奥拉帕尼在诱导核仁应激中的应用

摘要

本发明涉及生物医药技术，尤其涉及奥拉帕尼在诱导核仁应激中的应用。具体地，本发明公开了奥拉帕尼通过抑制核糖体RNA(rRNA)前体的合成来触发核仁应激，从而增强核糖体蛋白(RP)RPL5和RPL11以及MDM2之间的相互作用，敲低RPL5和RPL11抑制了奥拉帕尼诱导的p53激活。奥拉帕尼通过激活p53能有效抑制乳腺癌和结直肠癌细胞的存活和增殖，同时揭示了奥拉帕尼的耐药性的潜在分子机制，也为使用核仁应激‑RPs‑p53轴为对奥拉帕尼耐药的癌症提供了有希望的治疗靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地涉及奥拉帕尼在诱导核仁应激中的应用。

背景技术

基因突变在肿瘤发生中起重要作用。几个DNA修复基因突变与许多不同类型的癌症起源密切相关。BRCA1和BRCA2都是涉及同源重组(HR)的著名且至关重要的DNA修复基因，它们被细胞广泛用于精确修复有害的双链DNA断裂。BRCA1/2的种系突变在乳腺癌、卵巢癌和许多其他癌症中高度流行，包括淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌等。多(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP)-1)是一种普遍存在的核酶，参与各种生物过程的调节，尤其在DNA修复、细胞周期、细胞凋亡等过程中。

最近，许多报告表明PARP在来自癌症患者的各种癌细胞系和肿瘤组织中显着上调。此外，越来越多的证据也表明，PARP是治疗包含BRCA1/2缺陷的肿瘤患者的关键目标。

在2014-2018年间，首个PARP抑制剂奥拉帕尼先后获批用于携带BRCA1/2突变的晚期卵巢癌和晚期乳腺癌患者治疗。研究者认为奥拉帕尼是通过不同的机制达到其治疗效果的。首先，已经提出PARPi通过阻止PARylation反应抑制癌细胞增殖。更重要的是，它可以将PARP-1蛋白捕获到DNA损伤位点，从而在PARP-1和染色质中的基因组DNA之间建立稳定的相互作用。随后，PARPi-PARP1-DNA复合物通过破坏复制叉的稳定性来干扰DNA复制，从而导致基因组不稳定和细胞死亡。然而，由于测量方法的原因，PARP-1捕获的定义是不准确的。直到最近，Zandarashvili等人通过使用氢/氘交换质谱结合X射线结构的方法揭示了PARPi与PARP-1结合的分子机理。他们发现PARPi扰乱了DNA断裂处的PARP-1变构。同源重组(HR)修复在基因组稳定性维持中起着关键的重要作用，同源重组缺陷(HRD)会损害基因组的稳定性，导致癌细胞丢失或抑制DNA修复蛋白PARP-14。因此，第二个公认的机制是，由于BRCA种系突变，Olaparib通过在HRD细胞中积累DNA损伤来引起合成致死。综上所述，所有这些发现表明Olaparib可能通过影响基因组稳定性来诱导细胞周期停滞和/或细胞凋亡。然而，其潜在分子机制仍未完全了解。

发明内容

本发明揭示了奥拉帕尼处理导致p53稳定并以剂量和时间依赖性方式激活其下游靶基因。机制研究发现，奥拉帕尼通过抑制核糖体RNA(rRNA)前体的合成来触发核仁应激，从而增强核糖体蛋白(RP)RPL5和RPL11以及MDM2之间的相互作用。敲低RPL5和RPL11抑制了奥拉帕尼诱导的p53激活。更重要的是，奥拉帕尼通过激活p53能有效抑制乳腺癌和结直肠癌细胞的存活和增殖。总之，本发明表明奥拉帕尼能激活核仁应激-核糖体蛋白-p53通路，并提示rRNA生物合成是PARPi的新靶点。

本发明的第一方面，提供了一种奥拉帕尼的用途，用于制备药物或试剂，所述药物或试剂用于选自下组的一种或多种用途：

(1)抑制rRNA前体合成；

(2)降低rRNA表达；

(3)诱导核仁应激；

(4)稳定或激活p53；

(5)增强核糖体蛋白(RP)RPL5和RPL11以及MDM2之间的相互作用；和/或

(6)杀伤携带野生型p53的癌细胞或治疗野生型p53的癌症。

在另一优选例中，所述试剂为实验试剂。

在另一优选例中，所述试剂作为阳性对照品用于：

(1)抑制rRNA前体合成；

(2)降低rRNA表达；

(3)诱导核仁应激；

(4)稳定或激活p53；

(5)增强核糖体蛋白(RP)RPL5和RPL11以及MDM2之间的相互作用；和/或

(6)杀伤携带野生型p53的癌细胞或治疗野生型p53的癌症。

在另一优选例中，所述诱导核仁应激是触发核仁应激或引起核仁应激反应。

在另一优选例中，所述癌细胞或癌症选自：卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、大肠癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、或其组合；优选地来自BRCA1/2缺陷的肿瘤。

本发明的第二方面，提供了一种抑制rRNA前体合成、降低rRNA表达或诱导核仁应激的方法，包括步骤：施用奥拉帕尼。

在另一优选例中，所述方法为体外非治疗性非诊断性的。

在另一优选例中，所述方法包括步骤给需要的对象施用奥拉帕尼，所述对象为体外培养的细胞、或哺乳动物模型。

在另一优选例中，所述方法包括步骤给需要的对象施用奥拉帕尼，所述对象为人或非人哺乳动物。

本发明的第三方面，提供了一种稳定或激活p53、或调控RPL5和RPL11以及MDM2之间相互作用、或杀伤携带野生型p53的癌细胞或治疗野生型p53的癌症的方法，包括步骤：施用奥拉帕尼。

本发明的第四方面，提供了一种rRNA前体、rRNA、核仁应激或其检测试剂的用途，用于制备检测奥拉帕尼耐药性的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的奥拉帕尼耐药性为癌症或癌症细胞对奥拉帕尼的耐药性。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测，优选地，所述的离体样本包括：血液样本、血清样本、组织样本、体液样本或其组合。

在另一优选例中，所述检测试剂包括检测rRNA前体水平、rRNA水平、核仁应激发生、RPL5和RPL11表达水平、和/或p53水平和活性的试剂。

在另一优选例中，所述检测试剂包括rRNA前体、rRNA、核仁应激的特异性结合分子、抗体、引物或引物对、探针或芯片(如核酸芯片或蛋白质芯片)。

在另一优选例中，所述的检测试剂偶联有或带有可检测标记，优选地，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述用途还包括用于预测奥拉帕尼耐药者的生存时间(预后)。

本发明的第五方面，提供了一种确定奥拉帕尼耐药性方法，所述方法包括检测核仁应激发生的步骤和/或检测rRNA前体或rRNA的含量的步骤。

在另一优选例中，所述方法为体外方法。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：(a)提供一待检测的离体肿瘤细胞；(b)检测所述细胞的核仁应激发生和/或检测rRNA前体或rRNA的含量。

在另一优选例中，所述方法为体外非治疗性非诊断性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1奥拉帕尼激活p53及其下游基因的表达。(A-B)奥拉帕尼处理可以在HCT116p53+/+中以剂量依赖的方式提高p53及其靶基因的蛋白质(A)和mRNA(B)水平。p53和p21的蛋白质水平通过免疫印迹分析(IB)进行测定。p53靶基因的mRNA水平通过使用qRT-PCR测量。(C-D)实验与(A-B)相同，不同之处在于细胞用的是Cal51，测量p53及其靶基因的蛋白质(C)和mRNA(D)水平。(E-F)HCT116p53+/+细胞用10μM的奥拉帕尼处理不同时间。p53及其靶基因的蛋白质(E)的IB分析和mRNA(F)水平的qRT-PCR分析。(G-H)实验与(E-F)相同，不同之处在于细胞用的是Cal51，测量p53及其靶基因的蛋白质(G)和mRNA(H)水平。*p<0.05

图2奥拉帕尼处理稳定p53。(A-B)HCT116p53+/+用10μM奥拉帕尼处理12小时，然后在收获前的不同时间点向培养基中加入放线菌酮。在相同的时间点收获细胞并通过免疫印迹分析(A)测定p53的水平，并用微管蛋白表达做对照对条带进行量化和标准化，并作图(B)。(C-D)实验与(A-B)相同，不同之处在于细胞用的是Cal51，IB分析结果(C)和条带被量化(D)。*p<0.05

图3奥拉帕尼治疗抑制前体rRNA合成。(A-B)HCT116p53+/+和(C-D)Cal51细胞用或不用10μM奥拉帕尼处理12小时。通过琼脂糖凝胶电泳分析5S、18S和28S rRNA的表达。(E)rRNAs的结构和用于qRT-PCR的引物设计的示意图。将HCT116p53+/+(F)和Cal51(G)的用或不用10μM奥拉帕尼处理24小时，然后使用扩增5'-ETS和18SrRNA之间的片段的两对引物通过qRT-PCR进行分析(112-bp)和18S rRNA和ITS-1(96-bp)之间的片段。

图4奥拉帕尼诱导的p53激活需要核糖体蛋白RPL5和RPL11。(A-B)HCT116p53+/+(A)和Cal51(B)细胞在有或没有scramble(作为对照)和RPL5 siRNA的情况下转染24小时，然后在收获前将细胞用或不使用10μM奥拉帕尼再处理24小时。免疫印迹(IB)分析p53、p21和RPL5的表达。(C-D)除了RPL5 siRNA用RPL11 siRNA代替外，其他实验与(A-B)相同，显示了HCT116p53+/+(C)和Cal51(D)的结果。

图5奥拉帕尼增强了MDM2与核糖体蛋白RPL5或RPL11的相互作用。(A)IB分析来自用或不用20μM奥拉帕尼处理24小时的Cal51细胞的全细胞裂解物(对照)和免疫沉淀物(IP)的MDM2和RPL5表达。(B)IB分析来自用或不用20μM奥拉帕尼处理24小时的Cal51细胞的全细胞裂解物(对照)和免疫沉淀物(IP)的MDM2和RPL11表达。

图6奥拉帕尼治疗抑制癌细胞生长并促进细胞凋亡。(A-B)奥拉帕尼处理后Cal51、HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞增殖的细胞活力测定分析。(C和E)通过流式细胞术(C)进行有或没有奥拉帕尼的Cal51治疗的细胞凋亡测定，计算细胞凋亡率(E)，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。(D和F)通过流式细胞术(D)进行有或没有奥拉帕尼处理的HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞的凋亡测定，计算细胞凋亡率(F)，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

图7奥拉帕尼通过核仁应激激活p53抑制肿瘤细胞增殖的机制示意图。正常情况下，核糖体中积累了核糖体蛋白(RPs)和前体rRNA合成，从而使MDM2与p53结合，泛素化降解p53使其维持在低水平。奥拉帕尼处理后，pre-rRNA合成受到抑制，因此包括RPL5和RPL11在内的RPs被释放到核质中与MDM2结合，导致p53从MDM2上解离不能被泛素化降解并维持其在相对较高的水平。

具体实施方式

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“调节”包括治疗、预防或干扰。

术语“诱导核仁应激”包括触发核仁应激反应。

术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的药物。本发明的治疗对象包括鼠、兔、猴、人及其他哺乳动物。

术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的药物的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随药物的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。

本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明药物(活性成分)及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的活性成分/剂，较佳地0.05-300mg的活性成分/剂，更佳地，含有0.5-200mg的活性成分/剂。

本发明的活性成分及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明的活性成分或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。活性成分的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。

“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

施用本发明组合物时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。

本发明组合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

含有本发明的组合物的微胶囊可用于本发明的活性成分的缓释给药。本发明的活性成分的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis,“Controlled release ofbioactive agents form lactide/glycolide polymer,”in:M.Chasin and R.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:NewYork,1990),pp.1-41))。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的活性成分适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明揭示了Olaparib处理导致p53稳定和其下游靶基因的激活。本发明还发现Olaparib通过抑制核糖体RNA(rRNA)前体的生物合成来触发核仁应激，增强了核糖体蛋白(RP)RPL5和RPL11与MDM2之间的相互作用。一致地，RPL5和RPL11的敲低阻止了Olaparib诱导的p53激活。值得注意的是，Olaparib通过激活p53有效抑制乳腺癌和结肠直肠癌细胞的存活和增殖。总之，本发明确定了核仁应激-RPs-p53轴在乳腺癌和结直肠癌对PARPi治疗的反应中的作用，并为使用PARPi提供了新的潜在治疗靶点。

通用方法

细胞培养和奥拉帕尼治疗

人结肠直肠癌细胞系HCT116p53+/+、HCT116p53-/-和乳腺癌细胞系Cal51在含有10％胎牛血清、50单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，并维持在37度在5％CO

siRNA和抗体

本文中使用siRN序列如下，siNC：UUCUCCGAACGUGUCACGU(SEQ ID NO.:17)，siRPL5：5'-GGAGGAGAUGUAUAAGAAATT-3'(SEQ ID NO.:18)；siRPL11：5'-GGAACUUCGCAUCCGCAAATT-3'(SEQ ID NO.:19)。所有siRNA均由Genepharma公司(中国上海)合成。各抗体，如抗p53(目录sc-126，Santa Cruz Biotechnology)、抗MDM2(目录#M4308，Sigma)、抗p21(目录#2947，Cell Signaling Technology)、抗RPL5(目录ab86863，Abcam)、抗-RPL11(Catalog ab79352,Abcam),anti-GAPDH(Catalog60004-1-Ig,Proteintech),anti-β-actin(Catalog ARG62346,Proteintech),anti-α-tubulin(Catalog66031-1-techIg,Protein)是商业购买的。

免疫印迹和免疫共沉淀分析

使用由50mM Tris/HCl(pH7.5)、0.5％Nonidet P-40(NP-40)、1mM EDTA、150mMNaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)组成的裂解缓冲液裂解细胞,10μM胃酶抑素A和1μg/ml亮抑酶肽。等量的60μg透明细胞裂解物用于免疫印迹分析。Co-IP测定是使用图例中所示的抗体进行的。简要来说，将1mg总蛋白与指定抗体在4℃下孵育过夜，然后加入蛋白A或G珠并将混合物在4℃下再孵育2小时。最后，用裂解缓冲液洗涤珠子五次。如结果图图例所示，通过IB和抗体检测结合的蛋白质。

逆转录和定量RT-PCR分析

根据试剂盒说明书，使用RNAiso Plus(Takara，大连，辽宁，中国)从细胞中分离总RNA。使用带有gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒(Takara，大连，辽宁，中国)，以1μg的总RNA作为模板进行逆转录反应。根据试剂盒的方案，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Novazyme，南京，中国)进行定量RT-PCR。使用以下引物如下：

肌动蛋白-F：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'(SEQ ID NO.:1),

肌动蛋白-R：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'(SEQ ID NO.:2),

Puma-F:5'-GACCTCAACGCACAGTACGAG-3'(SEQ ID NO.:3),

Puma-R:5'-AGGAGTCCCATGATGAGATTGT-3'(SEQ ID NO.:4),

BTG2-F:5'-ACGGGAAGGGAACCGACAT-3'(SEQ ID NO.:5),

BTG2-R:5'-CAGTGGTGTTTGTAGTGCTCTG-3'(SEQ ID NO.:6),

MDM2-F:5'-GAATCATCGGACTCAGGTACATC-3'(SEQ ID NO.:7),

MDM2-R:5'-TCCATTCTCTG-3'(SEQ ID NO.:8),

BAX-F:5'-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3'(SEQ ID NO.:9),

BAX-R:5'-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3'(SEQ ID NO.:10),

p21-F:5'-CTGGACTGTTTTCTCTCGGCTC-3'(SEQ ID NO.:11),

p21-R:5'-TGTATATTCAGCATTGTGGGAGGA-3'(SEQ ID NO.:12),

112-bp-F:5'-TGAGAAGACGGTCGAACTTG-3'(SEQ ID NO.:13),

112-bp-R:5'-TCCGGGCTCCGTTAATGATC-3'(SEQ ID NO.:14),

96-bp-F:5'-GGCCATACCACCCTGAACGC-3'(SEQ ID NO.:15),

96-bp-R:5'-CAGCACCCGGTATTCCCAGG-3'(SEQ ID NO.:16)。

112-bp pre-rRNA包含5'-外部转录序列(ETS)和18S rRNA。96-bp pre-rRNA片段是从18SrRNA到内部转录床序列(ITS)-128，所有引物均在GENEWIZ(中国苏州)合成。

RNA干扰

内源性RPL5和RPL11的RNA干扰介导的敲低按先前所述进行。根据制造商的方案，使用Hieff Trans脂质体转染试剂(Yeasen，上海，中国)将这些siRNA双链体引入细胞。转染细胞在收获前用或不用10μM/ml的Olaparib处理24小时。在转染后48小时收获细胞用于免疫印迹。

细胞活力测定

为了检测细胞的增殖，根据制造商的说明使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo Molecular Technologies,Japan)。简要来说，将每孔3000个细胞接种在含有Olaparib的96孔培养板中。细胞活力通过WST-8测定，每孔终浓度为10％，处理24小时使用微孔板读数器在450nm处测量样品的吸光度。

使用流式细胞术进行细胞凋亡分析

根据试剂盒说明书，使用膜联蛋白PE-V细胞凋亡检测试剂盒(Yeasen，上海，中国)通过流式细胞术分析细胞凋亡。如图图例所示，用奥拉帕尼处理细胞，然后将细胞用预冷PBS洗涤两次，再用1x结合缓冲液重新悬浮，并用Annexin V/PI试剂避光染色15分钟。在终止染色反应后立即通过流式细胞术分析细胞。

数据统计

使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。实验数据表示为至少三个独立实验的平均值±标准偏差(SD)。进行学生t检验或单向方差分析以评估两组或两组以上的差异。p<0.05被认为有统计显著性，星号以下列方式表示显着性：*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.PARP抑制剂Olaparib激活p53通路

评估p53在响应Olaparib治疗时的表达情况。人结肠直肠癌细胞系HCT116p53+/+、HCT116p53-/-和乳腺癌细胞系Cal51在含有10％胎牛血清、50单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，并维持在37度在5％CO

结果显示p53在Olaparib治疗的人结肠直肠癌细胞HCT116p53+/+和乳腺癌细胞Cal51中均上调(图1的A和C)。

为了确定激活p53所需的Olaparib的最小剂量，使用HCT116p53+/+和Cal51细胞系进行了Olaparib剂量依赖性的p53诱导测定实验。如图1的A和图1的C所示，免疫印迹分析结果表明Olaparib以剂量依赖性方式诱导p53和下游p21蛋白水平的表达，用于p53激活的Olaparib的最低剂量为10μM，但使用5μM或10μM的p53激活没有太大差异。

为了测试该抑制剂是否增强p53的转录活性，通过qRT-PCR检查了多个p53下游基因的mRNA表达。如图1的B和1的D所示，Olaparib以剂量依赖性方式激活HCT116p53+/+和Cal51细胞系中多个p53靶基因mRNA表达，包括p21、BAX、BTG2、MDM2和PUMA。

为了进一步探索Olaparib诱导的p53激活的动力学，还检查了用10μM的Olaparib处理后的时间依赖性调控。如图1的E和1的G所示，分别在HCT116p53+/+中处理8小时和Cal51处理后4小时发现p53和p21被诱导激活。与剂量依赖性方式一致，p53和p21的表达在Olaparib治疗后以时间依赖性方式上调(图1的E和1的G)。

此外，包括p21、BAX、BTG2、MDM2和PUMA等在内的多个p53靶基因在HCT116p53+/+和Cal51细胞系中以时间依赖性方式上调(图1的F和1的H)。

因此，这些结果表明Olaparib治疗导致携带野生型p53的结直肠癌和乳腺癌细胞中p53信号通路的激活。

实施例2.奥拉帕尼稳定p53通路

使用放线菌酮进行半衰期测定。HCT116p53+/+和Cal51细胞用10μM奥拉帕尼处理12小时，然后在收获前的不同时间点向培养基中加入放线菌酮，在相同的时间点收获细胞并通过免疫印迹分析测定p53的水平，并用微管蛋白表达做对照对条带进行量化和标准化。

结果发现Olaparib确实通过延长其在HCT116p53+/+(图2的A和的2B)和Cal51细胞系(图2的C和图2的D)中的蛋白质半衰期来稳定p53。

因此，这些结果表明Olaparib在不同类型的癌细胞中稳定p53。

实施例3.Olaparib治疗通过抑制Pre-rRNA合成来抑制核糖体RNA生物合成和核仁应激

Cal51和HCT116p53+/+细胞用或不用10μM奥拉帕尼处理12小时。通过琼脂糖凝胶电泳分析5S、18S和28S rRNA的表达。结果如图3的A和B所示，Olaparib处理抑制HCT116p53+/+(图3的A、B)和Cal51(图3的C、D)中包括28S、18S和5S RNA在内的核糖体RNA的表达。

进一步设计了两种引物(96-bp pre-rRNA(图3的E)：从18SrRNA到内部转录序列1的片段；112-bp pre-rRNA：包括5'-外部转录序列(ETS)和18S rRNA)的片段，用于检测pre-rRNA的表达。

qRT-PCR结果表明Olaparib通过抑制RNA前体合成来降低核糖体RNA的表达(图3的F、G)。

综上所述，所有这些结果表明，奥拉帕尼治疗通过抑制RNA前体合成来降低核糖体RNA水平，从而引发核仁应激。

实施例4.敲低RPL5或RPL11抑制Olaparib诱导的p53激活

确定核仁应激是抑制Olaparib中p53激活的重要调节因子后(图3)，接下来试图探索抑制核仁应激是否可以破坏Olaparib在结肠直肠癌细胞和乳腺癌细胞中引起的p53激活。

已经表明，核仁被破坏，随后核糖体蛋白在核仁压力下从核仁中释放出来。因此，我们提出这种效应也会发生在Olaparib治疗中。为了验证这一假设，我们检查siRNA敲低其表达是否会增加Olaparib治疗后HCT116p53+/+和Cal51细胞中的p53水平和活性。

具体地，HCT116p53+/+和Cal51细胞在有或没有scramble(作为对照)和RPL5siRNA、RPL11 siRNA的情况下转染24小时，然后在收获前将细胞用或不使用10μM奥拉帕尼再处理24小时。免疫印迹(IB)分析p53、p21和RPL5的表达。

如图4所示，与对照细胞相比，用siRNA敲低RPL5(图4的A)或RPL11(图4的C)显著抑制了Olaparib诱导的HCT116p53+/+细胞中p53和p21的水平。

一致地，在乳腺癌细胞Cal51中发现了相同的效果(图4的B和D)。

这些结果表明RPL5和RPL11对于Olaparib在不同癌细胞类型中对于诱导p53通路激活至关重要。

为了进一步证实RPL5和RPL11在Olaparib激活p53中的作用，用Olaparib处理细胞并收获细胞裂解物，然后使用MDM2(其是p53活性的主要调节剂)抗体通过共免疫沉淀实验。研究结果表明，在结直肠癌细胞中，Olaparib增强了RPL5(图5的A)、RPL11(图5的B)和MDM2之间的相互作用。

这些结果共同表明，Olaparib触发p53激活需要RPL5或RPL11，部分原因是通过破坏MDM2-p53相互作用实现的。

实施例5.奥拉帕尼以p53依赖性方式抑制癌细胞增殖

鉴于Olaparib对p53活化的抑制作用及p53参与细胞周期停滞和细胞凋亡。接下来，实验验证Olaparib是否抑制癌细胞增殖。在Cal51和HCT116中使用CCK-8进行了细胞活力测定结果显示，如图6的A和B所示，Olaparib处理以剂量依赖性方式抑制含有野生型p53的Cal51(图6的A)和HCT116p53+/+(图6的B)的增殖。

此外，结果还表明，Olaparib在HCT116p53+/+细胞中的最低抑制浓度为5μM，这与之前的结果一致，表明p53激活的最低激活浓度(图1)。

此外，流式细胞术分析结果表明Olaparib显著促进Cal51和HCT116p53+/+细胞的凋亡(图6的C、D、E和F)。Cal51(图6的D)和HCT116p53+/+细胞(图6的F)的凋亡率分别增加了约6倍和3倍。

更有趣的是，细胞活力分析还表明Olaparib抑制了少量HCT116p53-/-的增殖，HCT116p53-/-是不含p53细胞系。换句话说，与野生型p53相比，它对Olaparib的反应不太敏感。

一致地，Olaparib几乎不能促进HCT116 p53-/-的细胞凋亡(图6的E下图和图6的F)。

总之，结果表明Olaparib促进细胞凋亡并抑制细胞增殖依赖野生型p53。

讨论

肿瘤抑制蛋白p53通过调节不同下游因子的表达响应DNA损伤，在肿瘤发生中起着至关重要的作用。2014年和2018年，第一个PARP抑制剂Olaparib分别被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于含有胚系BRCA1/2突变的晚期卵巢癌和乳腺癌患者治疗。在本发明中，观察到PARPi Olaparib处理以剂量和时间依赖性方式诱导p53及其下游靶基因的表达(图1)，Olaparib通过延长p53的半衰期来稳定p53蛋白(图2)。此外，发现Olaparib通过抑制包括28S、18S和5S RNA在内的核糖体RNA的生物合成来触发核仁应激(图3)。从机制上讲，奥拉帕尼通过抑制rRNA前体的生物合成来抑制所有这些rRNA的产生，但不影响rRNA加工(图3)。随后，活化的核仁应激增强了RPL5或RPL11与MDM2之间的相互作用(图5)。一致地，siRNA对RPL5和RPL11的敲低抑制了Olaparib诱导的p53和下游基因的表达(图4)。更重要的是，奥拉帕尼通过激活p53来抑制乳腺癌和结直肠癌细胞的存活和增殖(图6)。综上所述，本发明揭示了核仁应激-RPs-p53轴在引起对PARPi的抗性方面的未被重视的作用，并为PARPi提供了一个新的有希望的靶标(图7)。

PARP失调与致癌作用密切相关。已经表明PARP-1在各种癌细胞系中显著上调，包括神经母细胞瘤、乳腺癌、白血病、结肠直肠癌细胞等。尽管PARPi Oalparib已被批准用于治疗携带BRCA1/2突变的患者并显示可改善患者的无进展生存期(PFS)，但治疗过程中不可避免的耐药性仍然是一个巨大的挑战。

在此本发明揭示了Olaparib通过延长p53的半衰期直接激活p53及其下游基因的表达，至少在部分结直肠和乳腺癌细胞系中(图1和图2)。此外，发明人还发现HCT116p53+/+对Olaparib比HCT116p53-/-更敏感，如细胞活力和细胞凋亡测定所示(图6)。这表明p53有利于Olaparib治疗并可能降低Olaparib耐药性。本发明结果表明，奥拉帕尼通过抑制28S、18S和5S RNA合成来刺激核仁应激(图2)。敲低核糖体蛋白RPL5和RPL11减弱了Olaparib对p53的激活(图4)。机制研究表明奥拉帕尼稳定p53蛋白并增强RPL5或RPL11与MDM2之间的相互作用(图2和5)。此外，Olaparib通过诱导细胞凋亡在体外抑制携带野生型p53的结直肠癌细胞和乳腺癌细胞的存活和增殖(图2)，而它对不含p53的癌细胞的生长仅具有轻微影响。本发明研究首先在这里证明了Olaparib通过诱导核仁应激来稳定p53活性，进而导致MDM2和核糖体蛋白的竞争性结合，从而激活p53活性。本发明所有的结果表明了不含p53的恶性肿瘤对PARP抑制剂的耐药性的一个潜在分子机制，也为使用核仁应激-RPs-p53轴为对Olaparib耐药的癌症提供了有希望的治疗靶点。

总而言之，Olaparib已批准用于晚期卵巢癌和携带BRCA突变的侵袭性乳腺癌。本发明表明，核仁应激-RPs-p53轴对于抑制野生型p53癌细胞的增殖至关重要，可以作为PARPi Olaparib治疗此类癌症的潜在治疗靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。