血管源性BACE1作为脑小血管损伤相关疾病的治疗靶点的用途

摘要

本发明涉及血管源性BACE1作为脑小血管损伤相关疾病的治疗靶点的用途。具体涉及使β分泌酶(BACE1)基因表达水平降低的物质和/或BACE1蛋白的酶活抑制剂在制备治疗或缓解脑血管病的药物中的用途，其中，所述脑小血管损伤相关疾病优选为阿尔茨海默病、淀粉样脑小血管病以及血管性痴呆。发明人发现BACE1含量的升高会剪切紧密连接蛋白Occludin，从而造成血管内皮细胞间的紧密连接蛋白降解与丢失，造成血脑屏障结构与功能破坏，最终导致脑微出血和认知功能障碍等脑小血管损伤相关疾病病理表型；对BACE1酶活的抑制能够改善这些脑小血管损伤相关疾病病理表型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及血管源性BACE1作为脑小血管疾病的治疗靶点的用途。

背景技术

脑血管病以高发病率、高致残率、高死亡率及高复发率的四高特征，已经成为严重危害人类健康的第一大疾病。而脑小血管病作为脑血管病的重要组成部分也引起了科研和医疗工作者的重视脑小血管损伤相关疾病是一类基于神经解剖上的血管性疾病的总称，是指脑的小动脉、穿支动脉、毛细血管及小静脉的各种病变所导致的临床、认知、影像学及病理表现的综合征。脑小血管损伤相关疾病存在于临床多种疾病，如阿尔茨海默病、淀粉样脑小血管病、血管性痴呆等。

脑小血管损伤相关疾病的发病机制至今仍未清晰，与脑小血管损伤相关疾病相关的核心脑损伤机制通常被认为是脑缺血，或结构或功能性导致的小动脉狭窄或闭塞。然而，小动脉闭塞可能是脑小血管损伤相关疾病的晚期结果，不能解释早期病理改变。部分学者认为内皮功能障碍和血脑屏障破坏可能是脑小血管损伤相关疾病早期的病理生理变化。研究表明内皮损伤导致血管通透性增加，血管内成分渗透到血管壁及血管周围组织，引起血管壁的损伤及炎症反应，造成脱髓鞘，胶质瘢痕，血管壁增生硬化变厚等病理变化，到后期管腔变窄闭塞，脑小血管病小动脉迂曲度增加，动脉硬化，动脉节段性结构不良，血管数目或密度减少，最终形成脑小血管损伤相关疾病。

哺乳动物中枢神经系统功能的维持和运行，依赖于血脑屏障(Blood brainbarrier，BBB)结构和功能的完整性。作为外源性物质进入中枢神经系统的第一道屏障，血脑屏障可以有效阻挡血液里的毒性物质进入脑组织，为中枢神经系统功能正常发挥起重要作用。作为中枢神经系统的重要解剖结构基础，它的形成和结构稳定性是维持脑内神经细胞良好生存环境的主要保障。血脑屏障结构主要包括：1)无窗孔的脑微血管内皮细胞(Brain microvessel endothelia cell BMEC)及细胞间的紧密连接(TJs)，以上二者构成血脑屏障的第1道屏障；2)酶屏障(由脑微血管内皮细胞细胞外连接的基底膜以及由核苷酸酶及一些非特异性胆碱酯酶等物质构成)，构成BBB的第2道屏障；3)基底膜分布着星型胶质细胞，其终足构成血脑屏障的第3道屏障。

紧密连接(TJs)是维持BBB基本结构和功能完整性的物质基础。TJs是一个由多种蛋白质组成的蛋白复合体，包括跨膜蛋白、胞质附着蛋白、连接黏附分子和细胞骨架蛋白。其中跨膜蛋白有Occludins和内皮细胞上的Claudins族；这些跨膜蛋白通过胞质附着蛋白ZO-1/ZO-2/ZO-3与细胞骨架相连。这些紧密连接分子元件彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合、促使胞膜局部融合进而形成电镜下紧密连接所表现的复杂三维网状超微结构。Occludin是细胞间TJs的主要组成部分，内皮细胞通过Occludin封闭细胞间隙，并与ZO-1等紧密连接相关蛋白共同组成TJs的基础结构。紧密连接的断裂与Occludin丝氨酸和苏氨酸残基的脱磷酸化相关，Occludin的缺失导致细胞骨架的破坏以及细胞突起的减少。这些现象提示Occludin在维持血脑屏障结构和功能的完整方面具有至关重要的作用。

BACE1(β-site APP cleaving enzyme，β分泌酶)属于天冬氨酸蛋白酶家族，BACE1主要存在于神经细胞上，与胃蛋白酶等典型天冬氨酸蛋白酶一样，具有大量β片层结构，以两个相互靠近的关键天冬氨酸催化残基对底物肽链进行剪切。目前发现BACE1的底物包括淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)，神经调节蛋白1(Neuregulin-1)等，BACE1的底物参与到许多病理进程，是非常重要的疾病治疗靶点。例如在阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease，AD)病理过程中，神经炎性斑块主要由β淀粉样蛋白(Aβ)形成，它是由BACE1和γ-分泌酶(γ-secretase)连续剪切APP产生，而BACE1被认为是这一过程中的限速酶，因此BACE1抑制剂被认为可以用来治疗AD。

BACE1与多种脑疾病相关，除了AD外，有研究表明在一类脑血管疾病-大脑淀粉样血管病变(CAA)病人中也出现脑内BACE1的表达水平上升，同时出现内皮细胞紧密连接蛋白水平表达下降的的现象，并伴有脑出血等血脑屏障损伤相关的病理表型。更进一步，有研究表明血管细胞也表达BACE1，同时血管风险因素例如炎症和氧化应激等因素都会造成BACE1的表达上升。因此以上证据都提示BACE1可以作为血管风险因素的下游效应靶点，作用于脑内血管的内皮细胞，破坏血管内皮细胞紧密连接结构从而影响大脑血脑屏障功能最终对脑小血管损伤相关疾病进程产生影响。

截止目前，尚未有研究结果证实BACE1可以作为脑小血管损伤相关疾病的治疗靶点，且寻找一种通过选择性调控BACE1基因或蛋白的药物对于脑小血管损伤相关疾病的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明为解决现有技术中的不足，本发明的发明人经过多年研究发现血管源性BACE1可以特异性剪切紧密连接蛋白Occludin，BACE1表达水平的升高会剪切紧密连接蛋白Occludin，从而造成内皮细胞本身以及内皮细胞间的紧密连接损伤及丢失，造成血管损伤和血脑屏障功能破坏，最终导致脑出血和认知功能障碍等脑小血管损伤相关疾病病理表型；同时，对BACE1酶活的抑制能够改善这些脑小血管损伤相关疾病病理表型；而BACE1表达水平的降低则会缓解紧密连接蛋白Occludin结构的破坏，从而缓解血管损伤和血脑屏障功能破坏。因此，BACE1是一个潜在的治疗或缓解脑血管病的新靶点。本发明的发明人在此基础上完成了本发明。

为此，本发明第一方面提供使β分泌酶(BACE1)基因表达水平降低的物质和/或BACE1蛋白的酶活抑制剂在制备治疗或缓解脑血管病的药物中的用途。

在本发明的一些实施方式中，所述脑小血管损伤相关疾病主要为阿尔茨海默病、淀粉样脑小血管病以及血管性痴呆。

在本发明的另一些实施方式中，所述药物包括活性成分，所述活性成分为使BACE1基因表达水平降低的物质和/或BACE1蛋白的酶活抑制剂。

在本发明的一些实施方式中，所述使BACE1基因表达水平降低的物质包括BACE1基因的特异性转录抑制剂。

在本发明的一些实施方式中，所述BACE1基因的特异性转录抑制剂是指特异性抑制BACE1基因的转录过程的抑制剂，其通过抑制BACE1基因的转录从而降低患者体内BACE1基因的表达水平以及BACE1蛋白的水平，缓解其对紧密连接蛋白Occludin的剪切作用，例如靶向BACE1基因的RNAi片段或siRNA片段，或促进BACE1信使RNA降解的CRISPR gRNA。

在本发明的另一些实施方式中，所述BACE1蛋白的抑制剂可以为C3(CAS 797035-11-1)或MK-8931(CAS 1286770-55-5)等本领域技术人员已知的BACE1蛋白的抑制剂。

本发明第二方面提供治疗或缓解脑小血管损伤相关疾病的药物，其中，所述药物包括活性成分所述活性成分为使BACE1基因表达水平降低的物质和/或BACE1蛋白的酶活抑制剂。

在本发明的一些实施方式中，所述使BACE1基因表达水平降低的物质包括BACE1基因的特异性转录抑制剂，例如靶向BACE1基因的RNAi片段或siRNA片段，或促进BACE1信使RNA降解的CRISPR gRNA。

在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体，所述“药学上可接受的载体”通常在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚(乙烯基吡咯烷酮)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子，诸如钠；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。

本发明第三方面提供治疗或缓解脑小血管损伤相关疾病的试剂或试剂盒，其中，所述试剂或试剂盒包括使BACE1基因表达水平降低的物质和/或BACE1蛋白的酶活抑制剂。

在本发明的一些实施方式中，所述使BACE1基因表达水平降低的物质包括BACE1基因的特异性转录抑制剂，例如靶向BACE1基因的RNAi片段和/或siRNA片段。

在本发明的一些实施方式中，所述BACE1蛋白的酶活抑制剂是C3(CAS 797035-11-1)或MK-8931(CAS 1286770-55-5)。

发明人研究发现BACE1蛋白表达水平的升高可以特异性剪切紧密连接蛋白Occludin，造成血管内皮细胞间的紧密连接结构损伤和丢失。本发明还进一步提供了血管内皮细胞特异性过表达BACE1蛋白的动物模型。进一步地，所述动物模型出现脑内血管内皮细胞和紧密连接结构损伤和丢失、血脑屏障损伤、脑微出血和学习行为认知功能障碍等脑小血管损伤相关病理表型。BACE1可以特异性剪切紧密连接蛋白Occludin，从而破坏紧密连接结构，造成血管损伤和血管屏障破坏，最终形成脑小血管损伤相关疾病相关的病理表型；而BACE1表达量的减低或对其酶活的抑制则会缓解血管损伤。因此BACE1可以作为治疗脑小血管损伤相关疾病的治疗靶点。

附图说明

以下将结合附图具体说明本发明

图1：BACE1特异性剪切Occludin产生N端和C端片段的Western blot结果图以及其半定量分析图(共7次重复实验，左图展示其中的1次实验)；

图2：不同浓度HA-BACE1剪切Occludin的Western blot结果图以及其半定量分析图(共7次重复实验，左图展示其中的1次实验)；

图3：不同浓度BACE1抑制剂C3抑制HA-BACE1剪切Occludin的Western blot结果图以及其半定量分析图(共7次重复实验，左图展示其中的1次实验)；

图4：si-BACE1抑制BACE1剪切Occludin的Western blot结果图以及其半定量分析图(7次重复实验，左图展示其中的3次重复实验)；

图5：CRISPR-Cas9 BACE1 KO(knockout)细胞内剪切Occludin的Western blot结果图以及其半定量分析图(12次重复实验，左图展示其中的2次重复实验)；

图6：检测BACE1 KO小鼠脑内Occludin表达水平的Western blot结果图以及其半定量分析图(8次重复实验，左图展示其中的3次重复实验)；

图7：BACE1剪切不同突变序列的Occludin的Western blot结果图(3次重复实验)，其中图A为BACE1剪切4个单点突变的Occludin(L87G，A88G，W89G，D90G)的WB结果图，其中图B-C为BACE1剪切2个双点突变的Occludin(L87G/A88G，W89G/D90G)的WB结果图，其中图D为BACE1剪切缺失突变的Occludin(87-90缺失突变)的WB结果图；

图8：BACE1剪切HUVEC细胞内源性Occludin和影响其他内源性紧密连接蛋白的Western blot结果图；

图9：不同BACE1浓度影响体外内皮细胞渗透率(6次重复实验)；

图10：si-occludin影响BACE1对其他紧密连接蛋白作用的Western blot结果图；

图11：溶酶体抑制剂A1影响BACE1对其他紧密连接蛋白的作用的Western blot结果图；

图12：紧密连接蛋白(Claudin-1，ZO-1)与溶酶体EEA1以及自噬体LC3的共定位结果图(用箭头指示的点)；

图13：WT小鼠和VE-BACE1小鼠各组织BACE1表达水平的Western blot结果图；

图14：WT小鼠和VE-BACE1小鼠血管内皮细胞分别与BACE1共定位染色结果图；

图15：WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内紧密连接蛋白表达水平的Western blot结果图(3次重复实验)；

图16：检测WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内血管紧密连接蛋白表达水平的免疫荧光图像；

图17：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑免疫内皮细胞的免疫荧光图像(内皮细胞标记物CD31)；

图18：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑内皮损伤的免疫荧光图像(内皮损伤标记物caveolin-1)；

图19：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑星形胶质细胞的终足的免疫荧光图像(星形胶质细胞的终足标记物AQP4)；

图20：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑免疫荧光图像(周细胞标记物Desmin)；

图21：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑所有血管免疫荧光图像(基底膜标记物Laminin)；

图22：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑所有血管免疫荧光图像(周细胞标记物PDGFRβ)；

图23：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑血管平滑肌细胞的免疫荧光图像(血管平滑肌细胞标记物SMA)；

图24：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑小动脉和小静脉的免疫荧光图像(动脉和小静脉标记物vWF)；

图25：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑小静脉和毛细血管的免疫荧光图像(小静脉和毛细血管标记物MCT1)；

图26：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑静脉的免疫荧光图像(标记物VCAM-1)；

图27：WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内纤维蛋白(原)含量的Western blot结果图及其半定量分析图(7～12次重复实验，左图展示其中的3次重复实验)；

图28：WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内纤维蛋白(原)免疫组化染色图；

图29：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑免疫组化染色图(GFAP标记星型胶质细胞)

图30：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑小胶质细胞的免疫组化染色图(iba-1标记小胶质细胞)；

图31：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑神经元的免疫组化染色图(Nuen标记神经元)；

图32：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑突触前免疫组化染色图(SNAP25突触前标记物)；

图33：WT小鼠和VE-BACE1小鼠大脑突触后免疫组化染色图(PSD-95突触后标记物)；

图34：检测VE-BACE1小鼠血脑屏障渗透率实验结果图(6次重复实验)；

图35：检测VE-BACE1小鼠大脑普鲁士蓝染色实验结果定量分析图(4次重复实验)；

图36：VE-BACE1小鼠巴恩斯迷宫实验结果图(每组11只同龄小鼠，分别为训练时找到洞口的时间(上图)，第五天(中图)以及第12天(下图)找到洞口的时间)；

图37：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO三个月后，WB检测脑血管上紧密连接蛋白水平的变化(图中所示为其中3次重复实验)；

图38：服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO三个月后，WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内紧密连接蛋白Occludin FL含量的Western blot半定量分析图(6次重复实验)；

图39：服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO三个月后，WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内紧密连接蛋白Occludin CTF含量的Western blot半定量分析图(6次重复实验)；

图40：服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO三个月后，WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内紧密连接蛋白ZO-1含量的Western blot半定量分析图(6次重复实验)；

图41：服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO三个月后，WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内紧密连接蛋白JAM-A含量的Western blot半定量分析图(6次重复实验)；

图42：服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO三个月后，WT小鼠和VE-BACE1小鼠脑内紧密连接蛋白Clauin-1含量的Western blot半定量分析图(6次重复实验)；

图43：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO时进行旷场实验的总运动距离的结果图(每组10只同龄小鼠)；

图44：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO时进行旷场实验的反映焦虑情绪的结果图(每组10只同龄小鼠)；

图45：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO时进行Spontaneous Y-迷宫实验的进臂总次数的结果图(左图)和其中正确进入顺序的占比的结果图(右图)(每组10只同龄小鼠)；

图46：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg体重的BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO时进行新物体识别实验的结果图(每组10只同龄小鼠)；

图47：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg体重的BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO时进行巴恩斯迷宫实验第5天反映短期记忆的结果图(每组10只同龄小鼠)；

图48：WT小鼠和VE-BACE1小鼠在服用1.5mg/kg体重的BACE1酶活抑制剂MK-8931或DMSO时进行巴恩斯迷宫实验第12天反映长期记忆的结果图(每组10只同龄小鼠)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例说明本发明的技术方案。然而，这些实施例仅用于举例说明的目的，并不意味着本发明的范围限于此。

下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：BACE1特异性剪切Occludin。

1.BACE1特异性剪切Occludin的实验过程

为探索人BACE1与人Occludin之间的关系，构建了稳定转染HA-BACE1和Flag-Occludin-Myc质粒两者的HEK293细胞，用蛋白质免疫印迹法(Western blot)技术检测Occludin的全长、N端和C端的变化情况(参见图1)。同时，通过在所述稳定转染了HA-BACE1和Flag-Occludin-Myc质粒两者的HEK293细胞中转染不同浓度的HA-BACE1质粒以及加入不同浓度的BACE1抑制剂C3进一步用Western blot技术检测Occludin的N端和C端的变化情况(参见图2和3)。另一方面，利用siRNA和CRISPR-Cas9技术分别构建了稳定的BACE1敲低(knockdown)和敲除(KO，knockout)细胞系，在此细胞系里转染Flag-Occludin-Myc质粒，用Western blot技术检测Occludin的N端和C端的变化情况(参见图4和5)。更进一步，构建了稳定遗传的BACE1敲除小鼠(购自Jackson Laboratories)，用Western blot技术检测小鼠脑内的Occludin表达情况。

2.实验材料

BACE1 knockout小鼠从Jackson Laboratories购买；HEK293细胞，细胞培养试剂均购买于GIBICO(Carlsbad，CA)；BACE1抑制剂C3(Merck)；Occludin的cDNAs购买于Addgene；siRNA购买于GenePharma；

抗体如下：

一抗：

anti-Myc tag抗体(Santa Cruz，SC-40/9E10)；

anti-Flag tag抗体(Sigma，F1804)；

anti-Occludin抗体(anti-C-terminal Occludin(269-522aa)抗体(Proteintech，13409-1-AP)；anti-N-terminal Occludin(1-100aa)抗体(Abcam，ab167161))；

anti-GAPDH抗体(MAB374，Millipore)；

二抗：

HRP-抗兔IgG(Jackson Research)；

HRP-抗鼠IgG(Jackson Researc)。

载体：

HA-PKH3(Addgene)

pCMV26(Addgene)

3.具体操作

在本研究中用到的细胞均连续单层培养于含有10％FBS，2mM L-谷氨酸，100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO

(1)利用人源BACE1的cDNA(NM_012104.6)和载体HA-PKH3通过PCR技术扩增得到HA-BACE1质粒(其中BACE1为全长序列)；利用人源Occludin的cDNA(NM_001205254.2)和载体pCMV26通过PCR技术扩增得到Flag-Occludin-Myc质粒(其中Occludin为全长序列)。

(2)利用CRISPR-Cas9技术，针对人源BACE1的基因，得到BACE1 knockout HEK293细胞系。

CRISPR-Cas9 BACE1 knockout sgRNA序列(三个序列混合使用)：

sgBACE1-1：5’-GGATCCGGAGCCCGCTACAT-3’(SEQ ID NO：1)；

sgBACE1-2：5’-CGGGCTCTTCGTCGGTCTCC-3’(SEQ ID NO：2)；

sgBACE1-3：5’-TACTACGTGGAGATGACCGT-3’(SEQ ID NO：3)。

(3)HEK293细胞共转染HA-vector(即HA-PKH3，空载体，在图中简写为HA)或HA-BACE1和Flag-Occludin-Myc实验：实验分为control组(共转染HA-vector和Flag-Occludin-Myc)和实验组(共转染HA-BACE1和Flag-Occludin-Myc)。

(4)2个6孔板大小的HEK293细胞均先转染2μg Flag-Occludin-Myc，转染24小时后合并传代为6个6孔板大小的HEK293细胞，之后转染HA或不同浓度的HA-BACE1，实验分为六组：

对照(control)组(共转染2μg Flag-Occludin-Myc和2.5μg HA-vector(即HA-PKH3，空载体，在图中简写为HA))，

实验组1(共转染2μg Flag-Occludin-Myc和0.5μg HA-BACE1)，

实验组2(共转染2μg Flag-Occludin-Myc和1.0μg HA-BACE1)，

实验组3(共转染2μg Flag-Occludin-Myc和1.5μg HA-BACE1)，

实验组4(共转染2μg Flag-Occludin-Myc和2.0μg HA-BACE1)，

实验组5(共转染2μg Flag-Occludin-Myc和2.5μg HA-BACE1)。

(5)检测不同浓度BACE1抑制剂C3对BACE1剪切Occludin的影响实验：HEK293细胞(细胞本身表达BACE1蛋白)中转染Flag-Occludin-Myc并加入不同浓度的BACE1抑制剂C3，实验分为五组：control组(转染Flag-Occludin-Myc，加入15μM DMSO(作为C3的空白对照)处理4小时)，实验组1(转染Flag-Occludin-Myc，加入5μM C3处理4小时)，实验组2(转染Flag-Occludin-Myc，加入10μM C3处理4小时)，实验组3(转染Flag-Occludin-Myc，加入15μM C3处理4小时)。

(6)检测si-BACE1对BACE1剪切Occludin的影响实验：HEK293细胞转染Flag-Occludin-Myc，加入siRNA，实验分为两组：对照(control)组(转染Flag-Occludin-Myc，加入si-control)，实验组(转染Flag-Occludin-Myc，加入si-BACE1)。

其中si-BACE1序列为：

si-BACE1：5’-CCCAAGACGACTGTTACAATT-3’(SEQ ID NO：4)；

si-control对照序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’SEQ ID NO：5(将上述siRNA-BACE1的寡核苷酸序列随机打乱即可得到)。

(7)CRISPR-Cas9 BACE1 knockout HEK293细胞转染Flag-Occludin-Myc实验：实验分为两组：对照(control)组(WT HEK293细胞转染Flag-Occludin-Myc)，实验组(CRISPR-Cas9 BACE1 knockout HEK293细胞转染Flag-Occludin-Myc)。

(8)检测BACE1 KO小鼠脑内的Occludin表达情况实验：BACE KO小鼠戊巴比妥钠麻醉后，1×PBS灌流，用手术器械完整取出大脑，置于-80℃保存。

以上细胞样品用细胞裂解液(1％Nonidet P-40，0.5％去氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)，1M Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5，蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche))裂解收集；于常温裂解细胞，然后加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液。沸水中煮样10分钟制成SDS电泳样品。

以上BACE1 KO小鼠脑组织取适量样品用细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％NonidetP-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)中，在冰上用杜恩斯组织匀浆器研磨，超声处理4分钟，4℃下160000g离心30分钟。

用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测Occludin-FL(Occludin全长)、Occludin-CTF(Occludin的C端片段)和Occludin-NTF(Occludin的N端片段)的变化情况。

蛋白免疫印迹法操作方法：

SDS-PAGE电泳：根据所需蛋白的大小配制合适浓度的SDS电泳凝胶，待测样品等量上样后进行电泳分离(上层浓缩胶恒压90伏特，下层分离胶恒压120伏特)；

转膜：SDS-PAGE电泳完成后进行转膜(PVDF膜用甲醇激活后使用)，240安培恒流按蛋白大小转膜不同时间(90-180分钟)，转膜过程在冰水浴中进行；

封闭：转膜完成后，将载有蛋白的膜置于TBST缓冲液配置的5％脱脂牛奶中，摇床室温封闭1小时；

一抗孵育：根据蛋白抗体的使用说明或预实验结果，配制合适浓度的一抗，封闭后的转移膜室温孵育室温3小时加4℃过夜；

洗涤一抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟；

二抗孵育：用一抗相对应的二抗室温摇床孵育膜40分钟到1小时；

洗涤二抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟；

显色检验：膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒进行显色检测。

(8)半定量分析：用ImageJ软件分析得到各目的蛋白和其内参含量，并将各目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。

4.结果分析

由图1结果可知，Occludin是BACE1的酶切底物，BACE1特异性剪切Occludin产生N端和C端片段。

由图2结果可见，随着HA-BACE1转染浓度的提高，Occludin NTF和CTF的含量显著增加，且Occludin FL显著减少，说明HA-BACE1转染浓度的升高能够增强其对Occludin的剪切作用。

由图3结果可知，BACE1抑制剂C3的浓度越高，被剪切的Occludin越少，说明不同浓度BACE1抑制剂C3均可抑制HA-BACE1剪切Occludin，且随着BACE1抑制剂C3浓度的提高，其对Occludin的剪切作用减弱。

由图4结果可知，用siRNA的方法降低了BACE1的蛋白表达水平，BACE1对Occludin的剪切作用受到抑制，说明BACE1的蛋白表达水平的降低能够抑制其对Occludin的剪切作用。

由图5结果可知，在CRISPR-Cas9 BACE1 KO的细胞内，BACE1对Occludin的剪切作用均受到抑制。

由图6结果可知，在BACE1 KO小鼠脑内，Occludin的蛋白水平明显上调，而其他紧密连接蛋白ZO-1，JAMA和Claudin-1水平没有显著改变。

实施例2：BACE1酶切Occludin蛋白的位点。

1.实验过程

构建人Occludin中的30个氨基酸连接biotin-的多肽片段

biotin-Occludin

biotin-ACVASTLAWDRGYGTSLLGGSVGYPYGGSG(Occludin

2.实验材料

HEK293细胞，细胞培养试剂均购买于GIBICO(Carlsbad，CA)，细胞培养条件同上；biotin-Occludin

多肽氨基酸序列：bio-ACVASTLAWDRGYGTSLLGGSVGYPYGGSG(SEQ ID NO：6)。

一抗：anti-Myc tag抗体(Santa Cruz，SC-40/9E10)，anti-Flag tag抗体(Sigma，F1804)，anti-Occludin抗体(anti-C-terminal Occludin(269-522aa)抗体(Proteintech，13409-1-AP)；anti-N-terminal Occludin(1-100aa)抗体(Abcam，ab167161))，anti-GAPDH抗体(MAB374，Millipore)；

二抗：HRP-抗兔IgG(Jackson Research)，HRP-抗鼠IgG(Jackson Researc)。

Flag-Occludin-Myc突变序列构建引物：

针对Flag-Occludin-Myc L87G：

LP：5′-GGTGCCTGGGACAGAGGCTAT-3′(SEQ ID NO：7)；

RP：5′-CGTGGAGGCCACACAGGCAAA-3′(SEQ ID NO：8)；

针对Flag-Occludin-Myc A88G

LP：5′-GGGGACAGAGGCTATGGAACTTCC-3′(SEQ ID NO：9)；

RP：5′-GGCAAGCGTGGAGGCC-3′(SEQ ID NO：10)；

针对Flag-Occludin-Myc W89G

LP：5′-GGGGACAGAGGCTATGGAACTTCC-3′(SEQ ID NO：11)；

RP：5′-GGCAAGCGTGGAGGCC-3′(SEQ ID NO：12)；

针对Flag-Occludin-Myc D90G

LP：5′-GGCAGAGGCTATGGAACTTCCCT-3′SEQ ID NO：13)；

RP：5′-CCAGGCAAGCGTGGAGGCC-3′SEQ ID NO：14)；

针对Flag-Occludin-Myc L87G/A88G

LP：5′-GGCCTCCACGGGTGGCTGGGACAGAG-3′SEQ ID NO：15)；

RP：5′-ACACAGGCAAAGATGGCAATG-3′SEQ ID NO：16)；

针对Flag-Occludin-Myc W89G/D90G

LP：5′-CACGCTTGCCGGGGGCAGAGGCTATG-3′SEQ ID NO：17)；

RP：5′-GAGGCCACACAGGCAAAGATG-3′SEQ ID NO：18)；

针对Flag-Occludin-Myc 87-90缺失

LP：5′-AGAGGCTATGGAACTTCCCTTTTA-3′SEQ ID NO：19)；

RP：5′-CGTGGAGGCCACACAGGCAAA-3′SEQ ID NO：20)。

3.具体操作

(1)LC-MS/LM技术确定BACE1剪切Occludin位点实验：20μg biotin-Occludin

(2)利用Occludin的cDNA和不同引物通过PCR技术扩增得到四个单位点突变Flag-Occludin-Myc(L87G，A88G，W89G，D90G)序列、两个双位点突变Flag-Occludin-Myc(L87G/A88G，W89G/D90G)序列和Flag-Occludin-Myc

(3)检测HEK293细胞内表达的BACEl剪切突变的Occludin实验：将Flag-Occludin-Myc序列或得到的突变的F1ag-Occludin-Myc序列稳定转染到HEK293细胞中，实验分为：control组(转染WT Flag-Occludin-Myc序列)，实验组：转染Flag-Occludin-Myc单位点突变序列(分别转染四个单点突变序列：L87G，A88G，W89G，D90G)，转染Flag-Occludin-Myc双位点突变序列(分别转染两个双位点突变序列：L87G/A88G，W89G/D90G)，以及转染Flag-Occludin-Myc

以上细胞样品用细胞裂解液(1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，1MTris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5，蛋白酶抑制剂cocktail)裂解收集；于常温裂解细胞，然后加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10分钟制成SDS电泳样品。

用Western blot技术检测Occludin-FL、Occludin-CTF和Occludin-NTF的变化情况：蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1。

4.结果分析

图7结果表明Flag-Occludin-Myc

实施例3：BACE1剪切人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的内源性Occludin，同时促进其他紧密连接蛋白的降解。

1.实验过程

HUVEC细胞系能够产生内源性Occludin、Claudin-1、JAMA和ZO-1，所以发明人构建稳定转染HA-BACE1的HUVEC细胞系，应用Western blot技术检测紧密连接蛋白Claudin-1、JAMA和ZO-1的变化，我们发现这三种紧密连接蛋白水平都出现显著下降。随后，应用体外内皮细胞渗透率检测实验，我们发现BACE1降低了紧密连接蛋白的量同时也破坏了紧密连接结构。更进一步地，利用siRNA技术构建了稳定转染BACE1的Occludin knockdown的HUVEC细胞系，我们发现在此细胞系中未出现紧密连接蛋白Claudin-1，JAMA和ZO-1的含量下降，确认BACE1剪切Occludin蛋白直接影响到其他三种紧密连接蛋白和紧密连接结构。最后，应用免疫荧光技术标记了溶酶体和自噬体，我们发现溶酶体抑制剂A1可以抑制由BACE1剪切Occludin引起的紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1的降解，同时这两种蛋白与溶酶体和自噬体的标记物EEA1和LC3在共聚焦显微镜下共定位，因此确认BACE1能够剪切内源性Occludin，同时促进紧密连接结构的分解和蛋白的降解，从而影响紧密连接的结构和功能。

2.实验材料

HUVEC细胞，细胞培养试剂均购买于GIBICO(Carlsbad，CA)，C3(Merck)，细胞培养方法同实施例1，转染HUVEC细胞使用Effectene Transfection Reagent Kit(Qiagen)和Lipofectamine 3000(Life Technologies)或Lipofectamine LTX(Life Technologies)，Transwell(Corning，CLS3379-2EA)，溶酶体抑制剂A1(购自CST)，溶酶体标记物EEA1(购自BD Biosciences)，自噬体标记物LC3(购自MBL)。

一抗：anti-Occludin抗体(Proteintech，13409-1-AP)，anti-ZO-1抗体(Invitrogen，61-7300)，anti-JAM-A抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-53624(1H2A9))，anti-Claudin-1抗体(Proteintech，13050-1-AP)，anti-HA tag抗体(MBL，M180-3)，anti-Rab7抗体(CST，9367S)，anti-Rab5抗体(CST，3547S)，anti-GM130抗体(CST，12480S)，anti-LAMP1抗体(CST，9091)，anti-LC3抗体(MBL，M152-3)，anti-EEA1抗体(BDBiosciences，610456)。

二抗：Alexa Fluor568-抗兔IgG(H+L)，Alexa Fluor488-抗小鼠IgG(H+L)，AlexaFluor 405-抗小鼠IgG(H+L)抗体(Life Technologies)；Alexa Fluor 594-抗兔IgG(H+L)，Alexa Fluor 647-抗小鼠IgG(H+L)、F(ab’)2抗体(CST)。

siRNA购自GenePharma，siRNA转染使用Lipofectamine RNAiMAX(LifeTechnologies)，

OccludinsiRNA序列：

si-Occludin：5’-CCGAAUCAUUAUGCACCAATT-3’SEQ ID NO：21)；

si-control序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO：22)(将上述siRNA-Occludin是寡核苷酸序列随机打乱即可得到)。

3.具体操作

(1)利用BACE1的cDNA和载体HA-PKH3和EGFP-N3分别得到HA-BACE1和EGFP-BACE1。

(2)BACE1剪切HUVEC细胞内源性Occludin实验：HUVEC细胞转染HA-vector或HA-BACE1，实验分为四组：HUVEC细胞转染0.3μg HA-vector，0.3μg HA-BACE1，转染0.6μg HA-vector，转染0.6μg HA-BACE1。

以上细胞样品用细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40，0.5％sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)裂解收集；于常温裂解细胞，然后加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10分钟制成SDS电泳样品。用Western blot技术检测Occludin-FL、Occludin-CTF和Occludin-NTF的变化情况：蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1。

(3)体外人脐静脉内皮细胞渗透率检测实验：将HUVEC(2×10

(4)检测si-occludin影响BACE1对其他紧密连接蛋白的作用实验：HUVEC细胞转染EGFP-BACE1以及加入siRNA，实验分为四组：转染EGFP-vector和si-control，转染EGFP-BACE1和si-control，转染EGFP-vector和si-occludin，转染EGFP-BACE1和si-occludin。

以上细胞样品用细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40，0.5％sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)裂解收集；于常温裂解细胞，然后加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10分钟制成SDS电泳样品。

用Western blot技术检测Occludin、Claudin-1、JAMA和ZO-1的变化情况，蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1。

(5)检测溶酶体抑制剂A1影响BACE1对其他紧密连接蛋白的作用实验：HUVEC细胞转染EGFP-BACE1以及加入溶酶体抑制剂A1(终浓度100nM)，实验分为四组：转染EGFP-vector；转染EGFP-vector和加入A1；转染EGFP-BACE1；转染EGFP-BACE1和加入A1。

以上细胞样品用细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40，0.5％sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)裂解收集；于常温裂解细胞，然后加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10分钟制成SDS电泳样品。

用Western blot技术检测Occludin、Claudin-1、JAMA和ZO-1的变化情况，蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1。

(6)免疫荧光实验观察紧密连接蛋白与溶酶体以及自噬体的共定位情况：按照实验的设计处理细胞，用常温的PBS洗细胞3次，每次5分钟；加入4％的多聚甲醛固定细胞15分钟，用PBS洗细胞5次，每次5分钟；用0.25％的Triton-100室温处理细胞30分钟，用3％FBS(溶液为PBS)常温下封闭细胞1小时，吸取封闭液后，按照适宜的比例稀释后的一抗(分别使用各紧密连接抗体，以及anti-EEA1抗体、anti-LC3抗体)溶液，在4度的摇床中过夜，次日吸去一抗；用PBS洗细胞3次，每次5分钟；加入适宜比例稀释的二抗，常温下避光孵育40分钟到1小时，最后吸去二抗溶液PBS洗细胞5次，每次5分钟；之后在荧光显微镜下63倍油镜观察紧密连接蛋白与溶酶体以及自噬体的共定位情况并采集图像。

4.结果分析

由图8结果可知，BACE1也可以特异性剪切HUVEC细胞内源性Occludin，同时造成其他紧密连接蛋白的含量下降。

由图9结果可知，随BACE1浓度的提高，BACE1引起的内皮细胞的渗透率提高，表明BACE1可引起内皮细胞紧密连接结构的损伤。

由图10结果可知，在有Occludin存在下，其他紧密连接蛋白的浓度下降，而敲除了Occludin后，BACE1不被剪切，其他紧密连接蛋白的浓度就没有了显著的下降，说明BACE1不直接剪切其他紧密连接蛋白，通过作用在Occludin上引起其他紧密连接蛋白的含量下降。

由图11结果可知，加入了溶酶体抑制剂A1后BACE1造成的紧密连接蛋白JAMA和Claudin-1的下降被抑制了，表明BACE1引起的JAMA和Claudin-1的含量下降是通过溶酶体降解途径起作用。

由图12结果可知，使用溶酶体抑制剂A1和BACE1后，溶酶体EEA1和自噬体LC3与紧密连接膜蛋白Claudin-1的共定位显著增加，但与胞浆蛋白ZO-1无共定位。结合上述的实验结果，表明BACE1剪切Occludin造成紧密连接结构不稳，引起紧密连接膜蛋白通过溶酶体途径降解，而位于胞质内的ZO-1可能通过其他途径降解，从而使所有紧密连接蛋白含量都下降。

实施例4：构建内皮细胞过表达BACE1的小鼠模型。

1.实验过程

应用转基因技术，以C57BL/6J为背景小鼠，构建在内皮细胞特异性启动子Tie2调控下的BACE1过表达模型小鼠VE-BACE1小鼠(所用载体为5’LTR-Tie2 Promoter-BACE1-WRE-3’Poly A)，所得第一代VE-BACE1小鼠持续与相同背景的C57BL/6J小鼠交配获得稳定在内皮细胞中高表达BACE1的子代，用Western blot和免疫荧光技术验证该动物模型构建成功。VE-BACE1小鼠脑内Occludin蛋白减少，紧密连接蛋白ZO-1、JAMA和Claudin-1相应减少。应用Western blot和免疫荧光技术检测不同年龄段的VE-BACE1小鼠的Occludin蛋白ZO-1、JAMA和Claudin-1的变化情况。我们发现VE-BACE1小鼠脑内Occludin蛋白减少，Occludin-CTF增加，紧密连接蛋白ZO-1，JAMA和Claudin-1减少。

2.实验材料

VE-BACE1小鼠由C57BL/6J背景小鼠通过转基因技术获得，繁殖6代后稳定遗传的转基因小鼠。

一抗：anti-BACE1抗体(CST，5606S)，anti-Occludin抗体(Invitrogen，331594(OC-3F10))，anti-ZO-1抗体(1nvitrogen，61-7300)，anti-JAM-A抗体(SantaCruz，sc-53624(1H2A9))，anti-claudin-1抗体(Abcam，ab15098)，anti-CD31抗体(BD Biosciences，550274)，anti-CD34抗体(Invitrogen，14-0341)。

二抗：Alexa Fluor 594-抗兔IgG(H+L)，F(ab’)2抗体(CST)，Alexa Fluor 568-抗兔IgG(H+L)(Life Technologies)，Alexa Fluor 568-抗小鼠IgG(H+L)(LifeTechnologies)，Alexa Fluor 488-抗大鼠IgG(H+L)抗体(Abcam)。

3.具体操作

(1)Western blot技术检测VE-BACE1小鼠血管过表达BACE1：选取15月龄的VE-BACE1和WT小鼠戊巴比妥钠麻醉后，1×PBS灌流，用手术器械完整取出大脑以及心肝脾肾肌肉外周组织，置于-80℃保存。以上小鼠组织取适量样品用细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)中，在冰上用杜恩斯组织匀浆器研磨，超声处理4分钟，4℃下160000g离心30分钟。

用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测BACE1表达情况，蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1，结果如图13所示。

(2)免疫组化技术检测VE-BACE1小鼠血管过表达BACE1情况：按照实验要求处理15月龄的VE-BACE1和WT小鼠(用血管内皮细胞标志物CD31抗体标记小鼠血管)，小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，使用预冷的1×PBS溶液灌流。用手术器械取出完整的脑组织。4％PFA固定24h，蔗糖梯度脱水后切成30-50μm脑片。用0.5％的Triton-100室温处理细胞30分钟，用3％山羊血清以及1％BSA(溶液为PBS)常温下4℃过夜封闭细胞，次日吸去封闭液后，按照适宜的比例稀释后的一抗溶液，在4摄氏度的摇床中过夜，次日吸去一抗；用PBS洗细胞5次，每次5分钟；加入适宜比例稀释的二抗，常温下避光孵育40分钟到1h，最后吸去二抗溶液PBS洗细胞5次，每次5分钟，之后在共聚焦荧光显微镜下观察并采集图像，如图14所示。CD31和CD34是血管内皮细胞标志物。

(3)Western blot技术检测VE-BACE1小鼠紧密连接蛋白表达水平：选取不同年龄段(9，15及21月龄)的VE-BACE1和WT小鼠戊巴比妥钠麻醉后，1×PBS灌流，用手术器械完整取出大脑，置于-80℃保存。以上小鼠脑组织取适量样品用细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)中，在冰上用杜恩斯组织匀浆器研磨，超声处理4分钟，4℃下160000g离心30分钟。

用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测Occludin，ZO-1，JAMA和Claudin-1表达情况，蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1，结果如图15所示。

(4)免疫组化技术检测VE-BACE1小鼠血管紧密连接蛋白表达水平：按照实验要求处理21月龄的VE-BACE1和WT小鼠，小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，使用预冷的1×PBS溶液灌流。用手术器械取出完整的脑组织。4％PFA固定24h，蔗糖梯度脱水后切成30-50μm脑片。用0.5％的Triton-100室温处理细胞30分钟，用3％山羊血清以及1％BSA(溶液为PBS)常温下4℃过夜封闭细胞，次日吸去封闭液后，按照适宜的比例稀释后的一抗溶液，在4度的摇床中过夜，次日吸去一抗；用PBS洗细胞5次，每次5分钟；加入适宜比例稀释的二抗，常温下避光孵育40分钟到1h，最后吸去二抗溶液PBS洗细胞5次，每次5分钟；之后在共聚焦荧光显微镜下观察并采集图像，如图16所示。

4.结果分析

由图13和14结果可知，VE-BACE1小鼠的组织BACE1表达水平显著升高，且免疫组化实验显示BACE1和血管内皮细胞出现完全的共定位，表明构建的VE内皮细胞过表达BACE1的模型鼠构建成功。

由图15和16结果可知，与相同年龄段的野生型小鼠相比，VE-BACE1小鼠脑内的紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1，JAMA和ZO-1蛋白水平下降。

实施例5：VE-BACE1小鼠出现脑血管和神经元-血管(NVU)单元损伤。

1.实验过程

应用免疫组化技术标记血管，用血管内皮细胞标志物CD31抗体标记血管以及观察血管形态，我们发现21月龄VE-BACE1小鼠的脑皮层，纹状体和海马的血管内皮染色出现显著的减少，表明VE-BACE1小鼠出现血管内皮损伤和丢失(见图17)。更进一步的，用免疫组化技术检测caveolin-1(血管内皮损伤时该蛋白水平上升)的表达水平，我们发现caveolin-1的表达水平在VE-BACE1小鼠大脑皮层区域显著上升，再次确认血管内皮损伤(见图18)。同时，用免疫组化技术检测了NVU结构中的星形胶质细胞和周细胞变化情况。首先用AQP4抗体来标记星形胶质细胞的终足的变化情况，我们发现AQP4蛋白水平在VE-BACE1大脑皮层，纹状体和海马区域显著下降(见图19)。其次用Desmin蛋白抗体标记周细胞，我们发现Desmin蛋白水平在VE-BACE1脑内出现显著下降，表明NVU结构出现损伤(见图20)。

2.实验材料

选用VE-BACE1小鼠繁殖6代后稳定遗传的转基因小鼠。

一抗：anti-CD31抗体(BD Biosciences，550274)，anti-CD34抗体(Invitrogen，14-0341)，anti-AQP4抗体(Proteintech，16473-1-AP)，anti-Desmin抗体(Abcam，ab32362)，anti-Caveolin-1抗体(CST，3267S)。

二抗：Alexa Fluor 594-抗兔IgG(H+L)，F(ab’)2抗体(CST)，Alexa Fluor568-抗兔IgG(H+L)(Life Technologies)，Alexa Fluor 568-抗小鼠IgG(H+L)(LifeTechnologies)，Alexa Fluor 488-抗大鼠IgG(H+L)抗体(Abcam)。

3.具体操作

免疫组化技术标记VE-BACE1小鼠大脑血管：具体操作同实施例4。

4.结果分析

以上实验结果(图17-20)表明，VE-BACE1小鼠大脑血管内皮结构丢失和损伤，同时神经元-血管单元的组成结构：星型胶质细胞的终足和周细胞也出现显著的减少和损伤。

实施例6：VE-BACE1小鼠大脑毛细血管和小静脉出现显著退化。

1.实验过程

应用免疫组化技术标记21月龄VE-BACE1小鼠大脑内的不同血管类型，包括动脉，静脉，毛细血管等血管，观察不同类型血管损伤情况。首先用血管基底膜标记物Laminin抗体标记VE-BACE1大脑内的所有血管，以及用壁细胞标记物PDGFRβ抗体标记所有血管，我们发现VE-BACE1小鼠的大血管血管形态和数量与WT小鼠无明显区别，而VE-BACE1小鼠脑内的小血管数量显著降低(图21-22)。更进一步，用SMA蛋白抗体(血管平滑肌细胞标记物)标记脑内动脉，用vWF蛋白抗体(vWF蛋白表达在动脉和小静脉)，MCT1蛋白抗体(MCT1蛋白表达在小静脉和毛细血管)以及VCAM-1蛋白抗体(VCAM-1蛋白主要表达在静脉)分别标记VE-BACE1小鼠脑内血管，我们发现VE-BACE1大脑内的毛细血管和小静脉出现明显减少。表明VE-BACE1小鼠大脑毛细血管和小静脉出现显著退化(图23-26)。

2.实验材料

一抗：anti-Tagln抗体(Proteintech，10493-1-AP)，anti-vWF(Proteintech，11778-1-AP)，anti-VCAM-1(CST，D8U5V)，anti-SMA(Abcam，ab5694)，anti-Laminin抗体(Sigma-Aldrich，L9393)，anti-MCT1抗体(Proteintech，20139-1-AP)，anti-PDGFRβ抗体(BD Biosciences，558821)；

二抗：Alexa Fluor 594-抗兔IgG(H+L)，F(ab’)2抗体(CST)，Alexa Fluor 568-抗兔IgG(H+L)(Life Technologies)，Alexa Fluor 568-抗小鼠IgG(H+L)(LifeTechnologies)，Alexa Fluor 488-抗大鼠IgG(H+L)抗体(Abcam)。

3.具体操作

(1)免疫组化技术标记VE-BACE1小鼠大脑各类血管：具体操作同实施例4。

4.结果分析

以上实验结果(图21-26)表明，VE-BACE1小鼠与WT小鼠相比大脑内大血管(动脉和大静脉)并未出现明显的变化，而小血管(毛细血管和小静脉)显著的数量减少以及损伤，表明VE-BACE1小鼠的脑血管损伤主要集中在小血管上。

实施例7：VE-BACE1小鼠脑内血脑屏障损伤。

1.实验过程

用免疫组化技术和Western blot技术检测VE-BACE1大脑内的纤维蛋白(原)含量，我们发现灌流后的VE-BACE1大脑脑内纤维蛋白(原)含量显著增加，表明VE-BACE1小鼠的血脑屏障出现损伤，使纤维蛋白(原)透过血脑屏障进入脑内(见图27)。同时，应用VE-BACE1小鼠眼眶静脉注射荧光染料Alexa Fluor 555-缀合cadaverine实验检测血脑屏障渗透率，VE-BACE1脑片荧光检测以及脑匀浆荧光检测结果显示VE-BACE1小鼠血脑屏障通透率显著提高，再次表明VE-BACE1小鼠血脑屏障损伤(图28)。更进一步，我们发现VE-BACE1小鼠出现由血脑屏障损伤引起的病理表现，包括脑内炎症，神经突触结构损伤，脑内微出血以及VE-BACE1小鼠的空间学习与记忆能力损伤。应用免疫组化技术检测小胶质细胞和星形胶质细胞的分布和数量，我们发现小胶质细胞(由iba-1标记)(图30)和星形胶质细胞(由GFAP标记)(图29)在血管周围数量上升，表明VE-BACE1小鼠脑内血脑屏障受损促进炎症反应产生。其次应用免疫组化技术标记了神经元(NeuN抗体标记神经元)(图31)，用SNAP25蛋白抗体(突触前标记物)(图32)和PSD95蛋白抗体(突触后标记物)(图33)分布标记突触前和突触后结构。我们发现VE-BACE1小鼠神经元数量(NeuN染色)没有明显变化，但突触结构(SNAP25和PSD95染色)出现减少，表明VE-BACE1小鼠出现突触损伤。应用普鲁士蓝染色实验检测15月和21月的VE-BACE1小鼠脑内微出血情况，我们发现VE-BACE1小鼠脑内出现明显的微出血症状(图34-35)。最后，应用巴恩斯迷宫(Barne mase)行为学实验检测VE-BACE1小鼠的空间学习记忆能力，我们发现VE-BACE1小鼠空间学习和记忆功能出现损伤(图36)。

2.实验材料

一抗：anti-fibrinogen抗体(Abcam，ab34269)，anti-tubulin抗体(Proteintech，66031-1-lg)，anti-GFAP抗体(Millipore，IF03L)，anti-Iba-1抗体(Wako，019-19741)，anti-NeuN抗体(Millipore，MAB377)，anti-SNAP25抗体(Abcam，ab41455)，anti-PSD95抗体(CST，3450S)，cadaverine-Alexa Fluor 555(Life Technologies，A30677)，鲁士蓝染色试剂盒(Solarbio，Cat#G1424)

二抗：Alexa Fluor 594-抗兔IgG(H+L)，F(ab’)2抗体(CST)，Alexa Fluor 568-抗兔IgG(H+L)(Life Technologies)，Alexa Fluor 568-抗小鼠IgG(H+L)(LifeTechnologies)，Alexa Fluor 488-抗大鼠IgG(H+L)抗体(Abcam)。

3.具体操作

(1)用Western blot脑内纤维蛋白(原)含量检测实验：按照实验要求处理15和21个月的VE-BACE1以及对应的WT小鼠，小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，使用预冷的1×PBS溶液灌流。用手术器械取出完整的脑组织。保存于-80℃。整个脑组织1∶30体积加入组织裂解液(1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.5％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail(Roche))。组织在匀浆器中裂成均匀微粒，弃去上清，1∶40体积加入3M尿素溶液后在杜恩斯组织匀浆器匀浆器继续研磨，混合体系在37℃摇动混匀2h，14000xg离心30分钟弃去上清，以1∶40体积加入3M尿素溶液，使用匀浆器继续研磨，65℃摇动混匀30分钟，即获得可进行Western blot的样品。蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1。

(2)免疫组化技术检测脑内纤维蛋白(原)含量实验：免疫组织化学实验同实施例4。

(3)血脑屏障渗透率实验：按照实验要求选择VE-BACE1和WT小鼠用戊巴比妥钠麻醉，麻醉后的小鼠眼眶注射示踪剂0.5mg/ml cadaverine-Alexa Fluor 555，每只小鼠根据体重按25μg/g计算注射的体积。循环2h后，小鼠用1×PBS灌流五分钟，用手术器械完整取出脑组织，分为两个半脑。一半大脑进行称重加入1％Triton X-100的1×PBS溶液，在冰上用匀浆器研磨，随后4℃离心21000xg离心20分钟，取上清于黑色的96孔板中，于酶标仪中检测每个孔液体的吸光度(542nm，572nm)。另一半大脑4％PFA固定24h，蔗糖梯度脱水后切成30-50μm脑片后用组织FACXS系统(Tissue Gnostics)20倍镜下观察并采集图像。

(4)普鲁士蓝染色实验：按照实验要求处理15和21个月的VE-BACE1以及对应的WT小鼠，小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，使用预冷的1×PBS溶液灌流。用手术器械取出完整的脑组织。保存于-80℃。取一侧大脑4％PFA固定24h，蔗糖梯度脱水后矢状切成14-18μm脑片(一侧大脑切180片)，从外侧到内侧，每三片脑片随机选择一片，每个半脑可得到60片脑片。用中性红染色2分钟，然后用普鲁士蓝染色试剂盒在20％盐酸和10％氰化钾水溶液的1∶1溶液中染色。染色后，切片用一系列醇脱水，二甲苯清洗，中性脂封片，使用的组织FACXS系统的20倍观察并采集图像。用ImageJ图像处理系统量化脑片中的蓝色染色点在脑片中所占的面积。

(5)巴恩斯迷宫实验：巴恩斯迷宫由一个白色的圆形平台(直径91厘米)组成，平台高出地面80厘米，有20个沿圆周的等间距洞(直径5厘米)。在目标洞的下方设置了一个黑色的逃生通道。平台上方有四个明亮的灯光，作为一个微弱的厌恶刺激，让老鼠利用放置在房间周围的远端空间线索以寻找目标洞。选取不同年龄段的VE-BACE1和WT小鼠进行以下实验。

1)实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于目标箱内适应3分钟；

2)实验阶段：将动物置于迷宫中央的塑料圆桶内限制活动5秒。移开圆桶，启动计时器。动物四肢均进入目标箱，则计为一次正确寻找到目标洞，并让动物在箱内停留30秒。每一动物一次观察3分钟。在此期间如果动物仍然找不到目标洞，则将动物从迷宫移开，放入目标箱内并停留30s。每天训练四次，连续四天。

从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫随机转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方位。这样做的目的是防止动物依靠气味、而非凭借记忆来确定目标洞的位置。实验记录以下参数：到达目标洞的时间。

3)第5天和第12天分别进行90秒的针对实验，检查小鼠空间记忆和长期记忆。实验记录以下参数：到达目标洞的时间。

4.结果分析

由图27和28结果可知，VE-BACE1小鼠脑内的纤维蛋白(原)含量较WT小鼠显著提高，表明VE-BACE1小鼠的血脑屏障出现损伤，使纤维蛋白(原)透过血脑屏障进入脑内。

由图29和30结果可知，VE-BACE1小鼠脑内的血管周围星型胶质细胞(由GFAP标记)(图29)和小胶质细胞(由iba-1标记)(图30)的水平较WT小鼠显著上升，表明VE-BACE1小鼠的脑内血管周围产生炎症反应。

由图31-33结果可知，VE-BACE1小鼠神经元数量和WT小鼠相比没有明显变化，但VE-BACE1小鼠的突触结构染色结果显示出现减少现象，表明VE-BACE1小鼠出现突触损伤。

由图34结果可知，VE-BACE1小鼠的荧光染料cadaverine渗透过血脑屏障的量较WT小鼠显著提高，且随年龄增加该差异更明显，表明VE-BACE1小鼠血脑屏障渗透率提高，血脑屏障出现损伤，且随年龄增加更加明显。

由图35结果可知，VE-BACE1小鼠在各个脑区的出血情况较WT小鼠显著提高，且随年龄增加该差异更明显，表明VE-BACE1小鼠出现脑内出血的病理特征，且随年龄增加更加明显。

由图36结果可知，VE-BACE1小鼠的空间学习能力以及短时记忆和长时记忆功能较WT小鼠出现下降，表明VE-BACE1小鼠出现空间学习能力和记忆功能的损伤。

实施例8：BACE1抑制剂可以改善VE-BACE1小鼠的学习记忆损伤。

1.实验过程

用多项行为学实验检测VE-BACE1小鼠在经BACE1抑制剂MK-8931处理后学习记忆能力是否有改善。我们发现经1.5mg/kg剂量的BACE1抑制剂MK-8931处理2个月的VE-BACE1小鼠在巴恩斯迷宫，新物体识别和Two trial Y-迷宫实验中，与对照组的未经BACE1抑制剂MK-8931处理的VE-BACE1小鼠相比，其学习记忆能力有显著提升；而与对照组的WT小鼠相比，二者差距减小，说明BACE1抑制剂可以改善VE-BACE1小鼠的学习记忆损伤，有望成为治疗CSVD的新药物。

2.实验材料

BACE1抑制剂MK-8931(Merck)，DMSO(Thermo)。

3.具体操作

(1)小鼠给药处理：15月龄的同窝WT小鼠和VE-BACE1小鼠分别分为两组，一组通过饮水给1.5mg/kg体重的BACE1抑制剂MK-8931，另一组通过饮水给相同剂量和给药方法的DMSO，持续处理2个月

(2)旷场实验：是评价实验动物在新开阔环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。小鼠对新开阔环境会有恐惧情绪，因此主要在周边区域活动，而在中央区域活动较少，但小鼠的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，因而在小鼠活动期间可由此观察小鼠的运动轨迹以及焦虑心理。

1)实验阶段：旷场反应箱内壁涂白，正上方处架一红外线及数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。旷场光照人为设定为小鼠活动的“黑夜”，由一侧墙壁的光源模拟月光照明。实验人员和计算机等设备位于另一房间以减小对动物的干扰。旷场反应箱底面参数为50×50cm的正方形，实验前，用计算机软件将底面划分为25个等面的小正方形方格，包括周边的12个方格以及内部的13个方格。调试好后，将小鼠面朝墙放入4个拐角方格之一，并让其自由探索环境5分钟。由计算机软件识别分析小鼠的总探索运动距离以及每个方格内的探索总时间。

2)分析阶段：计算机软件自动分析出5分钟内每只小鼠的运动距离，数值可评估小鼠的运动能力，运动距离越大，说明小鼠运动能力越强；计算机软件自动分析出每个方格内的探索时间，实验人员计算在周边12个方格内的探索总时间以及花在内部13个方格的总时间，用公式：周边12个方格内的探索总时间/(周边12个方格内的探索总时间+在内部13个方格的总时间)来评估小鼠的焦虑情绪，比值较高，说明小鼠越焦虑。

(3)Spontaneous Y-迷宫实验：Y迷宫由3等长臂组成(50cm×18cm×35cm)，每两个臂之间夹角为120度，在中央处各有一个可移动的隔板，迷宫内臂及底部均涂为白色。

1)实验阶段：将其中一个臂固定为起始臂，每次将小鼠放入起始臂末端使其自由探索5min，用录像设备记录小鼠分别探索3个长臂的顺序。

2)分析阶段：每三个探索顺序视为一个反应次数，期间没有出现重复臂的探索算为一个正确反应，否则视为一个错误反应。计算正确反应的次数/(正确反应的次数+错误反应的次数)*100％，得到的百分比越高，说明小鼠的记忆能力越强。

(4)巴恩斯迷宫实验：操作方法同实施例7。

(5)新物体识别实验：利用小鼠先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法。装置参数为底面50×50cm的正方形，色泽银灰色，四壁高40cm。

1)参与实验的小鼠每天固定的时间段在装置中适应10分钟，共适应3天；

2)实验阶段：将两个相同物体放在一侧壁的左右两端，小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度要一致。在小鼠放入前即开启录像设备，放下小鼠后实验者立即离开测试房间，共10分钟。2小时后，将场地内的其中一个旧物体换作等高等体积但形状不同的新物体，仍将小鼠放置于背向两物体，鼻尖据两物体距离相同的起始位置，观察5min时间，用录像设备记录小鼠与这两个物体接触的情况。

3)分析阶段：记录每只小鼠分别探索新旧物体的时间，计算新物体探索时间/(新物体探索时间+旧物体探索时间)*100％，得到的百分比越高，说明小鼠的记忆能力越强。

(6)Western blot技术检测BACE1抑制剂MK-8931对脑血管紧密连接蛋白水平的影响：做完所有行为学测试后，将所有参与给药实验的18月龄的VE-BACE1和WT小鼠用戊巴比妥钠麻醉，经1×PBS灌流，用手术器械完整取出大脑以及心肝脾肾肌肉外周组织，快速置于-80℃保存。将以上小鼠的左半大脑组织取适量样品放入细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)中，在冰上用杜恩斯组织匀浆器研磨，超声处理4分钟，4℃下160000g离心30分钟。

用蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测BACE1表达情况，蛋白免疫印迹法操作方法同实施例1。

4.结果分析

由附图37-42结果可知，慢性低剂量的MK-8931处理能明显改善VE-BACE1小鼠脑血管紧密连接蛋白尤其是Occludin，JAM-A以及Claudin-1的丢失情况。在行为学方面，由附图43和44结果可知，BACE1抑制剂MK-8931对VE-BACE1小鼠的运动损伤没有恢复作用，对小鼠的焦虑情绪也没有影响，而由附图45-48结果可知，经BACE1抑制剂MK-8931处理后，VE-BACE1小鼠的记忆能力有显著改善。

综上所述，BACE1可以特异性剪切紧密连接蛋白Occludin，并造成其他紧密连接蛋白JAMA，Claudin和ZO-1蛋白的降解，最终导致内皮细胞紧密连接的破坏；基于此发现，构建了血管内皮细胞特异性过表达BACE1的小鼠模型，在此小鼠模型上，验证了VE-BACE1可以造成血管内皮细胞的紧密连接蛋白下降和紧密连接结构的破坏，从而导致血管结构的破坏和血脑屏障的损伤最终引起脑内炎症，脑内NVU的损伤，脑出血和小鼠空间学习和记忆能力的下降。因此BACE1可以作为治疗脑小血管损伤相关疾病的新治疗靶点。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。