铜离子、镁离子、锌离子、氟离子、碘离子、亚硝酸根离子、乙酸根离子、钙离子、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、DL-高半胱氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸，最终浓度均为100μM)，用多功能酶标仪测试其在475nm下荧光强度，其中荧光激发波长为320nm。

荧光图谱见图5。实验结果表明，除了亚硫酸氢根离子，其它被分析物的加入对探针(I)的荧光强度影响很小，证明探针具有很好的抗干扰能力。

实施例4：荧光探针(I)(实施例1制备)在食品样品中的检测应用。

为了研究探针(I)在食品领域中的应用，本申请将探针应用到白砂糖中亚硫酸氢根离子的含量测试。首先，准确称取1g白砂糖并将其溶解于100mL缓冲液中(pH＝7.4的PBS缓冲液)，移液枪吸取250μL的缓和液和240μL缓冲液混匀，然后加入10μL浓度为0.5mM的探针母液，待一段时间后进行测试475nm处的荧光强度，并根据图4的线性标准曲线计算溶液中亚硫酸氢根离子的含量。实际测得白砂糖中亚硫酸氢钠的浓度为0.524μM。另外，通过加标回收法向样品中加了2.0μM的亚硫酸氢根离子，其结果如表1所示。

表1探针1检测白砂糖中的亚硫酸氢根离子的含量

实验结果表明，探针(I)可用于检测食品中亚硫酸氢根离子的含量。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。